Name: biological sample preparation by high-pressure freezing, microwave-assisted contrast enhancement, and minimal resin embedding for volume imaging
Uploaded: 2019-03-19T14:45:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging at JoVE.com

El FIB-SEM y A.S. (la posición del operador FIB-SEM) son financiados por el Cluster de excelencia y Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) centro de investigación a nanoescala microscopia y Fisiología Molecular del cerebro (CNMPB). Agradecemos al laboratorio de Thomas Müller-Reichert para proporcionar las muestras de C. elegans . Agradecemos a Ulrich Weikert para participar en la película.

Todos los experimentos incluyendo muestras de animales descritas aquí han sido aprobados por el cuidado institucional de Animal y la oficina de estado de baja Sajonia para la protección del cliente y seguridad de alimentos (LAVES).
1. alta presión sustitución de congelación y congelación
<ol><li>Diseccionar el tibialis de nervus de un ratón (por ejemplo, C57Bl6N, 12 semanas, mujer)9.</li>
	<li>Sumerja el tibialis de nervus en una gota de 20% de polivinilpirrolidona (1 g de PVP en 5 mL) en tampón fosfato salino (PBS) y cortar piezas de 2 mm de longitud. Colocarla en un portamuestras metálico (tipo A, 0,2 mm de profundidad) con unas pinzas finas. Añadir otro portador plano (tipo B) cubierto con una capa delgada de hexadecano como una tapa e inserte este conjunto en el cartucho de muestra.</li>
	<li>Transferir varios C. elegans suspendidos en una gota de 20% albúmina sérica bovina (BSA) en M9 (véase Tabla de materiales) con una pipeta de plástico desechable en el portador de metal (tipo A). A continuación, agregar un segundo operador como tapa en la parte superior (tipo B) y montar el cartucho.</li>
	<li>Tanto de las muestras, para proceder con lo siguiente: alta presión congelar las Asambleas de portador de muestra uno por uno por la carga en el cartucho de tres piezas en la estación de carga del congelador alta presión. Presione el botón de proceso según instrucciones del fabricante. Nota: Ambos tipos de muestras pueden procesarse juntos la substitución posterior congelación.</li>
	<li>Coloque las muestras en crioviales de 2 ml de congelados 0,1% de ácido tánico en acetona. Realizar a la transferencia en un baño de nitrógeno líquido sin derramar nitrógeno líquido en los frascos. Transferir los crioviales en un conjunto de10 unidad de congelación automática sustitución a-90 ° C e iniciar el programa. Nota: Las muestras se mantienen a-90 ° C 100 h. ácido tánico antes de osmification se utiliza como mordiente para aumentar la absorción de tetróxido de osmio11.</li>
	<li>Lavar manualmente las muestras 3 x durante 30 min con 2 mL de acetona a-90 ° C en la unidad de sustitución de congelación.</li>
	<li>Dejar las muestras en 2 mL 2% de tetróxido de osmio, 0,1% acetato de uranilo en acetona para tinción continua en el automático congelación unidad de sustitución de 7 h a-90 ° C. PRECAUCIÓN: tetróxido de osmio es tóxica y debe manipularse bajo una campana de humos, y se debe usar equipo de protección. Nota: La unidad de sustitución de congelación automáticamente eleva la temperatura a-20 ° C a 5 ° C por hora. Las muestras se conservan a-20 ° C por 16 h en la unidad de sustitución de congelación. La temperatura se elevará automáticamente a 4 ° C a 10 ° C por hora.</li>
	<li>Cambiar la solución de tetróxido de osmio con acetona pura cuando alcanza la temperatura de 4 ° C. Retire los crioviales de la unidad de sustitución de congelación.</li>
</ol>2. procesamiento asistida por microondas
Nota: Realice los pasos siguientes a temperatura ambiente12 usando una unidad de control de temperatura para mantener la temperatura estable (véase Tabla de materiales).
