Name: biological sample preparation by high-pressure freezing, microwave-assisted contrast enhancement, and minimal resin embedding for volume imaging
Uploaded: 2019-03-19T14:45:00
Duration: 7 min 33 s
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거짓말-SEM와 A.S. (거짓말-SEM 연산자의 위치)는 클러스터의 우수성 및 도이치 가운데 (DFG) 연구 센터 나노 현미경과 분자 생리학의 두뇌 (CNMPB)에 의해 자금을. 우리 연구소의 토마스 뮐러-Reichert 제공에 감사 선 충 C. 샘플. 우리는 영화에 참여 Ulrich Weikert 감사 합니다.

여기에 설명 된 동물에서 샘플을 포함 하 여 모든 실험 고객 보호 및 식품 안전 (LAVES)에 대 한 기관 동물 관리와 낮은 색 소니의 국가 사무실에 의해 승인 되었습니다가지고.
1. 고압 및 동결 대체
<ol><li>마우스 (예를 들어, C57Bl6N, 12 주, 여성)9에서 nervus tibialis 해 부.</li>
	<li>20 %polyvinylpyrrolidone (1g PVP의 5 ml에서)의 작은 물방울에 nervus tibialis 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에 담가 그리고 2 m m 길이 조각을 잘라. 그런 다음, 금속 샘플 캐리어 (타입 A, 0.2 m m 깊이)에 배치 좋은 집게를 사용 하 여. 다른 플랫 캐리어 (B 타입)는 뚜껑으로 hexadecane의 얇은 층으로 코팅을 추가 하 고이 어셈블리를 견본 카트리지 삽입.</li>
	<li>여러 선 충 C. 20% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) m 9에서의 물방울에 전송 ( 재료의 표참조)와 금속 캐리어 (타입 A) 일회용 플라스틱 피 펫. 다음, 두 번째 항공사 (B 타입) 위에 뚜껑으로 추가 하 고 카트리지를 조립.</li>
	<li>두 샘플의 다음과 같이 진행: 고압 고압 냉동 고의 로드 역에서 쓰리 피스 카트리지에 그들을 로드 하 여 샘플 캐리어 어셈블리 하나에 의해 고정. 제조업체의 운영 지침에 따라 프로세스를 누릅니다. 참고: 두 가지 유형의 샘플 이후 동결 대체에서 함께 처리할 수 있습니다.</li>
	<li>아세톤에 냉동된 0.1% 타 닌 산의 2 개 mL를 포함 하는 cryovials에 샘플을 놓습니다. 튜브에 액체 질소를 흘리 고 없이 액체 질소의 목욕에서 전송을 수행 합니다. 이동 자동 동결 대체 단위10 에 cryovials-90 ° C에서 설정 하 고 프로그램을 시작. 참고: 샘플 보관-90 ° C 100 헤 타 닌 산에서 전에 osmification 피복을 오스뮴 tetroxide11의 이해를 높이기 위해 사용 됩니다.</li>
	<li>수동으로 세척 샘플 3 x 고정 대체 단위에서-90 ° C에서의 아세톤 2 mL와 함께 30 분에 대 한.</li>
	<li>2% 오스뮴 tetroxide의 2 ml에서 샘플을 떠나, 자동에 지속적인 얼룩에 아세톤에 0.1 %uranyl 아세테이트 동결 7 h-90 ° c.에 대 한 대체 단위 주의: 오스뮴 tetroxide 독성 연기 후드, 처리 및 보호 장비를 착용 한다. 참고: 동결 대체 단위는 자동으로 온도를-20 ° C에서 5 ° C/h를 발생 시킵니다. 샘플 고정 대체 단위에 16 h-20 ° C에서 보관 됩니다. 온도 4 ° C에서 10 ° C/h에 자동으로 발생 합니다.</li>
	<li>온도 4 ° c.에 도달 했습니다 때 순수한 아세톤과 오스뮴 tetroxide 솔루션을 교환 고정 대체 단위에서 있는 cryovials를 제거 합니다.</li>
</ol>2. 전자 레인지 기반 처리
참고: 모든 실내 온도12 안정 된 온도 유지 하는 온도 제어 장치를 사용 하 여 다음 단계를 수행 ( 재료의 표참조).
<ol><li>전자 레인지에 처리 하는 동안 반응 튜브의 뚜껑 열어 둡니다.</li>
	<li>cryovials에서 금속 샘플 캐리어를가지고 고 시계 유리 접시 (150 ㎜)에 아세톤에 submersed 샘플을 유지 하면서 좋은 집게 나 바늘를 사용 하 여 금속 캐리어에서 샘플을 제거.</li>
