Name: biological sample preparation by high-pressure freezing, microwave-assisted contrast enhancement, and minimal resin embedding for volume imaging
Uploaded: 2019-03-19T14:45:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging at JoVE.com

FIB-SEM og AS (plasseringen av operatoren FIB-SEM) er finansiert av klyngen of Excellence og Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Research Center nanoskala mikroskopi og molekylære fysiologi av hjernen (CNMPB). Vi takker laboratoriet av Thomas Müller-Reichert for å gi C. elegans eksempler. Vi takker Ulrich Weikert for deltakelse i filmen.

Alle eksperimenter inkludert fra dyr beskrevet her er godkjent av den institusjonelle Animal Care og lavere Sachsen staten kontoret for kunden beskyttelse og mat sikkerhet (LAVES).
1. høytrykks frysing og fryse substitusjon
<ol><li>Dissekere nervus tibialis fra en mus (f.eks C57Bl6N, 12 uker, kvinnelige)9.</li>
	<li>Fordype nervus tibialis i en dråpe 20% polyvinylpyrrolidone (1 g av PVP i 5 mL) i fosfat bufret saltvann (PBS) og klippe stykker av 2 mm lengde. Deretter plasserer den i en metall eksempel operatør (Type A, 0.2 mm dybde) ved hjelp av fine pinsett. Legge til en annen flat bærer (Type B) belagt med et tynt lag av hexadecane som et lokk og sett denne samlingen inn prøven kassetten.</li>
	<li>Overføre flere C. elegans suspendert i en dråpe 20% bovin serum albumin (BSA) i M9 (se Tabell for materiale) med en engangs plast pipette inn i metall bærer (Type A). Deretter legge til en andre transportør som lokket på toppen (Type B) og montere kassetten.</li>
	<li>For begge eksemplene, fortsetter med følgende: høytrykks fryse eksempel carrier samlingene en etter en ved å laste dem inn i tre deler kassetten i lasting stasjonen i høytrykks fryseren. Trykk prosessen etter produsentens bruksanvisningen. Merk: Begge typer prøver kan behandles sammen i påfølgende fryse substitusjon.</li>
	<li>Plass prøvene i cryovials som inneholder 2 mL frosne 0,1% garvesyre i aceton. Utfør overføringen i et badekar med flytende nitrogen uten spilling flytende nitrogen i hetteglass. Overføre cryovials til en automatisk fryse substitusjon enhet10 satt-90 ° C og starter programmet. Merk: Prøvene er holdt i-90 ° C i 100 h. garvesyre før osmification blir brukt som mordant for å øke opptaket av osmium tetroxide11.</li>
	<li>Manuelt vaske prøvene 3 x i 30 min med 2 mL av acetone ved-90 ° C i fryse substitusjon enheten.</li>
	<li>La prøvene i 2 mL 2% osmium tetroxide, 0,1% uranyl acetate på aceton for fortsatt farging i automatiske fryse substitusjon enhet for 7 h på-90 ° C. FORSIKTIG: Osmium tetroxide er giftig og skal håndteres under avtrekksvifte, og verneutstyr bør brukes. Merk: Fryse substitusjon enheten automatisk hever temperaturen til-20 ° C på 5 ° C/t. Prøvene holdes på 20 ° C 16 h i fryse substitusjon enheten. Temperaturen økes automatisk til 4 ° C på 10 ° C/t.</li>
	<li>Utveksle osmium tetroxide løsningen med ren aceton når temperaturen har nådd 4 ° C. Fjerne cryovials fra fryse substitusjon enheten.</li>
</ol>2. mikrobølgeovn-assistert behandling
Merk: Utføre fremgangsmåten ved romtemperatur12 bruker en temperaturkontroll enhet for å holde temperaturen stabil (se Tabell for materiale).
<ol><li>La caps av reaksjon tuber åpen under behandlingen i mikrobølgeovnen.</li>
	<li>Ta metall eksempel bærere av cryovials og fjerne prøvene fra metall transportøren med fine tang eller en nål, mens eksemplene senket i aceton i et ur glass rett (150 mm).</li>
	<li>Overføre prøvene til 2 mL reaksjon rør med fine tang eller en pipette og vask med 1 mL av aceton fire ganger for 40 s på 250 W. FORSIKTIG: Thiocarbohydrazide er giftig og skal håndteres under avtrekksvifte, verneutstyr bør brukes.</li>
	<li>Flekken prøver med 1 mL 1% thiocarbohydrazide i aceton i 14 min på 150 W å øke kontrasten. For å utføre den flekker, Pipetter thiocarbohydrazide løsningen i reaksjon røret, sett røret i mikrobølgeovn og sette programmet til et power 150 W (med vakuum funksjonen aktivert) i 2 minutter på/2 minutter av, gjentar i 14 minutter totalt. Starte mikrobølgeovn. Merk: Thiocarbohydrazide reagerer med osmium tetroxide som ble brukt under fryse substitusjon. Den danner en bro, slik at flere osmium tetroxide skal deponeres på den opprinnelige osmium tetroxide nettsteder13.</li>
	<li>Vask prøvene 4 x med 1 mL av aceton for 40 s på 250 W. Pipette aceton i en reaksjon tube, sett røret i mikrobølgeovn og velg 250 W for 40 s. Start mikrobølgeovn.</li>
	<li>Stain i 1 mL av 2% osmium tetroxide i aceton i 14 min på 150 W. Pipette osmium tetroxide løsningen i en reaksjon tube sett røret i mikrobølgeovn og sette programmet til et power 150 W (med vakuum funksjonen aktivert) i 2 minutter på/2 min av , gjentar i 14 minutter totalt. Starte mikrobølgeovn.</li>
	<li>Vask prøvene 4 x med 1 mL av aceton for 40 s på 250 W (som gjort i trinn 2.5).</li>
	<li>Infiltrere med 1 mL økende konsentrasjoner av harpiks i aceton (se Tabell for materiale) 25%, 50%, 75%, 90%, 100% og 100% for 3 min hver på 250 W. Pipette harpiks i en reaksjon tube, sett røret i mikrobølgeovn og sette programmet til en strøm leve l 250 W (med vakuum funksjonen aktivert) 3 min. starte mikrobølgeovn.</li>
</ol>3. Minimal harpiks innebygging8
<ol><li>Ta nervus tibialis og C. elegans av reaksjon røret med en tannpirker og legg dem på et stykke plast film (se Tabell for materiale).</li>
