Name: biological sample preparation by high-pressure freezing, microwave-assisted contrast enhancement, and minimal resin embedding for volume imaging
Uploaded: 2019-03-19T14:45:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging at JoVE.com

A FIB-SEM e A.S. (posição do operador FIB-SEM) são financiados pelo Cluster de excelência e microscopia de escala nanométrica de centro de pesquisa Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) e fisiologia Molecular do cérebro (CNMPB). Agradecemos ao laboratório de Thomas Müller-Reichert pelo fornecimento das amostras de c. elegans . Agradecemos Ulrich Weikert para participar no filme.

Todos os experimentos, incluindo amostras de animais descritos aqui foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e do escritório de estado Baixa Saxônia para proteção do cliente e segurança de alimentos (elevam).
1. alta pressão substituição de congelamento e freeze
<ol><li>Disse o tibial nervus de um rato (por exemplo, C57Bl6N, 12 semanas, fêmea)9.</li>
	<li>Mergulhe o nervus tibial em uma gota de polivinilpirrolidona 20% (1 g de PVP em 5 mL) em salina tamponada fosfato (PBS) e corte em pedaços de 2 mm de comprimento. Em seguida, colocá-lo em um portador de amostra de metal (tipo A, 0,2 mm de profundidade) usando a pinça fina. Adicionar outra transportadora plana (tipo B) revestida com uma camada fina de hexadecano como uma tampa e insira o cartucho de espécime este assembly.</li>
	<li>Transferência de vários c. elegans , suspenso em uma gota de 20% albumina de soro bovino (BSA) em M9 (ver Tabela de materiais) com uma pipeta descartável de plástico no suporte metálico (tipo A). Em seguida, adicionar uma segunda transportadora como tampa em cima (tipo B) e montar o cartucho.</li>
	<li>Para ambas as amostras, prossiga com o seguinte: de alta pressão congelar os assemblies de transportador de amostra um por um por carregá-los dentro do cartucho três peças na estação de carregamento do congelador de alta pressão. Prima o botão de acordo com o manual de instruções do fabricante. Nota: Ambos os tipos de amostras podem ser processados juntos na substituição posterior congelamento.</li>
	<li>Coloca as amostras em cryovials contendo 2 mL de congelados ácido tânico de 0,1% em acetona. Realizar a transferência em um banho de nitrogênio líquido sem derramar o nitrogênio líquido em frascos. Transferir o cryovials em um conjunto de10 unidade de substituição automática de congelar a-90 ° C e iniciar o programa. Nota: As amostras são mantidas a-90 ° C para 100 h. ácido tânico, antes de osmification é usado como mordente para aumentar a absorção de tetróxido de ósmio11.</li>
	<li>Lavar manualmente as amostras 3 x por 30 min com 2 mL de acetona a-90 ° C na unidade de substituição de congelamento.</li>
	<li>Deixar as amostras em 2 mL de tetróxido de ósmio de 2%, 0,1% acetato de uranilo em acetona para coloração permanente em automático congelar a unidade de substituição para 7 h a-90 ° C. Cuidado: tetróxido de ósmio é tóxico e deve ser tratada sob uma coifa, e devem ser usados equipamentos de proteção. Nota: A unidade de substituição de congelar automaticamente gera a temperatura de-20 ° C a 5 ° C/h. As amostras são mantidas a-20 ° C durante 16 h na unidade de substituição de congelamento. A temperatura será gerada automaticamente para 4 ° C a 10 ° C/h.</li>
	<li>Trocar a solução de tetróxido de ósmio com acetona pura, quando a temperatura chegou a 4 ° C. Retire a cryovials da unidade de substituição de congelamento.</li>
</ol>2. processamento assistida por microondas
Nota: Executar todas as etapas a seguir na temperatura12 usando uma unidade de controle de temperatura para manter a temperatura estável (veja a Tabela de materiais).