	<li>고급 포 셉 또는 한 피 펫을 사용 하 여 2 mL 반응 관에 샘플을 전송 하 고 4 번 40 대 한 아세톤의 1 mL로 씻어 W. 250 s 주의: Thiocarbohydrazide은 독성 연기 후드 처리, 보호 장비를 착용 한다.</li>
	<li>대비 증가 150 W에서 14 분 아세톤에서 1 %thiocarbohydrazide 1 mL와 얼룩. 얼룩을 수행 하려면 반응 관에 thiocarbohydrazide 솔루션을 플라스틱, 튜브는 전자 레인지에 놓고 2 분/2 분에서 14 분을 총 반복에 대 한 150 W의 전력 레벨을 프로그램 (진공 기능 설정)으로 설정 합니다. 전자 렌지를 시작 합니다. 참고: Thiocarbohydrazide 동결 대체 하는 동안 적용 된 오스뮴 tetroxide 반응. 그것은 더 많은 오스뮴 tetroxide 원래 오스뮴 tetroxide 사이트13에 입금 될 수 있도록 다리를 형성 한다.</li>
	<li>워시 샘플 4 x 40에 대 한 아세톤의 1 mL를 피펫으로 반응 관에 아세톤 W. 250 s 튜브는 전자 레인지에 놓고 250 W 40 s. 시작 전자 레인지에 대 한 선택.</li>
	<li>W. 피 펫 150에서 14 분 아세톤에 2% 오스뮴 tetroxide의 1 ml에서 반응 관에 오스뮴 tetroxide 솔루션 얼룩, 전자 레인지에 튜브를 놓고 2 분 동안 프로그램 150 W (진공 기능 설정)의 전력 레벨을 설정 에서/2 분 총 14 분 동안 반복. 전자 렌지를 시작 합니다.</li>
	<li>워시 샘플 4 x 40에 대 한 아세톤의 1 mL 250 W (으로 단계 2.5에서에서) s.</li>
	<li>1 mL 아세톤 수 지의 농도 증가 함께 침투 ( 재료의 표참조)의 25%, 50%, 75%, 90%, 100%, 그리고 3 분 각 250 W. 피 펫 반응 관에 수 지에 대 한 100%, 튜브, 전자 레인지에 놓고 전원 레벨을 설정 하는 프로그램 250 W (진공 기능 설정)와 l 3 분 전자 렌지 시작.</li>
</ol>3. 최소한의 수 지 포함8
<ol><li>이쑤시개와 장소 플라스틱의 조각에 그들 ( 재료의 표참조) 영화 반응 튜브 nervus tibialis와 C. 선 충 을 가져가 라.</li>
	<li>이쑤시개를 사용 하 여 부드럽게 밀어 샘플 플라스틱 필름에 아무 남아 있는 수 지를 감지 때까지. 할로겐 램프를 사용 하 여 난방 ( 재료의 표참조) 수 지 보다 적게 점성 된다 그래서 더 쉽게 제거 될 수 있다. 장소 할로겐 램프 (손이 태워 하지 않도록 주의 되는) 수 지를 열 정도로 닫습니다.</li>
	<li>오븐에 플라스틱 필름 위에 60 ° C에 적어도 48 h에 대 한 샘플 유해</li>
</ol>4입니다. 거짓말-sem의 대 한 준비
<ol><li>Sem의 스텁 피팅 크기에서 면도날을 사용 하 여 플라스틱 필름 함께 polymerized 샘플 잘라내어 전도성 실버 수 지를 사용 하 여 SEM 명세서에 첨부 ( 재료의 표참조). 적어도 4 h 또는 하룻밤 60 ° C에서 다시 유해.</li>
	<li>SEM에 샘플 1 분 35 골드와 스텁 스퍼터 코트 스퍼터 coater를 사용 하 여 mA (백 금/팔라듐을 사용할 수 있습니다, 10 nm 두꺼운 코팅은 충분 한) 거짓말-SEM. 내부 배치</li>
</ol>5. 거짓말-SEM 내부 데이터 수집
<ol><li>현미경을 운전 하는 기본 소프트웨어를 사용 하 여 2 차 전자 검출기와 샘플 이미지 ( 재료의 표참조). 관심 (예: nervus tibialis 또는 C. 선 충의 중간 부분) 영역 보기의 필드에는 샘플 중심 이어야 한다. 참고: 데이터 수집을 수행 하려면 기울기 위치로 단계 있도록 샘플 직면 한 적절 한 작동 거리 (5mm)에 90 ° 각도로 이온 빔 이온 및 전자 빔의 소위 일치 포인트. 우리의 악기를 사용 하 여이 54 °와 5mm 작동 거리 단계 기울기에서 이루어집니다.</li>
	<li>샘플의 정확한 위치를 설정 하려면, 2 차 전자 검출기와 이미징 동안 0 ° 기울기에 일반적인 기능 센터. 천천히 54 ° (5 °, 20 ° 54 °), 기울기 상자 M-축 이동 하 여 동일한 개체를 중앙 맞춤.</li>