	<li>Bruk tannpirker Skyv prøven på plastfilm til ingen gjenværende harpiks oppdages. Bruk en halogenlampe for oppvarming (se Tabell for materiale) så harpiks blir mindre tyktflytende og kan fjernes lettere. Sted halogenlampen nær nok til å varme opp harpiks (å være forsiktig med å brenne hender).</li>
	<li>Danner prøvene for minst 48 timer på 60 ° C over plastfilm i ovnen.</li>
</ol>4. forberedelse til FIB-SEM
<ol><li>Kuttet ut polymerized prøvene sammen med plastfilm med et barberblad i størrelse passer SEM stubben og feste dem til SEM fødsler bruker en ledende sølv harpiks (se Tabell for materiale). Danner igjen ved 60 ° C i minst 4 timer eller over natten.</li>
	<li>Frese pels prøvene på SEM spire med gull for 1 min på 35 mA bruker en frese coater (platina/palladium kan også brukes, et 10 nm tykt belegg er tilstrekkelig) og plasser dem innenfor FIB-SEM.</li>
</ol>5. datainnsamling inne liten LØGN-SEM
<ol><li>Bilde prøver med sekundær electron detektoren ved hjelp av grunnleggende programvare kjører mikroskopet (se Tabell for materiale). Utvalget skal orientert slik at regionen rundt (f.eks midtre del av nervus tibialis eller C. elegans) i synsfeltet. Merk: For å utføre datainnsamling, tilt scenen til en posisjon slik at prøven ansikter ion bjelken i 90° vinkel på en passende arbeidsavstand (5 mm) i såkalte tilfeldigheter poenget med ion og elektron strålen. Bruke våre instrument, oppnås dette på en scene tilt 54° og 5 mm arbeidsavstand.</li>
	<li>Sette opp riktig posisjon av prøven, midtstille en vanlig funksjon på en 0° tilt mens bildebehandling med sekundær electron detektoren. Sakte recentering tilt til 54° (5°, 20°, 54°), samme objekt ved å flytte M-aksen.</li>
	<li>Finne et tilfeldig punkt ved å midtstille en funksjon under bildebehandling med sekundær electron detektoren på 54°, etterfulgt av flytte funksjonen til den sentrale posisjonen i FIB modus. Gjøre dette ved å vise trådkorset i SEM programvaren har en indikasjon på midten. Så først flytte funksjonen utvalgt utvalg midtpunkt bildeområdet ved hjelp av funksjonen midten punkt av SEM programvaren. Deretter sentrum funksjonen langs y-aksen ved å bevege scenen i z. Siste forskyvningen mellom LØGN og SEM er korrigert med SEM strålen SKIFT.</li>
	<li>Åpne Avansert programvare (se Tabell for materiale) for registrering av 3D datasett og følge veiviseren trinnvis.</li>
	<li>På området av interesse, innskudd karbon eller platinum (400 nm) på Avkastningen ved hjelp av en 3 nA gjeldende tillate selv fresing og redusere gjenstander indusert av lading. Merk: Ved å tegne regionen rundt å være malt på prøveoverflaten fotografert med liten LØGN (bredde, høyde, dybde), programvaren beregner og superimposes størrelsen på de forskjellige utvalg forberedelse funksjonene, som skyttergravene skal frest eller område for Platinum/karbon deponering. Også være forsiktig Imaging eksempel overflaten med for høy FIB strøm, da dette kan skade overflaten prøven. En strøm av 50 pA er tilstrekkelig for bildebehandling.</li>
	<li>Bruk fokusert ion strålen til mill en grøft for å avsløre regionen rundt (ROI) ved hjelp av en 15/30 nA gjeldende.</li>
	<li>Bruk fokusert ion strålen for å polere tverrsnitt med en 7 nA gjeldende.</li>
	<li>Etter endt eksempel utarbeidelse, angi følgende tenkelig parametere: LØGN fresing parametere i oppsettkategorien FIB (FIB fresing strøm); SEM imaging parametere i oppsettkategorien og bildet tuning parametere i kategorien SEM AutoTune (utføre autofokus og autostigmation hver 60 min., 50 nm pikselstørrelsen, holdetiden 3, linje gjennomsnittlig 3). Optimalisere dette for hvert utvalg.</li>
	<li>For å hindre noen termisk drift forårsaker blokk-ansiktet til drift under kjøringen, forlate rommet for minst 2 timer før oppkjøpet.</li>
	<li>Skaffe dataset i en kontinuerlig mill og kjøpe modus med en 700 pA FIB gjeldende. Bruk 1.5 kV (analytiske modus, 900 V) ESB detektor med en rutenettet spenning på 400 V hente bilder med 5 nm pikselstørrelse ved hjelp av avansert programvare (se Tabell for materiale) og 50 nm skive tykkelse. En bildeopptak tar ca 1,5 min bor tid av 6 µs.</li>
	<li>Starte av datainnsamling. En liten LØGN bilde på fresing gjeldende anskaffes prøven ikke flytte og høyre regionen rundt er valgt. Juster om nødvendig.</li>
</ol>6. datavisualisering
<ol><li>Åpne bilder i Fiji ved å dra mappen som inneholder alle bildene i Fiji, og velg Virtuelle stabel.</li>
	<li>Beskjære regionen rundt med rektangelverktøyet (bilde > Beskjær).</li>
	<li>Invertere dataene slik at den tradisjonelle overføring elektronmikroskop kontrasten med membraner i mørket (Rediger > Inverter).</li>
	<li>Bruk TrackEM214 (Fiji15) for justering. Laste inn dataene i TrackEM2 (Fil > Ny > TrackEM2) ved å klikke på lag. Etter at alle bildene er lastet, justere dem flerlags mosaikk funksjonen (Høyreklikk på bilde > Juster > Juster flerlags mosaikk). Etter justering bilder eksporteres som individuelle tiff-filer (Høyreklikk på bilde > Eksporter > gjør flat bilde). Velg alle bilder som skal eksporteres, og velg Lagre til fil.</li>
	<li>For etterbehandling, bruk en Gaussian blur (prosessen > filtre > Gaussian blur, sigma 2) og lokale contrast enhancement (prosessen > øke lokal derimot; CLAHE: blocksize 127, histogrammet hyller 256, maksimal helling 1.5), som brukes i Fiji glatt bildet og få et bedre signal-til-støy-forhold.</li>