<ol><li>Deixe as tampas dos tubos de reação aberta durante o processamento no microondas.</li>
	<li>Pegue as transportadoras de metal amostra fora o cryovials e remover as amostras do metal porta usando a pinça fina ou uma agulha, mantendo as amostras submergidas na acetona em um prato de vidro de relógio (150 mm).</li>
	<li>Transferir as amostras em tubos de reação 2ml usando pinça fina ou uma pipeta e lavar com 1 mL de acetona, quatro vezes por 40 s em 250 w. Atenção: Thiocarbohydrazide é tóxico e deve ser tratada sob uma coifa, equipamentos de proteção devem ser usados.</li>
	<li>Mancha de amostras com 1 mL de thiocarbohydrazide de 1% em acetona para 14 min 150 W para aumentar o contraste. Para executar a coloração, pipetar a solução thiocarbohydrazide para o tubo de reação, colocar o tubo no microondas e definir o programa para um nível de potência de 150 W (com a função de vácuo ligada) por 2 min no/2 min fora, Iterando por total 14 min. Inicie o microondas. Nota: Thiocarbohydrazide reage com o tetróxido de ósmio que foi aplicado durante a substituição de congelamento. Forma uma ponte, permitindo mais tetróxido de ósmio, a ser depositado para o original de sites de tetróxido de ósmio13.</li>
	<li>Lavar as amostras 4 x com 1 mL de acetona para 40 s em 250 w. pipeta a acetona em um tubo de reação, colocar o tubo no microondas e selecione 250 W para 40 s. iniciar o microondas.</li>
	<li>Mancha em 1 mL de tetróxido de ósmio de 2% em acetona para 14 min 150 w. pipeta a tetróxido de ósmio solução num tubo de reação, colocar o tubo no microondas e definir o programa para um nível de potência de 150 W (com a função de vácuo ligado) por 2 min no/2 min fora , Iterando por total 14 min. Inicie o microondas.</li>
	<li>Lavar as amostras 4 x com 1 mL de acetona para 40 s em 250 W (como feito na etapa 2.5).</li>
	<li>Infiltrar-se com 1 mL de concentrações crescentes de resina em acetona (ver Tabela de materiais) de 25%, 50%, 75%, 90%, 100% e 100% por 3 min em 250 w. pipeta a resina em um tubo de reação, colocar o tubo no microondas e definir o programa para um nível de energia l de 250 W (com a função de vácuo ligado) por 3 min. iniciar o microondas.</li>
</ol>3. mínima resina incorporação8
<ol><li>Tire o nervo tibial e o c. elegans do tubo de reação com um palito e coloque-os em um pedaço de plástico film (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Use o palito para empurrar suavemente a amostra em torno do filme plástico até sem resina restante é detectada. Use uma lâmpada de halogéneo para aquecimento (ver Tabela de materiais) para que a resina torna-se menos viscosa e é capaz de ser removido mais facilmente. A lâmpada de halogéneo de lugar perto o suficiente para aquecer a resina (tomando cuidado para não queimar as mãos).</li>
	<li>Polimerizar as amostras pelo menos 48 h a 60 ° C, em cima de filme plástico no forno.</li>
</ol>4. preparação para FIB-SEM
<ol><li>Cortar as amostras polimerizadas juntamente com o filme plástico usando uma lâmina de barbear em um tamanho apropriado o esboço SEM e anexá-los para os stubs SEM usando uma resina condutiva de prata (consulte Tabela de materiais). Polimerizar novamente a 60 ° C, durante pelo menos 4 horas ou durante a noite.</li>
	<li>Revestimento por pulverização catódica as amostras na SEM de stub com ouro por 1 min em 35 mA usando um aplicador por pulverização catódica (platina/paládio também pode ser usado; um revestimento de espessura 10 nm é suficiente) e colocá-las dentro do FIB-SEM.</li>
</ol>5. aquisição dentro o FIB-SEM
<ol><li>As amostras de imagem com o detector de elétron secundário usando o software básico, dirigindo o microscópio (ver Tabela de materiais). A amostra deve ser orientada para que a região de interesse (por exemplo, parte do meio do nervo tibial ou o c. elegans) é o campo de visão. Nota: Para executar a aquisição de dados, incline o palco para uma posição até que a amostra de enfrenta o feixe de íons em um ângulo de 90° em uma distância de trabalho adequada (5 mm) no ponto chamado coincidência do feixe de íons e elétrons. Usando nosso instrumento, isto é conseguido em uma inclinação de palco de 54° e distância de trabalho de 5 mm.</li>
	<li>Para configurar a posição correta da amostra, centro de uma característica comum em uma inclinação de 0°, enquanto a imagem com o detector de elétron secundário. Lentamente inclinação para 54° (5°, 20°, 54°), função de recentragem do mesmo objeto movendo o eixo-M.</li>