	<li>54 °, 기능 거짓말 모드에서 중앙 위치로 이동 하 여 다음에 2 차 전자 검출기와 이미징 동안 기능을 중심으로 일치 점을 찾아. 센터의 표시를 SEM 소프트웨어에 십자선을 표시 하 여이 수행 합니다. 그럼 먼저 이동 샘플링 기능 이미지 영역의 중심을 SEM 소프트웨어의 센터 포인트 기능을 사용 하 여. 그런 다음 z에서 스테이지를 이동 하 여 y 축 따라 기능 센터. 거짓말과 sem의 사이 마지막 오프셋은 SEM 광속 변화 수정 되었습니다.</li>
	<li>고급 소프트웨어를 열고 ( 재료의 표참조) 녹음 3D 데이터 집합 및 따라 단계별 소프트웨어 마법사.</li>
	<li>관심, 예금 탄소 또는 플래티넘의 지역에서 (400 nm) 충전에 의해 유도 된도 밀링 및 아티팩트를 줄일 3 나 전류를 사용 하 여 투자 수익의 위에. 참고: 거짓말 (너비, 높이, 깊이)과 몇 군데 견본 표면에 가공 하는 관심 영역을 그려서, 소프트웨어 계산 하 고 다른 샘플 준비 기능을 밀링할 참호 등 지역에 대 한의 크기를 superimposes 백 금/탄소 증 착입니다. 또한, 신중의 너무 높은 거짓말 해류와 샘플 표면 이미징이 샘플 표면 손상 시킬 수 있습니다. 50 pA의 전류는 이미징에 대 한 충분 합니다.</li>
	<li>집중 된 이온 살을 사용 하 여 관심 (ROI) 현재 15/30 나를 사용 하 여 영역을 노출 하는 트렌치를 밀.</li>
	<li>집중 된 이온 살을 사용 하 여 현재 7 나와 횡단면을 폴란드어.</li>
	<li>샘플 준비를 완료 한 후 다음 이미지 매개 변수를 설정: 거짓말 거짓말 설정 탭 (거짓말 밀링 전류); 매개 변수 밀링 SEM 이미지 설정 탭에 이미지는 SEM AutoTune 탭에서 매개 변수를 튜닝 매개 변수 (자동 초점 및 autostigmation 모든 60 분 50 nm 픽셀 크기, 면만 시간 3, 평균 3 라인). 이 모든 샘플에 대 한 최적화.</li>
	<li>실행 하는 동안 표류 하 블록 얼굴을 일으키는 어떤 열 드리프트를 방지 하려면 인수를 시작 하기 전에 적어도 2 시간에 대 한 공간을 두십시오.</li>
	<li>연속 밀에서 데이터 집합을 수집 하 고 700 펜 실바 니 아 거짓말 현재 모드를 확보. 사용 1.5 k v (분석 모드, 900 V) ESB 얻으려고 400 V의 그리드 전압 검출기 각각 5 nm 픽셀 크기 고급 소프트웨어를 사용 하 여 이미지 ( 재료의 표참조) 및 50 nm 슬라이스 두께. 하나의 이미지 수집 6 µs의 면만 시간이 약 1.5 분 걸립니다.</li>
	<li>데이터 수집을 시작 합니다. 현재 밀링에 거짓말 이미지 샘플을 이동 하지 않았다 고 오른쪽 관심 영역을 선택 취득 된다. 필요한 경우 조정 합니다.</li>
</ol>6. 데이터 시각화
<ol><li>피지에서 피지에 모든 이미지를 포함 하는 폴더를 드래그 하 여 이미지를 열고 고 가상 스택을 선택 합니다.</li>
	<li>사각형 도구를 사용 하 여 관심 영역 자르기 (이미지 > 자르기).</li>
	<li>어둠 속에서 나타나는 멤브레인과 전통적인 전송 전자 현미경 검사 법 대조를 보여주는 데이터를 반전 (편집 > 반전).</li>
	<li>TrackEM214 (피지15)를 사용 하 여 정렬. TrackEM2에 데이터를 로드 (파일 > 새로 만들기 > TrackEM2) 레이어를 클릭 하 여. 모든 이미지를 로드 한 후 정렬할 다층 모자이크 기능을 사용 하 여 (마우스 오른쪽 단추로 클릭 이미지 > 정렬 > 정렬 다층 모자이크). 정렬 후에 이미지 개별 tiff 파일로 내보내집니다 (마우스 오른쪽 단추로 클릭 이미지 > 내보내기 > 만들기 플랫 이미지). 모든 이미지를 내보낼 수 및 파일에 저장할선택을 선택 합니다.</li>
	<li>후 처리에 대 한 가우스 흐림 효과 사용 하 여 (과정 > 필터 > 가우시안 흐림; 시그마 2) 및 로컬 콘트라스트 향상 (과정 > 현지 대비 향상; CLAHE: blocksize 127, 히스토그램 쓰레기통 256, 최대 경사 1.5), 이미지를 부드럽게 하 고 더 나은 신호 대 잡음 비율을 얻기에 피지에 적용 되는.</li>
	<li>아이 모드16 수동 세분화를 수행 하 고 3D에 대 한 관심의 구조를 시각화 하는 데 사용 됩니다. 아이 모드에서 데이터 집합을 열고 드로잉 도구 를 선택 (특별 한 > 그리기 도구) 수동 세분화를 수행. 다른 수동 도구 (예: 조인, 조각) 볼륨에 걸쳐 관심의 구조에 따라 사용할 수 있습니다. 현미경 이미지 브라우저 (MIB17)를 사용 하 여 반자동된 세분화에 대 한.</li>
</ol>