	<li>IMOD16 brukes til å utføre en manuell segmentering og visualisere strukturen av interesse i 3D. Åpne dataset i IMOD og velger tegneverktøy (spesielle > tegneverktøy) utføre manuell segmenteringen. Forskjellige manuelle verktøy kan brukes å følge strukturen rundt hele volumet (for eksempel delta, skulptur). Bruk mikroskopi bilde nettleser (MIB17) for halvautomatisk segmentering.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+high+pressure+frozen+samples:+bridging+the+gap+between+cellular+ultrastructure+and+atomic+resolution.">Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130 (5), 877-889 (2008).</li><li>M&#246;bius, W., Nave, K. -. A., Werner, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+myelin:+Structure+preservation+by+high-pressure+freezing.">Electron microscopy of myelin: Structure preservation by high-pressure freezing.</a> Brain Research. 1641, 92-100 (2016).</li><li>Mancuso, J., Lich, B., McDonald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Reconstruction+Methods+for+Caenorhabditis+elegans+Ultrastructure.">Three-Dimensional Reconstruction Methods for Caenorhabditis elegans Ultrastructure.</a> Methods in Cell Biology. 96, 331-361 (2010).</li><li>. NCMIR methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncmir.ucsd.edu/sbem-protocol">https://www.ncmir.ucsd.edu/sbem-protocol</a> (2010)</li><li>Knott, G., Rosset, S., Cantoni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focussed+Ion+Beam+Milling+and+Scanning+Electron+Microscopy+of+Brain+Tissue.">Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (53), e2588 (2011).</li><li>Eberle, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution,+high-throughput+imaging+with+a+multibeam+scanning+electron+microscope.">High-resolution, high-throughput imaging with a multibeam scanning electron microscope.</a> Journal of Microscopy. 259 (2), 114-120 (2015).</li><li>Hua, Y., Laserstein, P., Helmstaedter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-volume+en-bloc+staining+for+electron+microscopy-based+connectomics.">Large-volume en-bloc staining for electron microscopy-based connectomics.</a> Nature Communications. 6, 1-7 (2015).</li><li>Schieber, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+resin+embedding+of+multicellular+specimens+for+targeted+FIB-SEM+imaging.">Minimal resin embedding of multicellular specimens for targeted FIB-SEM imaging.</a> Methods in Cell Biology. 140, (2017).</li><li>Batt, J. A. E., Bain, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tibial+nerve+transection+-+a+standardized+model+for+denervation-induced+skeletal+muscle+atrophy+in+mice.">Tibial nerve transection - a standardized model for denervation-induced skeletal muscle atrophy in mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e50657 (2013).</li><li>M&#246;bius, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Microscopy+of+the+Mouse+Central+Nervous+System.">Electron Microscopy of the Mouse Central Nervous System.</a> Methods in Cell Biology. 96, 475-512 (2010).</li><li>Hayat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Stains and Cytochemical Methods. , (1993).</li><li>Tapia, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-contrast+en+bloc+staining+of+neuronal+tissue+for+field+emission+scanning+electron+microscopy.">High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy.</a> Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).</li><li>Cardona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrakEM2+software+for+neural+circuit+reconstruction.">TrakEM2 software for neural circuit reconstruction.</a> PLoS ONE. 7 (6), (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li><li>Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+Image+Browser:+A+Platform+for+Segmentation+and+Analysis+of+Multidimensional+Datasets.">Microscopy Image Browser: A Platform for Segmentation and Analysis of Multidimensional Datasets.</a> PLoS Biology. 14 (1), 1-13 (2016).</li><li>Walther, P., Ziegler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze+substitution+of+high-pressure+frozen+samples:+The+visibility+of+biological+membranes+is+improved+when+the+substitution+medium+contains+water.">Freeze substitution of high-pressure frozen samples: The visibility of biological membranes is improved when the substitution medium contains water.</a> Journal of Microscopy. 208 (1), 3-10 (2002).</li><li>Mcdonald, K. L., Webb, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze+substitution+in+3+hours+or+less.">Freeze substitution in 3 hours or less.</a> Journal of Microscopy. 243 (3), 227-233 (2011).</li><li>Reipert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agitation+Modules:+Flexible+Means+to+Accelerate+Automated+Freeze+Substitution.">Agitation Modules: Flexible Means to Accelerate Automated Freeze Substitution.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. , (2018).</li><li>Le&#353;er, V., Drobne, D., Pipan, &. #. 3. 8. 1. ;., Milani, M., Tatti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+different+preparation+methods+of+biological+samples+for+FIB+milling+and+SEM+investigation.">Comparison of different preparation methods of biological samples for FIB milling and SEM investigation.</a> Journal of Microscopy. 233 (2), 309-319 (2009).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklært.