	<li>Encontre o ponto de coincidência de centralizar um recurso ao mesmo tempo a imagem com o detector de elétron secundário a 54°, seguido por mover o recurso para a posição central no modo FIB. Execute esta exibindo a mira no software SEM ter uma indicação do centro. Primeiro mova o recurso de amostra seleccionada para o centro da área de imagem usando a função de ponto centro do software SEM. Então o centro do recurso ao longo do eixo y, movendo o palco em z. Qualquer deslocamento final entre FIB e SEM é corrigido com a mudança do feixe SEM.</li>
	<li>Abra o software avançado (ver Tabela de materiais) para gravação de conjuntos de dados 3D e siga o assistente de software passo a passo.</li>
	<li>Na região de interesse, o depósito de carbono ou platina (400 nm) em cima do ROI usando um 3 nA atual para permitir nem trituração e reduzir artefatos induzida pelo carregamento. Nota: Desenhando-se a região de interesse para ser moído na superfície do espécime fotografada com o FIB (largura, altura, profundidade), o software calcula e sobrepõe os tamanhos das características de preparação de amostra diferentes, tais como as trincheiras para ser moída ou área para deposição de platina/carbono. Também, ser cauteloso em termos de imagens da superfície da amostra com correntes FIB demasiado alta, como isto pode danificar a superfície da amostra. Uma corrente do pA 50 é suficiente para a imagem latente.</li>
	<li>Use o feixe de íon focalizado para moer uma trincheira para expor a região de interesse (ROI) usando uma corrente de at 15/30.</li>
	<li>Use o feixe de íon focalizado para polir a secção transversal com um 7 nA atual.</li>
	<li>Depois de terminar a preparação da amostra, configurar os seguintes parâmetros de imagem: FIB moagem parâmetros na guia Configuração FIB (FIB moagem atual); SEM imagem parâmetros na aba configuração e a imagem, ajuste de parâmetros na guia SEM AutoTune (executar autofocus e autostigmation cada 60 min, 50 nm pixel tamanho, tempo de interrupção 3, linha média 3). Otimize isto para cada amostra.</li>
	<li>Para evitar qualquer deriva térmica, causando a bloco-face à deriva durante a execução, deixe a sala pelo menos 2 h antes de iniciar a aquisição.</li>
	<li>Adquirir o dataset em um moinho contínuo e adquirir o modo com um pA 700 FIB atual. Uso de 1,5 kV (modo analítico, 900 V) detector de ESB com uma tensão de rede 400 V para adquirir imagens de cada um com 5 tamanho de pixel de nm, usando o software avançado (ver Tabela de materiais) e espessura da fatia 50 nm. Uma aquisição de imagens leva cerca de 1,5 min com um tempo de interrupção de 6 µs.</li>
	<li>Inicie a aquisição de dados. Uma imagem FIB na moagem atual é adquirida para garantir que a amostra não se mexeu, e a certa região de interesse é Selecionadoda. Ajuste se necessário.</li>
</ol>6. visualização de dados
<ol><li>Abrir imagens em Fiji, arrastando a pasta que contém todas as imagens em Fiji e selecione Pilha Virtual.</li>
	<li>Cortar a região de interesse, usando a ferramenta retângulo (Image > Crop).</li>
	<li>Inverter os dados para mostrar o contraste de microscopia eletrônica de transmissão tradicionais com membranas aparecendo no escuro (Editar > Inverter).</li>
	<li>Use TrackEM214 (Fiji15) para alinhamento. Carregar os dados no TrackEM2 (arquivo > Novo > TrackEM2), clicando em camada. Depois de todas as imagens são carregadas, alinhá-los usando a função mosaico multi camada (botão direito do mouse em imagem > Align > alinhar multi-camada mosaico). Após o alinhamento, as imagens são exportadas como arquivos tiff-individuais (botão direito do mouse em imagem > Exportar > fazer imagem plana). Selecione todas as imagens que devem ser exportadas e escolha salvar em arquivo.</li>
	<li>Para pós-processamento, use um Gaussian blur (processo > Filtros > Desfoque Gaussiano; sigma 2) e realce de contraste local (processo > melhorar o contraste Local; CLAHE: blocksize 127, escaninhos histograma 256, inclinação máxima 1,5), que são aplicados em Fiji para suavizar a imagem e obter uma melhor relação sinal-ruído.</li>
	<li>IMOD16 é usado para executar uma segmentação manual e visualizar a estrutura de interesse em 3D. Abra o dataset no IMOD e selecionar ferramentas de desenho (especiais > ferramentas de desenho) para realizar a segmentação manual. Ferramentas manuais diferentes podem ser usadas para seguir a estrutura de interesse em todo o volume (por exemplo Join, Sculpt). Use o navegador de imagem de microscopia (MIB17) para segmentação semi-automática.</li>
</ol>

<ol>
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Não há conflitos de interesse declarados.