<ol>
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관심 없음 충돌 선언.

프로토콜 최적의 보존 및 직렬 블록-얼굴 영상 거짓말-SEM.와 함께 수행 하는 대조를 설명 하기 위해 개발 되었다 따라서, 우리는 cryo-동원 정지 후 얼룩 동결 대체 및 전자 레인지를 이용한 처리를 사용 하 여 다음을 적용 하기로 결정 했습니다. 따라서,이 프로토콜은 고압 냉동에 대 한 충분히 작은 샘플에 제한 됩니다. 3 ~ 6 m m 폭에서의 크기 제한 및 ~ 200 µ m의 두께이 기술을 제대로 냉동 수 샘플 크기와 일치 하는 샘플 캐리어의 크기에 의해 설정 됩니다. 이것은 좌 골 신경은 직경 0.2 m m 사업자 적절 한 어를 확인 하는 데 필요한에 맞게 너무 큰 이기 때문에 마우스 신경 샘플 관련. 따라서, 조심 해 부 tibial 신경 또는 다른 얇은 신경 대 퇴 신경 등 등 작은 신경의 것이 좋습니다. Myelin 칼 집 스트레칭 민감한 때문에, 아티팩트를 처리 방지로 큰 관심 신선 하 고 가능한 신경의 해 부 동안 이동 해야 합니다. 일반적으로, 실행 가능한 샘플만 전자 현미경 연구에 대 한 사용 해야 합니다.
전자 레인지를 이용한 처리와 최소한의 수 지 포함 준비 속도와 프로세스를 대상으로 설계 되었습니다. 전자 레인지를 이용한 처리 수정된 오토 프로토콜4 적용 실내 온도 화학 고정에 사용 됩니다. 가정용 전자 레인지 이후 전자 레인지의 아무 균일 분포, 온도 제어 되지 않는 적용 될 수 있는 아무 진공은 동일한 결과 생성 하지 것입니다. 작은 샘플, 화학;의 더 나은 침투를 따라서 최상의 결과 얻으려면 작은 샘플에 의해 달성 된다. 온도 제어 및 최소한 필요한 전자 레인지 전력 응용 프로그램 샘플에 손상을 과열 하 여 방지 하려면 중요 하다. 경우에 처리 시간이 더 오래 이어질 것입니다 아무 전자 레인지, 전자 레인지를 이용한 처리 단계 벤치에 수행할 수 없습니다. SEM에서 직접 대상 구조, 그것은 샘플의 상단에서 가능한 많은 수 지를 제거 하는 중요 한. 데이터 집합을 기록한 후 원시 데이터의 후 처리 파일 크기를 줄이고 신호 대 잡음 비율 개선 필요는. 현대 볼륨 이미징 기술을 많은 양의 데이터 생성합니다. 따라서, 신속 하 고 충분 한 방식으로 데이터 처리를 수행 하는 워크스테이션에 충분 한 RAM이 필요 하다. 정렬 작업에 대 한 데이터 집합 크기도 적어도 두 번 만큼 RAM이 필요 합니다.
이 프로토콜은 C. 선 충에서 뿐만 아니라 마우스의 nervus tibialis 테스트 되었습니다. 홀 외입니다. 12 의 준비에 대 한 벤치에 그들의 동결 대체 후 유사한 향상 단계 사용 C. 선 충. 제 브라 등 다른 모델 생물에 대 한 프로토콜의 조정 가능성이 필요한 있습니다. 한 가지 가능한 수정 대비 향상18에 사용 되는 물의 추가 의해 동결 대체와 같은 칵테일의 구성을 변경 하려면입니다. 또한, 동결 대체 기간은 샘플에 적응 해야 하 고 상당히 빠른 동결 대체 프로토콜19에 따라 단축 될 수 있다. 1 개의 가능성은 동결 대체 과정20가속을 위한 동요의 응용 이다. 고정 대체 후 추가 수정 강화 화학 물질과 오스뮴 tetroxide21의 반복된 응용 프로그램과 같은 수 있습니다. 마이크로파 처리 중 온도, 보육 시간 및 전원 설정을 해당 샘플에 대 한 결과 최적화 하기 위해 다양 수 있습니다.
이 프로토콜이 보여줍니다 이러한 향상 다른 동결 대체 프로토콜 및 직렬 블록-얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사 법 또는 sem의 거짓말에 몇 군데는 샘플 홀12 에 설명 된 대로 다른 종류와 결합 될 수 있다. 이러한 이미징 기술을 향상 된 대비, 전송 전자 현미경 검사 법에 대 한 덜 중요 한 필요 합니다.