Protokollen ble utviklet for å illustrere optimal bevaring og kontrast utføre føljetong blokk-ansikt bildebehandling med en LØGN-SEM. Derfor valgte vi å bruke cryo-immobilisering etterfulgt av etter farging fryse substitusjon og mikrobølgeovn-assistert behandling. Denne protokollen er derfor begrenset til prøver som er små nok for høytrykks frysing. Størrelsesbegrensningene for 3 til 6 mm i bredden og dybden på ~ 200 µm er etablert av størrelsen på utvalget transportøren, som samsvarer med størrelsen på utvalget som kan fryses riktig med denne teknikken. Dette er relevant for musen nerve prøven, siden ischias nerven er for stor i diameter å passe inn i 0.2 mm bærere som kreves for å sikre riktig frysing. Det anbefales derfor forsiktig Disseksjon av en mindre nerve som tibial nerve eller andre thin nerve som femur nerve. Siden myelin-skjeden er følsom å strekke, må stor forsiktighet tas under Disseksjon av frisk og levedyktig nerve å unngå håndtering gjenstander. Generelt bør bare levedyktig prøver brukes for elektron mikroskopiske studier.
Mikrobølgeovn-assistert behandling og minimal harpiks innebygging er utformet for påskynde utarbeidelse og målretting prosessen. Mikrobølgeovn-assistert behandling bruker en modifisert OTO protocol4 brukes til romtemperatur kjemiske fiksering. Husholdningenes mikrobølgeovn vil ikke gi de samme resultatene, siden distribueres ikke homogen av mikrobølger, sin temperatur kontrolleres ikke, og det er ingen vakuum som kan brukes. De mindre en prøve, bedre gjennomtrengning av kjemikaliene; Derfor oppnås de beste resultatene ved mindre prøver. For å unngå skade utvalget av overoppheting, er temperatur og anvendelse av påkrevde støtteinformasjonen mikrobølgeovn kraft avgjørende. Mikrobølgeovn-assistert behandlingstrinnene kan utføres på benken hvis det er nei mikrobølgeovn tilgjengelig, som vil føre til lengre behandlingstider. Direkte mål strukturer i SEM er det avgjørende å fjerne så mye harpiks som mulig fra toppen av prøven. Etter innspillingen dataset, er etterbehandling av rådata nødvendig å redusere filstørrelsen og forbedre signal-til-støy-forhold. Moderne volum Bildeteknikker produserer store mengder data. Derfor, for å utføre databehandlingen på en rask og tilstrekkelig måte, tilstrekkelig RAM på arbeidsstasjonen er nødvendig. Det kreves minst to ganger så mye RAM dataset størrelse for justering.
Denne protokollen er testet på nervus tibialis museklikk samt som C. elegans. Hall et al. 12 brukt en lignende ekstrautstyr trinn etter deres fryse substitusjon på benken for utarbeidelse av C. elegans. For alle andre modellen organisme som sebrafisk er justeringer av protokollen sannsynligvis nødvendig. En mulig endring er å endre sammensetningen av fryse substitusjon cocktail, som ved tilsetning av vann som brukes for kontrast ekstrautstyr18. Videre varigheten av fryse substitusjon må tilpasses prøven og kan bli vesentlig forkortet etter rask frysing substitusjon protokollen19. En mulighet er anvendelsen av agitasjon for akselererende fryse substitusjon prosessen20. Etter fryse substitusjon, ytterligere er endringer mulig, for eksempel gjentatt bruk av styrke kjemikalier og osmium tetroxide21. Under mikrobølgeovn behandlingen, kan temperatur, inkubasjon tider, og innstillinger endres for å optimalisere resultatene for de respektive prøven.
Denne protokollen viser at slike en forbedring kan kombineres med andre fryse substitusjon protokoller og ulike typer prøver som beskrevet av Hall12 som er fotografert i en LØGN-SEM eller seriell blokk-ansikt skanning elektronmikroskop. Disse Bildeteknikker krever forbedret kontrast, som er mindre viktig for overføring elektronmikroskop.