O protocolo foi desenvolvido para ilustrar a óptima preservação e contraste para realizar a imagem de bloco-rosto serial com um FIB-SEM. Portanto, optamos por aplicar cryo-imobilização seguido por pós-coloração usando substituição de congelamento e processamento assistida por microondas. Portanto, este protocolo é limitado para amostras que são pequenas o suficiente para o congelamento de alta pressão. As limitações de tamanho de 3 a 6 mm de largura e espessura de ~ 200 µm são estabelecidas pelo tamanho do porta-amostra, que coincide com o tamanho de amostra que pode ser devidamente congelado com esta técnica. Isto é relevante para a amostra de nervos de rato, desde que o nervo ciático é muito grande em diâmetro para se encaixar as operadoras de 0,2 mm que são necessários para assegurar o congelamento adequado. Portanto, recomenda-se a dissecção cuidadosa de um nervo menor como o nervo tibial ou outro nervo fino como o nervo femoral. Desde que a bainha de mielina é sensível ao alongamento, grande deve ter cuidado durante a dissecção do nervo fresco e viável para evitar a manipulação de artefatos. Em geral, apenas viáveis amostras devem ser usadas para estudos microscópicos de elétron.
Assistida por microondas processamento e incorporação de resina mínima são projetados para acelerar a preparação e orientação de processo. O processamento assistida por microondas, aplicando um protocolo modificado o OTO4 é usado para fixação química de temperatura. Um microondas doméstico não irá produzir os mesmos resultados, uma vez que não há nenhuma distribuição homogénea das microondas, sua temperatura não é controlada e não há nenhum vácuo que pode ser aplicado. O menor, por exemplo, a melhor penetração dos produtos químicos; Portanto, os melhores resultados são alcançados por amostras menores. Para evitar danos à amostra por superaquecimento, controle de temperatura e aplicação a minimamente necessária potência do microondas são críticos. As etapas de processamento assistida por microondas podem ser executadas no banco se não houver nenhum microondas disponíveis, que levarão a mais longos tempos de processamento. Para estruturas de destino diretamente no SEM, é crucial remover resina tanto quanto possível do topo da amostra. Após a gravação de um conjunto de dados, pós-processamento dos dados brutos é necessário reduzir o tamanho do arquivo e melhorar a relação sinal-ruído. Técnicas de imagem moderna volume produzem grandes quantidades de dados. Portanto, para executar o processamento de dados de forma rápida e suficiente, RAM suficiente na estação de trabalho é necessário. Para operações de alinhamento pelo menos duas vezes mais RAM como o tamanho do conjunto de dados é necessário.
Este protocolo foi testado sobre o nervo tibial do mouse, bem como em c. elegans. Hall et al.. 12 usado um passo semelhante de realce após sua substituição de congelamento no banco para a preparação de c. elegans. Para qualquer outro organismo modelo tais como o peixe-zebra, ajustes do protocolo são provavelmente necessária. Uma modificação possível é mudar a composição do coquetel, tais como congelar substituição pela adição de água que é usada para realce de contraste18. Além disso, a duração da substituição congelamento deve ser adaptada à amostra e pode ser reduzida consideravelmente de acordo com a substituição de congelamento rápido protocolo19. Uma possibilidade é a aplicação de agitação para acelerar a substituição de congelar processo20. Após a substituição de congelamento, mais modificações são possíveis, tais como a aplicação repetida de melhorar produtos químicos e tetróxido de ósmio21. Durante o processamento de microondas, a temperatura, tempos de incubação e as configurações de energia podem ser variadas para otimizar os resultados para a respectiva amostra.
Este protocolo mostra que tal um aprimoramento pode ser combinado com outros protocolos de substituição de congelamento e diferentes tipos de amostras conforme descrito por Hall12 que são fotografadas em um FIB-SEM ou por microscopia eletrônica serial bloco-rosto. Estas técnicas de imagem exigem maior contraste, que é menos importante para microscopia eletrônica de transmissão.