<ol><li>Deje los tapones de los tubos de reacción abierta durante el proceso en el microondas.</li>
	<li>Tomar los portadores de metal muestra de los crioviales y extraer las muestras de la compañía metal con pinza fina o una aguja, manteniendo las muestras sumergidas en acetona en un recipiente de vidrio de reloj (150 mm).</li>
	<li>Transferir las muestras en tubos de reacción de 2 mL con pinzas finas o una pipeta y con 1 mL de acetona cuatro veces para 40 s a 250 w. PRECAUCIÓN: Thiocarbohydrazide es tóxica y debe manipularse bajo una campana de humos, se debe usar equipo de protección.</li>
	<li>Mancha de las muestras con 1 mL de thiocarbohydrazide de 1% en acetona durante 14 minutos a 150 W para aumentar el contraste. Para realizar la tinción, pipetear la solución thiocarbohydrazide en el tubo de reacción, coloque el tubo en el microondas y ajustar el programa a un nivel de potencia de 150 W (con la función de vacío encendida) durante 2 min en/2 min apagado, iterando para total 14 min. Iniciar el microondas. Nota: Thiocarbohydrazide reacciona con el tetróxido de osmio que se aplicó durante la sustitución de la congelación. Forma un puente, lo que permite más el tetróxido de osmio que se depositará en el original el tetróxido de osmio sitios13.</li>
	<li>Lavar las muestras 4 x con 1 mL de acetona de 40 s a 250 w. pipeta de la acetona en un tubo de ensayo, coloque el tubo en el microondas y seleccione 250 W para 40 s. Inicio el microondas.</li>
	<li>Mancha en 1 mL 2% de tetróxido de osmio en acetona durante 14 minutos a 150 w. pipeta de la solución de tetróxido de osmio en un tubo de ensayo, coloque el tubo en el microondas y ajustar el programa a un nivel de potencia de 150 W (con la función de vacío encendido) durante 2 min min on/2 off , iterando para total 14 min. Iniciar el microondas.</li>
	<li>Lavar las muestras 4 x con 1 mL de acetona de 40 s en 250 W (como hace en el paso 2.5).</li>
	<li>Infiltrar 1 ml aumento de concentraciones de resina en acetona (véase Tabla de materiales) de 25%, 50%, 75%, 90%, 100% y 100% por 3 min a 250 w. pipeta de la resina en un tubo de ensayo, coloque el tubo en el microondas y ajustar el programa a un nivel de energía l de 250 W (con la función de vacío encendido) para 3 minutos iniciar el microondas.</li>
</ol>3. mínima resina incrustar8
<ol><li>Sacar el tibialis de nervus y C. elegans el tubo de reacción con un palillo de dientes y un lugar en una pieza de plástico de la película (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>Utilice el palillo suavemente empujando la muestra alrededor de en la película plástica hasta que se detecta no hay resina restante. Utiliza una lámpara halógena para calefacción (véase Tabla de materiales) para que la resina se vuelve menos viscosa y es capaz de quitar más fácilmente. Lugar la lámpara halógena lo suficientemente cerca para calentar la resina (teniendo cuidado de no quemar las manos).</li>
	<li>Polimerizar las muestras para por lo menos 48 horas a 60 ° C sobre la película de plástico en el horno.</li>
</ol>4. preparación para FIB-SEM
<ol><li>Cortar las muestras polimerizadas junto con la película plástica con una cuchilla de afeitar en un tamaño apropiado el trozo de SEM y sujete a los talones de SEM utilizando una resina conductora de plata (véase Tabla de materiales). Polimerizarse nuevamente a 60 º C durante al menos 4 horas o durante la noche.</li>
	<li>Capa catódica las muestras en la SEM del trozo de oro durante 1 min a 35 mA mediante un recubridor sputter (también se puede utilizar platino/paladio; basta con una capa gruesa de 10 nm) y colóquelas dentro de la FIB-SEM.</li>
</ol>5. data acquisition en el FIB-SEM
<ol><li>Las muestras de la imagen con el detector de electrones secundarios usando el software básico manejo del microscopio (véase Tabla de materiales). La muestra debe ser orientada para que la región de interés (por ejemplo, parte media de los tibialis de nervus o C. elegans) es en el campo de visión. Nota: Para realizar la adquisición de datos, incline la etapa a una posición para que la muestra enfrenta a la viga de ion en un ángulo de 90° en una distancia de trabajo adecuada (5 mm) en el punto supuesto de coincidencia de la viga de ion y electrón. Utilizando nuestro instrumento, esto se logra en una inclinación del escenario del 54° y distancia de trabajo de 5 mm.</li>