고압 냉동 샘플 화학 기정1를 사용 하 여 기존의 준비 방법 보다 훨씬 더 나은의 기본 상태를 나타냅니다 높은 품질 ultrastructural 보존 위한 샘플 준비 방법의 선택 이다. 이 곳을 알아내는-준비 방법 샘플 myelinated 마우스 조직2 등 꼬마 선 충3모델 생물체의 사용에 대 한 엄격한 요구 사항에 대 한 유용합니다. 고정 대체 및 수 지 포함, 후이 샘플 전송 전자 현미경 (TEM) 또는 전자 단층 촬영 (동부 표준시)에 의해 일반적으로 분석 된다. 만약 더 큰 볼륨 고해상도 대형 3D 복원, sem의 의해 적절 한 영상 대비의 부족에 의해 방해 종종 우리의 경험에 대 한 거짓말-SEM 또는 직렬 블록-얼굴 이미지를 사용 하 여 몇 군데 해야 합니다. 거짓말-sem, 이미지는 일반적으로 기본 전자 빔에서 backscattered 전자의 탐지에 의해 기록 됩니다. Backscattered 전자의 수익률은 샘플에서 중 금속 내용에 비례 합니다. 따라서, 프로토콜 추가 중 금속 침으로 볼륨 대비를 향상 시키기 위해 이미징에 대 한 설계 특히 했다. 이러한 메서드 화학적 고정된 샘플에 기반 하 고 노트 외5, 직렬 블록-얼굴에 대 한 설명 된 대로 오스뮴 tetroxide-thiocarbohydrazide-오스뮴 tetroxide4의 조합을 적용 하 고 이온 빔 스캐닝 전자 현미경 검사 법을 집중. 수정 formamide과 pyrogallol6 또는 리드 aspartate7 의 사용을 포함 하 여 다른 이미징 기술에 대 한 성공적으로 적용 되었습니다 했습니다.
여기에 제공 된 프로토콜 HPF 여 표본 cryo-준비 결합 및 전자 레인지 지원 실 온에서 아세톤의 thiocarbohydrazide/오스뮴 tetroxide를 사용 하 여 향상 된 대비를 위한 처리 후속으로 대체를 동결. 우리는 고압 높은 품질 ultrastructural 보존에 대 한 동결을 요구 하는 샘플을 대표 하는 myelinated nervus tibialis 생쥐와 꼬마 선 충 에이 방법을 보여 줍니다. 또한, 그것은 어떻게, 탈수 및 침투, 후 샘플 함께 임베디드 되 최대한 작은 수 지로 표시 됩니다. 8 포함이 최소한의 수 지의 구조의 빠른 대상에 대 한 허용 하 고 이온 빔으로 관심 영역을 노출 하는 데 필요한 시간을 포함 하 여 샘플 처리에 소요 된 시간을 감소 시킨다. 현미경 내부 샘플 준비 단계를 더 수행 후 이미징 및 샘플의 밀링 수행 됩니다 지속적으로 이미지의 더미를 얻으려고. 3D 시각화에 대 한 이미지 처리 소프트웨어 (아이 모드)는 dataset의 부분을 재구성 하는 데 사용 됩니다.
우리의 워크플로 어떻게 볼륨 이미지에 대 한 샘플의 가장 적합 한 대조 결합 될 수 있다 ultrastructural 최고의 보존 HPF와 동결 대체 하 여 설명 합니다. 곳을 알아내는-준비를 엄격 하 게 요구 하는 샘플에 대 한 유용 합니다. 응용 프로그램 HPF에 의해 준비 될 수 있는 작은 샘플으로 제한 됩니다. 다른 자연, 식물 또는 미생물 등의 샘플에서이 프로토콜 적응을 요구 한다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Instrumentation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica HPM100</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Freeze Substitution</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory microwave with temperature control unit</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM ACE600 with gold target</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crossbeam 540</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halogen lamp 12 V/ 20 W</td>
			<td>Osram</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>According to C. Elegans- A practical approach I.A.Hope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadecene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>52276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A type carrier</td>
			<td>Wohlwend GmbH</td>
			<td>#241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B type carrier</td>
			<td>Wohlwend GmbH</td>
			<td>#242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slit carrier</td>
			<td>Wohlwend GmbH</td>
			<td>#446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pasteur pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-1684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11200-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze substitution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>science services</td>
			<td>10015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tannic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>403040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>EMS</td>
			<td>19100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>SPI-Chem</td>
			<td>02624-AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>EMS</td>
			<td>10015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>223220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc CryoTubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V7884-450EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Watch glass dishes, 150 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-2189H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan resin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEM stubs</td>
			<td>Science Services</td>
			<td>E75200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aclar</td>
			<td>Science Services</td>
			<td>50425-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpicks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>512-3618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conductive silver resin</td>
			<td>EMS</td>
			<td>12670-EE</td>
			<td>EPO-TEK EE 129-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>SmartSEM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Atlas5 A3D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing</td>
			<td>Open source</td>
			<td>Fiji</td>
			<td>http://fiji.sc/#download</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image visualization</td>
			<td>Open source</td>
			<td>IMOD</td>
			<td>http://bio3d.colorado.edu/imod/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biological sample preparation by high-pressure freezing, microwave-assisted contrast enhancement, and minimal resin embedding for volume imaging

집중 된 이온 빔 스캐닝 전자 현미경 (거짓말-sem의), 얻을 하는 데 사용 되는 이미지 형식에 대 한 가장 적합 한 대조와 ultrastructural 보존의 최고의 품질을 결합 하 여 설명된 샘플 준비 기술 설계 3 차원 재구성 및 모델링에 대 한 순차적인 이미지의 누적 됩니다. 고압 (HPF) 동결 기본 구조 보존, 가까이 있지만 후속 고정 대체 자주 제공 하지 않습니다 충분 한 대비, 특히 더 큰 견본, 고급 이미징 3D에 필요한 sem을 위해 필요한 개조입니다. 따라서,이 프로토콜에 동결 대체 후 추가 대조 단계 실행 된다 실내 온도에. 전자 레인지에서 이러한 단계를 수행 하는 있지만 그것은 또한 전통적인 벤치 처리, 부 화 시간이 더 오래 필요에 따라 수 있습니다. 더 빠르고 더 정확한 타겟팅과 거짓말-SEM. 안에 준비에 대 한 수 수 지의 최소한의 금액에서 후속 포함 이 프로토콜은 신뢰할 수 있는 ultrastructural 보존을 위한 고압 냉동 하 여 준비를 해야 하지만 거짓말-SEM.를 사용 하 여 볼륨 이미지에 대 한 동결 대체 하는 동안 충분 한 대비를 얻을 하지 않습니다 샘플에 특히 유용 포함 하는 최소한의 수 지와 함께,이 프로토콜 고급 볼륨 데이터의 수집에 대 한 효율적인 워크플로우를 제공 합니다.