Congelamento de alta pressão é o método de preparação de amostra de escolha para a obtenção de preservação ultraestrutural de alta qualidade, que representa o estado nativo de uma amostra muito melhor do que os métodos de preparo convencional utilizando fixação química1. Este método de cryo-preparação é útil para amostras como rato mielinizadas tecido2 e uma exigência rigorosa para uso do organismo modelo elegans de Caenorhabditis3. Depois da substituição de congelamento e incorporação de resina, estas amostras são geralmente analisadas por microscopia eletrônica de transmissão (TEM) ou tomografia de elétrons (ET). Se volumes maiores devem ser fotografadas usando FIB-SEM ou imagem de rosto-bloco serial para reconstruções 3D em grande escala de alta resolução, em nossa experiência a imagem apropriada por SEM muitas vezes é dificultada pela falta de contraste. No FIB-SEM, a imagem é geralmente gravada por detecção de elétrons retroespalhados do feixe primário. O rendimento de elétrons retroespalhados é proporcional ao conteúdo de metais pesados na amostra. Portanto, protocolos foram projetados especialmente para o volume de imagens para realçar o contraste por impregnação adicional de heavy metal. Tais métodos são baseados em amostras quimicamente fixas e aplicam uma combinação de tetróxido de ósmio tetróxido de ósmio-thiocarbohydrazide4, conforme descrito por Knott et al.5, para o bloco serial-rosto e focada feixe de íons, microscopia eletrônica. Modificações, incluindo o uso de formamida e pirogalol6 ou chumbo aspartato7 foram aplicadas com sucesso para diferentes técnicas de imagem.
O protocolo fornecido aqui combina o cryo-preparação de amostras por HPF e congelar a substituição com subsequente assistida por microondas para maior contraste usando o tetróxido de ósmio/thiocarbohydrazide em acetona à temperatura de processamento. Demonstramos isso sobre o tibial nervus mielinizadas de ratos e em Caenorhabditis elegans, que representam amostras que necessitam de alta pressão, congelamento por preservação ultraestrutural de alta qualidade. Além disso, é mostrado como, após a desidratação e infiltração, as amostras são incorporadas com como pouco resina quanto possível. Esta resina mínima incorporação8 permite a segmentação mais rápido da estrutura de interesse e reduz o tempo gasto no processamento da amostra, incluindo menos tempo necessário para expor a região de interesse com o feixe de íons. Depois de realizar mais etapas de preparação de amostra dentro do microscópio, imaging e moagem da amostra é realizado continuamente para adquirir uma pilha de imagens. Para visualização 3D, software (IMOD) de processamento de imagem é usada para reconstruir partes do conjunto de dados.
Nosso fluxo de trabalho descreve como o contraste mais adequado de amostras para a imagem latente de volume pode ser combinado com a melhor preservação ultraestrutural por substituição HPF e congelar. Isso é útil para amostras que requerem estritamente cryo-preparação. Aplicativos são limitados a pequenas amostras que podem ser preparadas por HPF. Em amostras de diferentes naturezas, tais como materiais vegetais ou microrganismos, este protocolo requer adaptação.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Instrumentation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica HPM100</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Freeze Substitution</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory microwave with temperature control unit</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM ACE600 with gold target</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crossbeam 540</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halogen lamp 12 V/ 20 W</td>
			<td>Osram</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>According to C. Elegans- A practical approach I.A.Hope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadecene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>52276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A type carrier</td>
			<td>Wohlwend GmbH</td>
			<td>#241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B type carrier</td>
			<td>Wohlwend GmbH</td>
			<td>#242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slit carrier</td>
			<td>Wohlwend GmbH</td>
			<td>#446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pasteur pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-1684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11200-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze substitution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>science services</td>
			<td>10015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tannic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>403040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>EMS</td>
			<td>19100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>SPI-Chem</td>
			<td>02624-AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>EMS</td>
			<td>10015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>223220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc CryoTubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V7884-450EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Watch glass dishes, 150 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-2189H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan resin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEM stubs</td>
			<td>Science Services</td>
			<td>E75200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aclar</td>
			<td>Science Services</td>
			<td>50425-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpicks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>512-3618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conductive silver resin</td>
			<td>EMS</td>
			<td>12670-EE</td>
			<td>EPO-TEK EE 129-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>SmartSEM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Atlas5 A3D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing</td>
			<td>Open source</td>
			<td>Fiji</td>
			<td>http://fiji.sc/#download</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image visualization</td>
			<td>Open source</td>
			<td>IMOD</td>
			<td>http://bio3d.colorado.edu/imod/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biological sample preparation by high-pressure freezing, microwave-assisted contrast enhancement, and minimal resin embedding for volume imaging

A técnica de preparação de amostra descrita é projetada para combinar a melhor qualidade de preservação ultra-estruturais com o contraste mais adequado para a modalidade de imagem em um íon focalizado feixe microscópio eletrônico de varredura (FIB-SEM), que é usado para obter pilhas de imagens sequenciais de reconstrução 3D e modelagem. De alta pressão frio (HPF) permite perto de preservação estrutural nativa, mas congela a subsequente substituição muitas vezes não oferece contraste suficiente, especialmente para uma amostra maior, que é necessária para a imagem latente de alta qualidade na SEM necessária para 3D reconstrução. Portanto, neste protocolo, após a substituição de congelamento, etapas adicionais contrastantes são realizadas à temperatura ambiente. Embora essas etapas são executadas em um microondas, também é possível acompanhar o processamento de banco tradicional, que exige mais tempo tempos de incubação. A subsequente incorporação em quantidades mínimas de resina permite mais rápido e mais preciso direcionamento e preparação dentro o FIB-SEM. Este protocolo é especialmente útil para amostras que exigem a preparação de congelamento de alta pressão para uma preservação ultraestrutural confiável mas não ganho de contraste suficiente durante a substituição de congelamento para a imagem latente de volume usando o FIB-SEM. Em combinação com a incorporação de resina mínima, este protocolo fornece um fluxo de trabalho eficiente para a aquisição de dados de volume de alta qualidade.