Høytrykks frysing er prøven forberedelse metoden for valg for å få høy kvalitet ultrastructural bevaring, som representerer den opprinnelige tilstanden i en utvalg mye bedre enn konvensjonelle forberedelse metoder å bruke kjemiske fiksering1. Denne cryo-forberedelser metoden er nyttig for prøver som myelinated musen vev2 og strenge krav for bruk av modell organismen Caenorhabditis elegans3. Etter fryse substitusjon og harpiks innebygging analyseres vanligvis disse prøvene av overføring elektronmikroskop (TEM) eller electron tomografi (ET). Hvis større volumer må avbildes bruker FIB-SEM eller seriell blokk-ansikt imaging for høyoppløselig store 3D rekonstruksjoner, vår erfaring riktig bildebehandling av SEM er ofte hemmet av mangel på kontrast. I FIB-SEM, er bildet vanligvis lagret av gjenkjenning av backscattered elektroner fra primære elektronstråle. Avkastningen av backscattered elektroner er proporsjonal med innholdet av tungmetaller i utvalget. Derfor var protokoller spesielt designet for volum for å forbedre kontrasten av ekstra heavy metal impregnering. Slike metoder er basert på kjemisk faste utvalg og bruker en kombinasjon av osmium tetroxide-thiocarbohydrazide-osmium tetroxide4, som beskrevet av Knott et al.5, for seriell blokk-ansikt og fokusert ion strålen skanning elektronmikroskop. Endringer inkludert bruk av formamide og pyrogallol6 eller bly aspartate7 er vellykket brukt for forskjellige Bildeteknikker.
Protokollen her kombinerer cryo-utarbeidelse av prøver av HPF og fryse substitusjon med påfølgende mikrobølgeovn-assistert behandling for utvidet kontrast med thiocarbohydrazide/osmium tetroxide i aceton ved romtemperatur. Dette viser vi på myelinated nervus tibialis mus og Caenorhabditis elegans, som representerer prøver som krever høytrykks frysepunktet for høykvalitets ultrastructural bevaring. I tillegg vises hvordan, etter dehydrering og infiltrasjon, prøvene er integrert med som liten harpiks som mulig. Denne minimale harpiks innebygging8 gir raskere målretting av interesse og reduserer tiden brukt på prøve behandling, inkludert mindre tid kreves for utsette regionen rundt med ion strålen. Etter utfører ytterligere eksempel forberedelsene i mikroskopet, utføres imaging og fresing av utvalget kontinuerlig for å erverve en bunke med bilder. For 3D-visualisering brukes bildebehandling (IMOD) til å rekonstruere deler av datasettet.
Våre arbeidsflyt beskriver hvordan den mest passende kontrasterende av prøver for volum bildebehandling kan kombineres med beste ultrastructural bevaring av HPF og Frys substitusjon. Dette er nyttig for prøver som strengt krever cryo-forberedelser. Programmer er begrenset til små prøver som tilberedes av HPF. Eksempler på ulike natur, som plantemateriale eller mikroorganismer, krever denne protokollen tilpasning.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Instrumentation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica HPM100</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Freeze Substitution</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory microwave with temperature control unit</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM ACE600 with gold target</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crossbeam 540</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halogen lamp 12 V/ 20 W</td>
			<td>Osram</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>According to C. Elegans- A practical approach I.A.Hope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadecene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>52276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A type carrier</td>
			<td>Wohlwend GmbH</td>
			<td>#241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B type carrier</td>
			<td>Wohlwend GmbH</td>
			<td>#242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slit carrier</td>
			<td>Wohlwend GmbH</td>
			<td>#446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pasteur pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-1684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11200-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze substitution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>science services</td>
			<td>10015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tannic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>403040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>EMS</td>
			<td>19100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>SPI-Chem</td>
			<td>02624-AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>EMS</td>
			<td>10015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>223220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc CryoTubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V7884-450EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Watch glass dishes, 150 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-2189H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan resin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEM stubs</td>
			<td>Science Services</td>
			<td>E75200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aclar</td>
			<td>Science Services</td>
			<td>50425-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpicks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>512-3618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conductive silver resin</td>
			<td>EMS</td>
			<td>12670-EE</td>
			<td>EPO-TEK EE 129-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>SmartSEM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Atlas5 A3D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing</td>
			<td>Open source</td>
			<td>Fiji</td>
			<td>http://fiji.sc/#download</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image visualization</td>
			<td>Open source</td>
			<td>IMOD</td>
			<td>http://bio3d.colorado.edu/imod/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biological sample preparation by high-pressure freezing, microwave-assisted contrast enhancement, and minimal resin embedding for volume imaging