(여기, 갓 해 부 마우스 nervus tibialis) 샘플 워크플로가 시작 고압 냉동 (그림 1a)에 대 한 금속 사업자에 배치 되 고. 항공사 액체 질소 (그림 1b)에서 발견 되며 냉동된 첫 화학 칵테일 (그림 1c) 위에 동결 대체 단위에 배치. 긴 대체 프로토콜 2% 오스뮴 tetroxide 그리고 0.1 %uranyl 아세테이트를 포함 하 여, 동결 후 샘플 실내 온도 (그림 1의 d)에 운반대에서 제거 됩니다. 명암을 더 강화 하려면 샘플 전자 레인지 (그림 1e)에 처리를 플라스틱 튜브로 전송 됩니다. 진공 챔버 및 온도 제어 장치는 (그림 1 층) 프로세스를 최적화 하는 데 사용 됩니다.
최소 수 지 포함 수행할 수, 이쑤시개와 플라스틱 필름 시트는 필요 하다 (그림 2a). 수 지 전자 레인지를 사용 하 여 샘플을 침투 후 그들은 플라스틱의 조각에 배치 하 고 아무 수 지 샘플 표면에 남아 때까지 이동. 할로겐 램프는 나머지 수 지를 배수 하 고 플라스틱 필름에 (그림 2b) 최소 포함 된 샘플을 두고 하는 데 사용 됩니다. 그것은 샘플의 상단에서 제거 하는 더 많은 수 지는 좋은 주목 해야한다. 여전히 기판에 부착 된 유지 샘플 아래 왼쪽 작은 금액을 해야 합니다. 플라스틱 필름에 생산 되 고 샘플 컷 이며 실버 전도성 수 지 (그림 2c)와 sem의 스텁 위에 탑재. Stub은 적어도 4 h 60 ° C (그림 2d)에 대 한 생산. 구성 요소를 철저 하 게 혼합 한다 또는 혼합 올바르게 유해 하지 않을 수 있습니다. 스캐닝 전자 현미경 내부 충전을 방지 하려면 스텁 스퍼터 코팅 금 또는 백 금/팔라듐 (그림 2e) 이다.
샘플은 거짓말-sem의에 배치 하 고 (그림 3ae) 관심 영역을 대상으로 2 차 전자 검출기와 몇 군데. 이온 빔 크로스 섹션 (그림 3b-d, 3 층-h)를 노출 하는 관심 영역 앞 직접 재료를 제거 하는 데 사용 됩니다. 반면 강한 막 대비 (그림 3 c-d, 3 세대-h)를 제공 하는 향상 된 프로토콜 표준 프로토콜은 자주 막 대비 (그림 3bf)의 부족에서 고통.
(후 처리) 후 EM 데이터 아이 모드, 이미지 처리 및 모델링 프로그램을 사용 하 여 시각화 됩니다. 3D 정보의 더 나은 이해를 달성 하기 위해 사용 되는 데이터의 가상 재분할 (그림 4a). 데이터 집합의 다른 구조 수동으로 세그먼트 (그림 4b-d).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59156/59156fig1.jpg"> 그림 1: 고압, 동결-대체 및 전자 레인지를 이용한 처리. (a) 샘플 포함 된 마우스 nervus tibialis 캐리어, 3. (b) 샘플 캐리어 마우스 nervus tibialis 고압 냉동, 스케일 바 3. (c) 자동 동결 대체 (AFS) 단위 후 샘플으로 포함 된 바 규모. 삽입: 최대 23 샘플 튜브는 AFS에 화학 물질을 포함 하는 두 개의 큰 튜브에 대 한 주문 품 금속 컨테이너. (d) 샘플에 아세톤, 유리 접시에 운반대에서 제거 되 고 3 mm. (e) 처리를 위해 전자 레인지에 넣어 반응 튜브 샘플 바 규모. 전자 레인지의 (f) 진공 챔버 및 온도 제어 단위. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59156/59156fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59156/59156fig2.jpg"> 그림 2: 최소한의 수 지를 포함 하 고 거짓말-SEM.에 대 한 준비 (a) 플라스틱 필름과 포함 최소 수 지에 사용 되는 이쑤시개, 스케일 바 4 cm. (b) Nervus tibialis 플라스틱 필름, 스케일 바 250 µ m. (c) Nervus tibialis 플라스틱 필름에 생산 그리고 잘라와 SEM 스텁 위에 탑재 위에 수 지의 배수 실버 전도성 수 지, 규모 250 µ m. (d) SEM 스텁, 규모 위에 생산 샘플 바 바 3 m m. (e) 샘플 SEM 스텁, 규모에 금으로 입힌 바 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59156/59156fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59156/59156fig3.jpg"> 그림 3: 거짓말-SEM. 내부 샘플의 준비 (a, e) 샘플의 거짓말-SEM 내부 보조 전자 이미지 이미징 (a) Nervus tibialis 눈금 막대 100 µ m. (e) C. 선 충, 눈금 막대 2 µ m. (b-d)와 (f-h) 횡단면 ESB 검출기를 사용 하 여 샘플을 통해 표면. (b와 c) Nervus tibialis 확장 바 2 µ m. (f 및 g) C. 선 충, 1 µ m 바 규모와 200 nm. (b와 f) 표시 된 다른 모든 이미지 향상 된 동결 대체의 결과 표시 하는 반면 고압 및 향상, 동결 대체의 결과입니다. (d와 h) ESB 검출기를 사용 하 여 샘플의 상세한 이미지. (d) Nervus tibialis, 눈금 막대 200 nm. (h) 200 바 C. 선 충, 규모 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59156/59156fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59156/59156fig4.jpg"> 그림 4: 수집 및 시각화 이미지. (a) EM 데이터와 아이 모드에 표시 된 거의 x resliced / z와 y/z-비행기, 스케일 바 2 µ m. (b) 세그먼트 EM 데이터 (파란색), Remak 번들 (빨간색), myelin 칼 집 (노란색과 오렌지색), 및 (청록색), 미토 콘 드리 아에 축 삭 확장 바 2 µ m. (c, d) 3D 모델, 눈금 2 µ m 막대와 500 nm . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59156/59156fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