O fluxo de trabalho inicia com uma amostra (aqui, um rato recém dissecado nervus tibial) sendo colocados em suportes de metal para congelamento de alta pressão (Figura 1a). As transportadoras são recuperadas do nitrogênio líquido (Figura 1b) e colocadas em uma unidade de substituição de congelamento no topo congelado primeiro produto químico cocktail (Figura 1C). Após um longo congela protocolo de substituição incluindo acetato de uranilo de tetróxido de ósmio e 0,1% de 2%, as amostras são removidas das transportadoras que à temperatura ambiente (Figura 1D). Para aumentar ainda mais o contraste, as amostras são transferidas para tubos de plástico para serem processados no microondas (Figura 1e). A câmara de vácuo e unidade de controle de temperatura são usados para otimizar o processo (Figura 1f).
Para ser capaz de realizar a incorporação mínima da resina, palitos de dente e folhas de filme plástico são necessários (Figura 2a). Depois infiltrando as amostras com resina usando o microondas, eles são colocados em pedaços de filme plástico e movimentados até não sobrar nenhuma resina sobre a superfície da amostra. Uma lâmpada de halogéneo é usada para ajudar a drenar a resina restante e deixar a amostra minimamente incorporada (Figura 2b) sobre o filme plástico. Deve notar-se que a resina mais removida do topo da amostra é boa. Ainda deve haver uma pequena quantia deixada debaixo da amostra para mantê-lo ligado ao substrato. A amostra ser polimerizada em filme plástico é cortada e montada em cima de esboço SEM com resina condutiva prata (Figura 2C). O esboço é polimerizado pelo menos 4 h a 60 ° C (Figura 2d). Os componentes devem ser misturados completamente ou a mistura não pode polimerizar-se corretamente. Para evitar o carregamento dentro do microscópio eletrônico de varredura, o esboço é por pulverização catódica, revestida com ouro ou platina/paládio (Figura 2e).
As amostras são colocadas no FIB-SEM e fotografadas com um detector de elétron secundário para a região de interesse (Figura 3ae) de destino. Um feixe de íons é usado para remover o material diretamente na frente da região de interesse para expor uma seção transversal (Figura 3b-d, 3f-h). Protocolos padrão muitas vezes sofrem com a falta de contraste de membrana (Figura 3bf), Considerando que o protocolo avançado fornece um contraste forte membrana (Figura 3 c-d, 3-g-h).