Beskrevet eksempel forberedelse teknikken er utviklet for å kombinere den beste kvaliteten på ultrastructural bevaring med egnede kontrasten for bildebehandling modalitet i en fokusert ion strålen scanning elektron mikroskop (FIB-SEM), som brukes til å få stabler av sekvensielle bilder for 3D rekonstruksjon og modellering. Høytrykks frysing (HPF) lar nær innfødt strukturelle bevaring, men den etterfølgende fryse substitusjon ofte gir ikke tilstrekkelig kontrast, spesielt for en større prøven, som høykvalitets bildebehandling i SEM kreves for 3D rekonstruksjon. Derfor i denne protokollen utføres etter fryse substitusjon, kontrasterende trinnene ved romtemperatur. Selv om disse trinnene utføres i en mikrobølgeovn, er det også mulig å følge tradisjonelle benk behandling, som krever lengre inkubasjon ganger. Etterfølgende innebygging i minimale mengder harpiks gir raskere og mer nøyaktig målretting og forberedelse inne liten LØGN-SEM. Denne protokollen er spesielt nyttig for prøver som krever forberedelse av høytrykks frysepunktet for en pålitelig ultrastructural bevaring, men ikke oppnå nok kontrast under fryse substitusjon volum bildevisning FIB-SEM. I kombinasjon med minimal harpiks innebygging, gir denne protokollen en effektiv arbeidsflyt for kjøp av høy kvalitet volumdata.