여기에 우리가 두 개의 샘플 처리 기술, 냉동 고압을 결합에 대 한 프로토콜을 현재 그리고 전자 레인지를 이용한 샘플 처리, 집중 된 이온 빔 스캐닝 전자 현미경 (SEM 거짓말)와 데이터 획득에 대 한 포함 하는 최소한의 수 지. 이 마우스 tibial 신경 샘플와 꼬마 선 충을 사용 하 여 보여 줍니다.

고압 냉동, 전자 레인지를 이용한 콘트라스트 향상, 그리고 볼륨 이미지에 대 한 포함 하는 최소한의 수 지에 의해 생물학 견본 준비

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

이 샘플 준비 기술은 중점 이온 빔 스캐닝 전자 현미경에서 이미징 양식에 가장 적합한 대비와 초구조 보존의 최고 품질을 결합하도록 설계되었습니다. 이 프로토콜은 신뢰할 수 있는 초구조 보존을 위해 고압 동결에 의한 준비를 필요로 하지만 볼륨 이미징을 위한 동결 대체 중에 충분한 대조를 얻지 못하는 시료에 특히 유용합니다. 최소한의 수지 포함을 위해서는 가능한 한 많은 수지를 제거하여 나중에 집중된 이온 빔 스캐닝 전자 현미경에서 적절한 표적을 허용하는 것이 필수적입니다.먼저 파이펫을 사용하여 절단 매트에 20% PVP PBS 한 방울을 떨어 뜨립니다. 물방울에 해부 된 nervus 티비아를 담급하십시오. 메스를 사용하여 샘플의 2 밀리미터 길이를 절단합니다.미세 한 집게를 사용하여 샘플을 0.2 밀리미터 깊이 유형 A 금속 샘플 캐리어에 배치하십시오. 캐리어를 카트리지의 중간 플레이트로 옮킨다. 육사데카네 코팅형 B형 캐리어를 뚜껑으로 위에 놓습니다.카트리지의 상반부를 낮춤으로써 어셈블리를 닫습니다. 고압 냉동고의 로딩 스테이션에 있는 3피스 카트리지를 닫습니다. 프로세스 버튼을 누르고 제조업체의 운영 지침에 따라 진행합니다.액체 질소의 목욕에서, 냉동 0.1%탄닌산과 아세톤의 2 밀리리터를 포함하는 저온 바이알에 샘플 캐리어를 배치하고 캡을 닫습니다. 냉동 고비알을 영하 90도로 설정된 동결 대체 장치에 넣습니다. 프로그램을 시작하고 100 시간 동안 샘플을 유지합니다.동결 대체 장치에서 는 30 분 동안 아세톤의 2 밀리리터로 샘플을 세 번 씻으십하십시오. 2%의 오스뮴 테트옥사이드를 0.1%의 우라일 아세테이트를 동결 대체 장치에 넣고 냉각을 위해 7시간 동안 시료에 첨가하여 영하 90도에서 계속 염색합니다. 동결 치환장치의 프로그램 온도가 섭씨 영하 20도에 도달하면 샘플을 16시간 동안 보관하십시오.온도가 섭씨 4도까지 올라가면 바이알의 액체를 버리고 순수한 아세톤을 채웁니다. 동결 대체 장치에서 냉동 유리병을 제거합니다. 시료가 심하게 손상될 수 있기 때문에 동결 전 과 후 의약 처리가 중요합니다.연기 후드에서 미세 한 집게를 사용하여 냉동고 바이알에서 금속 캐리어를 제거하고 캐리어에서 샘플을 전송하여 아세톤으로 채워진 150mm 깊이의 시계 유리 접시에 잠급됩니다. 미세 한 집게를 사용 하 여 아세톤으로 채워진 두 밀리 리터 반응 튜브로 샘플을 전송 합니다. 전자레인지를 250와트로 40초 동안 설정하고 전자레인지를 시작하여 샘플을 세척하고 4회 반복합니다.파이펫 1 밀리리터 1%의 티오카르보히드라지드 용액을 반응 튜브에 넣고 전자레인지에 넣습니다. 진공 기능을 2분 이상 켜고 2분 쉬면 총 14분 동안 반복하여 150와트로 설정합니다. 전자 레인지를 시작합니다.이전과 같이 아세톤에서 샘플을 4번 세척합니다. 파이펫 1 밀리리터 의 2% 오스뮴 테트란화물 용액반응 튜브에. 샘플을 전자레인지에 넣고 티오카르보히드라지드와 동일한 전자레인지 설정을 사용합니다.이전과 같이 아세톤에서 샘플을 4번 세척합니다. 파이펫 1 밀리리터의 25% 수지 아세톤에 반응 튜브에 넣고 전자레인지에 넣습니다. 진공 기능을 3분 동안 켜고 250와트로 설정합니다.전자 레인지를 시작합니다. 이쑤시개를 사용하여 반응 튜브에서 nervus 티비리얼리스를 제거하고 플라스틱 필름 조각에 놓습니다. 할로겐 램프를 시료 에 가까이 두어 수지를 가열합니다.이쑤시개를 사용하여 남은 수지가 감지되지 않을 때까지 플라스틱 필름의 샘플을 부드럽게 밀어 넣습니다. 플라스틱 필름을 위에 놓고 온도를 섭씨 60도로 설정하여 샘플을 최소 48시간 동안 중합합니다. 면도날을 사용하여 중합화된 시료와 SEM 스텁에 맞는 크기로 플라스틱 필름을 잘라냅니다.이쑤시개를 사용하여 SEM 스텁에 전도성 실버 수지와 절단 샘플을 부착합니다. 그런 다음 샘플 주위에 수지를 추가합니다. 오븐에 SEM 스텁을 넣어 적어도 4 시간 또는 하룻밤 동안 섭씨 60도에서 중합하십시오.