Os dados EM (depois pós-processamento) são visualizados usando IMOD, uma processamento de imagens e programa de modelagem. Para obter uma melhor compreensão das informações 3D, reslicing virtual dos dados é usado (figura 4a). Estruturas diferentes do conjunto de dados são segmentadas manualmente (figura 4b-d).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59156/59156fig1.jpg"> Figura 1: de alta pressão, congelamento, congelar-substituição e processamento assistida por microondas. (a) da amostra portador contendo o rato nervus tibial, escala bar 3 mm. transportadora (b) amostra contendo o rato nervus tibial após alta pressão congelação, escala bar 3 mm. (c) automático congelar substituição (AFS) unidade com amostras. Baixo-relevo: recipiente de metal sob medida para até 23 frascos de amostra e dois frascos grandes que contenham produtos químicos no AFS. (d) amostras sendo removidas do porta-aviões em um prato de vidro em acetona, escala bar 3 mm. (e) amostras em tubos de reação, para ser colocado no microondas para processamento. unidade (f) controle de temperatura e câmara de vácuo do microondas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59156/59156fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59156/59156fig2.jpg"> Figura 2: resina mínima incorporação e preparação para o FIB-SEM. (a) plástico filme e palitos de dentes que são usados para a incorporação mínima de resina, escala bar 4 cm. (b) nervo tibial drenado de resina em cima de filme plástico, escala bar 250 µm. (c) nervo tibial polimerizado em filme plástico, em seguida, cortar e montado sobre o esboço SEM com resina condutiva de prata, escala bar 250 µm. (d) amostras polimerizadas em cima do esboço SEM, escala bar 3 mm. (e) amostras revestidas com ouro sobre o esboço de SEM, escala bar 3 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59156/59156fig2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59156/59156fig3.jpg"> Figura 3: preparação da amostra dentro o FIB-SEM. (a e e) Imagem de elétrons secundários dentro o FIB-SEM da amostra de superfície (a) nervo tibial, escala bar 100 µm. (e) c. elegans, escala bar 2 µm. (b-d) e (f-h) secção transversal através de amostra usando o detector de ESB para a imagem latente. (b e c) Nervo tibial, escala bar 2 µm. (f e g) c. elegans, escala bar 1 µm e 200 nm. (b e f) São mostrados os resultados de congelamento de alta pressão e congelamento de substituição sem realce, Considerando que todas as outras imagens mostram resultados da substituição de congelamento reforçada. (d e h) Imagem detalhada da amostra usando o detector do ESB. (d) nervo tibial, escala bar 200 nm. (h) c. elegans, escala bar 200 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59156/59156fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59156/59156fig4.jpg"> Figura 4: aquisição e visualização de imagem. (a) dados do EM mostrado no IMOD com virtualmente resliced x / y/z-planos e z - escala bar 2 µm. (b) segmentado axônios EM dados (azuis), Remak bundles (vermelhos), bainhas de mielina (amarelo e laranja), e as mitocôndrias (turquesas), escala bar 2 µm. (c e d) modelo 3D, escala bar 2 µm e 500 nm . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59156/59156fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Aqui nós apresentamos um protocolo para a combinação de duas técnicas de processamento de amostra, de alta pressão congelamento e processamento de amostra assistida por microondas, seguido por resina mínima incorporação para a aquisição de dados com um íon focalizado feixe microscópio eletrônico (FIB-SEM). Isso é demonstrado usando uma amostra do nervo tibial de rato e Caenorhabditis elegans.

Preparação de amostras biológicas por congelamento de alta pressão, realce de contraste assistida por microondas e resina mínima incorporação para a imagem latente de Volume

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Esta técnica de preparação de amostras foi projetada para combinar a melhor qualidade de preservação da ultraestrutura com o contraste mais adequado para a modalidade de imagem em um microscópio eletrônico de varredura de feixe de íons focado. Este protocolo é especialmente útil para amostras que requerem preparação por congelamento de alta pressão para uma preservação confiável da ultraestrutura, mas não obter contraste suficiente durante a substituição de congelamento por imagens de volume. Para a incorporação mínima de resina, é essencial remover o máximo de resina possível para permitir o direcionamento adequado mais tarde no microscópio eletrônico de varredura de feixe de íons focalizado.Para começar, use a pipeta para gotejar uma gota de PBS PVP de 20% no tapete de corte. Mergulhe o nervus tibialis dissecado na gota. Use o bisturi para cortar o comprimento de dois milímetros da amostra.Use fórceps finos para colocar a amostra em um porta-amostras metálicas tipo A de 0,2 milímetros de profundidade. Transfira o porta-aviões para a placa do meio do cartucho. Coloque o portador tipo B revestido de hexadecano na parte superior como uma tampa.Feche o conjunto baixando a metade superior do cartucho. Feche o cartucho de três peças na estação de carregamento do congelador de alta pressão. Pressione o botão do processo e proceda de acordo com as instruções de funcionamento do fabricante.Em um banho de