Arbeidsflyten starter med en prøve (her, en fersk dissekert musen nervus tibialis) blir plassert i metall stativer for høytrykks frysing (figur 1a). Bærere er fikset flytende nitrogen (figur 1b) og plassert i en fryser substitusjon enhet over den frosne første kjemiske cocktail (figur 1 c). Etter en lang fryse substitusjon protokollen inkludert 2% osmium tetroxide og 0,1% uranyl acetate, blir prøvene fjernet fra bærere ved romtemperatur (figur 1 d). For å forbedre kontrasten, overføres prøvene til plastrør behandles i mikrobølgeovn (figur 1e). Vakuum kammer og temperaturkontroll enhet brukes til å optimalisere prosessen (figur 1f).
For å kunne utføre minimale harpiks innebygging, tannpirkere og ark av plast film er nødvendig (figur 2a). Etter infiltrere prøvene med harpiks bruker mikrobølgeovn, er de plassert på biter av plast film og flyttet rundt til ingen harpiks er igjen på prøven overflaten. En halogenlampe brukes til å hjelpe avløp gjenværende harpiks og la prøven minimal innebygd (figur 2b) på plastfilm. Det bør bemerkes at flere harpiks fjernes fra toppen av prøven er bra. Det bør fortsatt være litt igjen under prøve å holde det festet til underlaget. Prøven blir polymerized på plastfilm er kuttet og montert på SEM spire med sølv ledende harpiks (figur 2 c). Stubben er polymerized minst 4 h på 60 ° C (figur 2d). Komponentene bør blandes grundig eller blandingen kan ikke danner riktig. For å unngå lading inne scanning elektron mikroskop, er stubben frese belagt med gull eller platina/palladium (figur 2e).
Prøvene er plassert i FIB-SEM og fotografert med en sekundær electron detektor målrette regionen rundt (figur 3ae). En ion stråle brukes til å fjerne materiale rett foran regionen rundt å avsløre et tverrsnitt (figur 3bd 3f-h). Standardprotokoller lider ofte av mangel på membran kontrast (figur 3bf), mens den forbedrede protokollen gir en sterk membran kontrast (Figur 3 cd 3 g-h).
EM dataene (etter post-prosessering) er visualisert bruker IMOD, et bilde prosessering og modellering program. For å oppnå en bedre forståelse av 3D-informasjon, virtuelle reslicing data brukes (figur 4a). Ulike strukturer av datasettet er segmentert manuelt (figur 4bd).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59156/59156fig1.jpg"> Figur 1: høytrykks frysing, fryse-substitusjon og mikrobølgeovn-assistert behandling. (a) prøve carrier med musen nervus tibialis, skalere bar 3 mm. (b) prøve carrier med musen nervus tibialis etter høytrykks frysing, bar 3 mm. (c) automatisk fryse substitusjon (AFS) skalaenheten med eksempler. Innfelt: skreddersydd metall beholder for opptil 23 eksempel ampuller og to store ampuller som inneholder kjemikalier i AFS. (d) prøver å bli fjernet fra operatører i et glass rett i aceton, skalere bar 3 mm. (e) prøver i reaksjon rør settes i mikrobølgeovn for behandling. (f) vakuum kammer og temperatur kontroll enhet av mikrobølgeovnen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59156/59156fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59156/59156fig2.jpg"> Figur 2: Minimal harpiks innebygging og forberedelser for liten LØGN-SEM. (a) plastfolie og tannpirkere som brukes for minimal harpiks innebygging, skala bar 4 cm. (b) Nervus tibialis drenert av harpiks på plastfolie, skala bar 250 µm. (c) Nervus tibialis polymerized på plast film, deretter kuttet og montert på SEM stubben med sølv ledende harpiks, skalere bar 250 µm. (d) prøver polymerized på SEM stub, skala bar 3 mm. (e) prøver belagt med gull på SEM stub, skala bar 3 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59156/59156fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59156/59156fig3.jpg"> Figur 3: utarbeidelse av prøven inne liten LØGN-SEM. (en og e) Sekundær electron bildet innenfor FIB-SEM av utvalget overflaten (a) Nervus tibialis, skala bar 100 µm. (e) C. elegans, skala 2 µm. (b-d) og (f-h) Tversnitt utvalget med ESB detektor for bildebehandling. (b og c) Nervus tibialis, skalere bar 2 µm. (f og g) C. elegans, skala bar 1 µm og 200 nm. (b og f) Vist er resultatene av høytrykks frysing og fryse substitusjon uten forsterkning, mens alle andre bilder viser resultatene av forbedret fryse substitusjon. (d og h) Detaljert bilde av utvalget med ESB detektoren. (d) Nervus tibialis, skala bar 200 nm. (h) C. elegans, skala bar 200 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59156/59156fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59156/59156fig4.jpg"> Figur 4: oppkjøp og visualisering. (a) EM dataene som vises i IMOD med nesten resliced x / z og y/z-fly, skalere bar 2 µm. (b) segmentert axons på EM-data (blå), Remak-pakker (rød), myelin sheaths (gul og oransje) og mitokondrier (turkis), skalere 2 µm. (c og d) 3D-modellen, skala bar 2 µm og 500 nm . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59156/59156fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging at JoVE.com