중합 후, 스퍼터 코터에 SEM 스텁을 배치합니다. 스퍼터 코터를 35밀리암퍼로 설정하고 10나노미터 두께의 골드 코팅이나 코트를 1분 동안 바치십시오. 코팅 후, 집중 이온 빔 스캐닝 전자 현미경 내부에 SEM 스텁을 배치합니다.이 연구에서는, 마우스의 nervus tibialis뿐만 아니라 C.elegans에 대한 향상된 프로토콜이 수행되어 집중된 이온 빔 스캐닝 전자 현미경으로 3D 부피 이미징을 수행하는 최적의 보존 및 대비를 보여 주도록 수행되었습니다. 표준 프로토콜은 종종 향상된 프로토콜이 강력한 멤브레인 대비를 제공하는 멤브레인 대비의 부족으로 고통받습니다. 향상된 프로토콜과 표준 프로토콜을 갖춘 C.elegans의 단면 이미지는 뚜렷한 차이를 보여줍니다.nervus tibialis의 단면 이미지뿐만 아니라, 향상된 프로토콜은 표준 프로토콜에 비해 더 강한 멤브레인 콘트라스트를 표시하는 데 도움이됩니다. 후처리 후, 전자 현미경 데이터는 IMOD, 이미지 처리 및 모델링 프로그램을 사용하여 시각화됩니다. 파란색 강조 표시된 영역은 분할된 축축을 표시합니다.빨간색 으로 강조 표시된 영역에는 Remak 번들이 표시됩니다. 노란색과 주황색으로 강조 표시된 영역은 myelin 칼집을 보여줍니다. 그리고 청록색 으로 강조 된 지역은 미토콘드리아를 보여줍니다.가상 리살리싱 및 3차원 모델은 미세 조직 아키텍처를 보여 주며 그 기능을 이해하는 데 도움이 됩니다. 다른 부피 주사 전자 현미경 검사 방법은 직렬 블록 - 얼굴 스캔 전자 현미경 검사 및 배열 단층 촬영과 같은 뿐만 아니라 사용될 수있다. 이 프로토콜은 또한 중추 신경계에서 견본과 같은 전송 전자 현미경 검사법 및 그밖 견본 모형을 위해 이용될 수 있습니다.오스뮴 테트록사이드, 티오카르보하이드로지드, 우란 아세테이트는 독성 화학물질이며 신중하게 사용해야 합니다. 수지는 또한 유해하며 주의와 함께 사용해야합니다. 장갑및 실험실 코트와 같은 개인 보호 장비는 전체 프로토콜을 위해 착용해야합니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

이런 산화물로 hESCs과 hMSCs을 라벨링하는 MR 영상과 생체내 추적 비침습에 대한 Nanoparticles

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

연구

생물학

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

단계 대비 및 차등 간섭 대비 (DIC) 현미경

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

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useful as contrast agents for ...

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Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging

ACT-PRESTO : 생물 조직 지우기 및 볼륨 이미징을위한 Immunolabeling 방법

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in ...

Volume Segmentation and Analysis of Biological Materials Using SuRVoS (Super-region Volume Segmentation) Workbench

Volume Segmentation and Analysis of Biological Materials Using SuRVoS Super-region Volume Segmentation Workbench

볼륨 세분화 및 SuRVoS (슈퍼 지역 볼륨 세분화) 워크 벤치를 사용 하 여 생물학 물자의 분석

Segmentation is the process of isolating specific regions or objects within an imaged volume, so that further study can be undertaken on these areas of ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

샘플 준비 및 전송 전자 현미경 검사 법에 의해 Exosomes의 영상

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...