nitrogênio líquido, coloque os portadores de amostras em frascos criográficos contendo dois mililitros de ácido tânnico congelado e acetona e feche as tampas. Coloque os frascos criográficos na unidade de substituição de congelamento fixada a menos 90 graus Celsius. Inicie o programa e mantenha as amostras lá por 100 horas.Na unidade de substituição congelante, lave as amostras com dois mililitros de acetona três vezes por 30 minutos. Coloque 2%de tetroxida de mossmium em acetato de urânyl de 0,1% na unidade de substituição de congelamento para resfriamento e adicione-o às amostras para uma coloração contínua de sete horas a menos 90 graus Celsius. Quando a temperatura do programa na unidade de substituição de congelamento atingir menos 20 graus Celsius, mantenha as amostras lá por mais 16 horas.Quando a temperatura subir para 4 graus Celsius, descarte o líquido nos frascos e preencha a acetona pura. Remova os frascos criográficos da unidade de substituição de congelamento. O manuseio da amostra antes de congelar e depois da osmoficação é fundamental, uma vez que a amostra pode ser severamente danificada.Em um capô de fumaça, use fórceps finos para remover os carregadores de metal dos frascos criogenos e transfira as amostras dos portadores para submerse-as em um prato de vidro de relógio de 150 milímetros cheio de acetona. Use fórceps finos para transferir as amostras em dois tubos de reação mililitros cheios de acetona. Coloque o micro-ondas em 250 watts por 40 segundos e inicie o micro-ondas para lavar as amostras e repita quatro vezes.Pipeta um mililitro de solução de 1%thiocarbohydrazida no tubo de reação e colocá-lo no micro-ondas. Ligue a função de vácuo com dois minutos de funcionamento e dois minutos de folga, iterando por um total de 14 minutos e coloque-a em 150 watts. Ligue o micro-ondas.Lave a amostra quatro vezes em acetona como anteriormente. Pipeta um mililitro de solução de tetroxida de 2%de ósmio no tubo de reação. Coloque a amostra no micro-ondas e use as mesmas configurações de micro-ondas que com o tiocarbohydrazida.Lave a amostra quatro vezes em acetona como anteriormente. Pipeta um mililitro de 25% de resina em acetona no tubo de reação e colocá-lo no micro-ondas. Ligue a função de vácuo por três minutos e coloque-a em 250 watts.Ligue o micro-ondas. Use um palito para remover o nervus tibialis do tubo de reação e colocá-los em um pedaço de filme plástico. Coloque uma lâmpada halógena perto das amostras para aquecer a resina.Usando um palito, empurre suavemente a amostra ao redor do filme plástico até que nenhuma resina restante seja detectada. Coloque o filme plástico com a amostra em cima no forno e coloque a temperatura em 60 graus Celsius para polimerizar as amostras por pelo menos 48 horas. Use uma lâmina de barbear para cortar as amostras polimerizadas juntamente com a filme de plástico em um tamanho que se encaixa no stub SEM.Use um palito para adicionar resina de prata condutiva nos stubs SEM e anexar as amostras cortadas a ele. E então adicionar resina ao redor das amostras. Coloque os stubs SEM no forno para polimerizar a 60 graus Celsius por pelo menos 4 horas ou durante a noite.Após a polimerização, posicione os stubs SEM em um revestimento de sputter. Coloque o cabador de sputter em 35 miliamperes e aplique 10 nanômetros de revestimento dourado ou casaco por um minuto. Após o revestimento, coloque os stubs SEM dentro do microscópio eletrônico de varredura de feixe de íons focado.Neste estudo, foi realizado um protocolo aprimorado para nervus tibialis do camundongo, bem como C.elegans para ilustrar a preservação ideal e contraste para realizar imagens de volume 3D com um microscópio eletrônico de varredura de feixe de íons focalizado. Protocolos padrão muitas vezes sofrem de falta de contraste de membrana, enquanto o protocolo aprimorado fornece um forte contraste de membrana. As imagens de seção transversal de C.elegans com protocolo aprimorado e protocolo padrão mostram uma diferença distinta.Assim como para as imagens de seção transversal de nervus tibialis, o protocolo aprimorado ajuda a mostrar um contraste de membrana mais forte em comparação com o protocolo padrão. Após o pós-processamento, os dados do microscópio eletrônico são visualizados usando iMOD, um programa de processamento e modelagem de imagens. A área de destaque azul mostra axônios segmentados.A área de destaque vermelho mostra os pacotes Remak. As áreas de destaque amarelo e laranja mostram baias de mielina. E a área de destaque para turquesa mostra mitocôndrias.A relicção virtual e o modelo tridimensional ilustram a arquitetura de tecido fino e ajudam a entender sua função. Outros métodos de microscopia eletrônica de varredura de volume podem ser usados, bem como microscopia eletrônica de varredura em bloco serial e tomografia de matriz. Este protocolo também pode ser usado para a microscopia eletrônica de transmissão e outros tipos de amostra, como amostras do sistema nervoso central.Tetroxida de ósmio, tiocarbohidrozida e acetato de urânyl são produtos químicos tóxicos e devem ser usados cuidadosamente. A resina também é prejudicial e deve ser usada com cuidado. Equipamentos de proteção individual, como luvas e jaleco devem ser usados para o protocolo completo.

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