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Her presenterer vi en protokoll for å kombinere to sample behandling teknikker, høytrykks frysing og mikrobølgeovn-assistert prøve behandling, etterfulgt av minimal harpiks innebygging for å skaffe data med en fokusert ion strålen scanning elektron mikroskop (FIB-SEM). Dette er demonstrert ved hjelp av en mus tibial nerve eksempel og Caenorhabditis elegans.

Biologiske utvalg forberedelse av høytrykks fryser, mikrobølgeovn-assistert kontrast ekstrautstyr og Minimal harpiks innebygging volum Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Denne prøveforberedelsesteknikken er designet for å kombinere den beste kvaliteten på ultrastrukturbevaring med den mest passende kontrasten for bildemodaliteten i et fokusert ionstråleskanningselektronmikroskop. Denne protokollen er spesielt nyttig for prøver som krever forberedelse av høytrykksfrysing for en pålitelig ultrastrukturbevaring, men ikke får nok kontrast under frysesubstitusjonen for volumavbildning. For minimal harpiksinnbygging er det viktig å fjerne så mye harpiks som mulig for å tillate riktig målretting senere i det fokuserte iionstråleskanningselektronmikroskopet.Til å begynne med, bruk pipetten til å dryppe en dråpe på 20% PVP PBS på skjærematten. Senk den dissekerte nervus tibialis i dråpen. Bruk skalpellen til å kutte to millimeter lengde på prøven.Bruk fine tang til å plassere prøven i en 0,2 millimeter dyp type A metall prøveholder. Overfør stativet til den midterste platen på sylinderampullen. Plasser den heksadekanbelagte type B-stativet på toppen som et lokk.Lukk enheten ved å senke den øvre halvdelen av kassetten. Lukk den tredelte patronen i lastestasjonen til høytrykksfryseren. Trykk på prosessknappen og fortsett i henhold til produsentens bruksanvisning.I et bad med flytende nitrogen, plasser prøvebærere i kryo hetteglass som inneholder to milliliter frosset 0,1% tanninsyre og aceton og lukk hettene. Plasser kryo hetteglassene i frysesubstitusjonsenheten satt til minus 90 grader Celsius. Start programmet og hold prøvene der i 100 timer.I fryseerstatningsenheten vask prøvene med to milliliter aceton tre ganger i 30 minutter. Plasser 2%osmiumtetroksid i 0,1% uranylacetat i frysesubstitusjonsenheten for nedkjøling og legg det til prøvene i syv timers fortsatt farging ved minus 90 grader Celsius. Når programtemperaturen i frysesubstitusjonsenheten når minus 20 grader Celsius, hold prøvene der inne i ytterligere 16 timer.Når temperaturen stiger til 4 grader Celsius, kast væsken i hetteglassene og fyll ut rent aceton. Fjern kryohettebrene fra frysesubstitusjonsenheten. Prøvehåndtering før frysing og etter osmofication er kritisk siden prøven kan bli alvorlig skadet.I en røykhette bruker du fine tang for å fjerne metallbærerne ut av kryoglassene og overføre prøvene fra bærerne for å nedsenke dem i en 150 millimeter dyp klokkeglassrett fylt med aceton. Bruk fine tang til å overføre prøvene til to milliliter reaksjonsrør fylt med aceton. Sett mikrobølgeovnen på 250 watt i 40 sekunder, og start mikrobølgeovnen for å vaske prøvene og gjenta fire ganger.Pipette en milliliter på 1% tiocarbohydrazide løsning i reaksjonsrøret og sette den i mikrobølgeovnen. Slå på vakuumfunksjonen med to minutter på og to minutter av, iterer i totalt 14 minutter og sett den på 150 watt. Start mikrobølgeovnen.Vask prøven fire ganger i aceton som tidligere. Pipette en milliliter på 2% osmium tetroxide løsning inn i reaksjonsrøret. Plasser prøven i mikrobølgeovnen og bruk de samme mikrobølgeinnstillingene som med tiokarkarhydrazid.Vask prøven fire ganger i aceton som tidligere. Pipette en milliliter 25% harpiks i aceton inn i reaksjonsrøret og legg den i mikrobølgeovnen. Slå på vakuumfunksjonen i tre minutter og sett den på 250 watt.Start mikrobølgeovnen. Bruk en tannpirker til å fjerne nervus tibialis ut av reaksjonsrøret og plassere dem på et stykke plastfilm. Plasser en halogenlampe nær prøvene for å varme opp harpiksen.Bruk en tannpirker til å skyve prøven forsiktig rundt på plastfilmen til ingen gjenværende harpiks oppdages. Sett plastfilmen med prøven på toppen i ovnen og sett temperaturen på 60 grader Celsius for å polymerisere prøvene i minst 48 timer. Bruk et barberblad til å kutte ut de polymeriserte prøvene sammen med plastfilmen i en størrelse som passer sem stubben.Bruk en tannpirker til å legge til ledende sølvharpiks på SEM stubs og feste de kuttede prøvene til den. Og legg deretter harpiks rundt prøvene. Sett SEM-stubbene i ovnen for å polymerisere ved 60 grader Celsius i minst 4 timer eller over natten.Etter polymerisering, plasser SEM-ene i et sputtercoater. Sett sputtercoateren på 35 milliampere og påfør 10 nanometer tykt gullbelegg eller frakk i ett minutt. Etter belegg plasserer du SEM-stubs inne i det fokuserte iionstråleskanningselektronmikroskopet.I denne studien ble det utført en forbedret protokoll for nervus tibialis av musen, samt C.elegans for å illustrere optimal bevaring og kontrast for å utføre 3D-volumavbildning med et fokusert ionstråleskanningselektronmikroskop. Standardprotokoller lider ofte av mangel på membrankontrast der den forbedrede protokollen gir en sterk membrankontrast. Tverrsnittsbildene av C.elegans med forbedret protokoll og standardprotokoll viser en særegen forskjell.I tillegg til for tverrsnittsbildene av nervus tibialis, bidrar den forbedrede protokollen til å vise en sterkere membrankontrast sammenlignet med standardprotokoll. Etter etterbehandling visualiseres elektronmikroskopdataene ved hjelp av IMOD, et bildebehandlings- og modelleringsprogram. Det blåuthevede området viser segmenterte aksoner.Det røduthevede området viser Remak-buntene. De gul-og oransje-uthevede områdene viser myelinhylser. Og det turkise-uthevede området viser mitokondrier.Virtuell reslicing og den tredimensjonale modellen illustrerer finvevsarkitekturen og bidrar til å forstå funksjonen. Andre volumskanning elektronmikroskopi metoder kan brukes, samt seriell blokk-ansikt skanning elektron mikroskopi og array tomografi. Denne protokollen kan også brukes til overføring elektron mikroskopi og andre prøvetyper som prøver fra sentralnervesystemet.Osmiumtetroksid, tiokarbohydrozid og uranylacetat er giftige kjemikalier og bør brukes forsiktig. Harpiksen er også skadelig og bør brukes med forsiktighet. Personlig verneutstyr som hansker og laboratoriefrakk bør brukes for hele protokollen.

Research

JoVE Journal

Biology

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Microwave-assisted One-pot Synthesis of N-succinimidyl-4-[18F]fluorobenzoate ([18F]SFB)

Microwave-assisted One-pot Synthesis of N-succinimidyl-4-[18F]fluorobenzoate [18F]SFB

Biomolecules, including peptides,1-9 proteins,10,11 and antibodies and their engineered fragments,12-14 are gaining importance as both potential ...

Preparation, Purification, and Characterization of Lanthanide Complexes for Use as Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging

Polyaminopolycarboxylate-based ligands are commonly used to chelate lanthanide ions, and the resulting complexes are 
useful as contrast agents for ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Prøvepreparering for mikroskopi av enkeltvirionakroskopi og superoppløselig fluorescensavbildning

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Sporing av Hematopoietiske Stem og stamceller i Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Tandem Høytrykks Frysing og Quick Freeze Bytte av plantemateriale for transmisjonselektronmikroskopi

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging

ACT-PRESTO: biologisk vev Clearing og Immunolabeling Metoder for Volum Imaging

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in ...

Volume Segmentation and Analysis of Biological Materials Using SuRVoS (Super-region Volume Segmentation) Workbench

Volume Segmentation and Analysis of Biological Materials Using SuRVoS Super-region Volume Segmentation Workbench

Volum segmentering og analyse av biologisk materiale med SuRVoS (super regionen volum segmentering) Workbench

Segmentation is the process of isolating specific regions or objects within an imaged volume, so that further study can be undertaken on these areas of ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Eksempel forberedelse og bildebehandling for Exosomes av overføring elektronmikroskop

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...