	<li>Para configurar la posición correcta de la muestra, una característica común en una inclinación de 0° mientras que la proyección de imagen del centro con el detector de electrones secundarios. Poco a poco la inclinación a 54° (5°, 20°, 54°), recentrado el mismo objeto moviendo el eje de M.</li>
	<li>Buscar el punto de coincidencia de una función mientras que la proyección de imagen de centrado con el detector de electrones secundarios en 54°, seguida hacia la función de la posición central en el modo FIB. Realizar este mostrando el punto de mira en el software de SEM para tener una indicación del centro. Entonces mueva primero la función de la muestra seleccionada para el centro de la imagen mediante la función de punto de centro del software SEM. Entonces centro de la característica a lo largo del eje y moviendo el escenario en z. Cualquier desplazamiento final entre FIB y SEM se corrige con el cambio de la viga de SEM.</li>
	<li>Abra el software avanzado (véase Tabla de materiales) para la grabación de conjuntos de datos 3D y siga el Asistente de software paso a paso.</li>
	<li>En la región de interés, depósito carbono o platino (400 nm) sobre el ROI utilizando una 3 nA actual permite incluso moler y reducir artefactos inducidos por carga. Nota: Mediante la elaboración de la región de interés para ser molido en la superficie del espécimen con la FIB (anchura, altura, profundidad), el software calcula y superpone los tamaños de las funciones de preparación de muestra diferentes, como las trincheras para fresar o zona para deposición de platino/carbón. También, tenga cuidado de la imagen de la superficie de la muestra con corrientes FIB demasiado alta, ya que esto puede dañar la superficie de la muestra. Una corriente de 50 pA es suficiente para la proyección de imagen.</li>
	<li>Usa la viga de ion enfocada a una zanja para exponer la región de interés (ROI) utilizando un 15/30 nA actual del molino.</li>
	<li>Utilice la viga de ion enfocada para pulir corte transversal con un nA 7 actual.</li>
	<li>Después de terminar la preparación de la muestra, configurar los siguientes parámetros de imagen: FIB Fresadoras parámetros en la pestaña de configuración FIB (FIB fresado corriente); SEM imagen parámetros en la ficha Configuración y la imagen ajuste de parámetros en la pestaña de SEM AutoTune (realizar autofocus y autostigmation cada 60 min, tamaño de pixel de 50 nm, tiempo 3, línea 3 de media). Optimizar esto para cada muestra.</li>
	<li>Para evitar cualquier deriva térmica haciendo que el bloque de cara a la deriva durante la carrera, salir de la sala durante al menos 2 h antes de iniciar la adquisición.</li>
	<li>Adquirir el conjunto de datos en un molino continuo y adquirir modo con un 700 pA FIB actual. Uso 1.5 kV (modo analítico, 900 V) detector de ESB con una tensión de red de 400 V para adquirir imágenes con tamaño de píxel de nm 5 utilizando el software avanzado (véase Tabla de materiales) y grosor de corte de 50 nm. Una adquisición de la imagen tiene aproximadamente 1,5 min con un tiempo de permanencia de 6 μs.</li>
	<li>Iniciar la adquisición de datos. Se adquiere una imagen de la FIB en la molienda actual para asegurar que la muestra no se movió y se selecciona la región derecha de interés. Ajustar si es necesario.</li>
</ol>6. visualización de datos
<ol><li>Abrir imágenes en Fiji arrastrando la carpeta que contiene todas las imágenes en Fiji y seleccione Pila Virtual.</li>
	<li>Cultivos de la región de interés utilizando la herramienta Rectángulo (imagen > cultivos).</li>
	<li>Invertir los datos para mostrar el contraste de la microscopia electrónica de transmisión tradicional con membranas en oscuridad (Editar > invertir).</li>
	<li>Utilice TrackEM214 (Fiji15) para la alineación. Cargar los datos en TrackEM2 (archivo > Nuevo > TrackEM2) haciendo clic en el capa. Después de todas las imágenes se cargan, alinearlos mediante función de mosaico de múltiples capas (haga clic en imagen > alinear > alinear varias capas mosaico). Después de la alineación, las imágenes se exportan como archivos tiff individuales (haga clic en imagen > exportación > imagen plana marca). Seleccione todas las imágenes que deben ser exportadas y eligen Guardar archivo.</li>
	<li>Para procesamiento posterior, utilizar un desenfoque gaussiano (proceso > Filtros > Desenfoque gaussiano; sigma 2) y aumento del contraste local (proceso > mejorar el contraste Local; CLAHE: tamaño de bloque 127, cubos de histograma 256, pendiente máxima 1.5), que se aplican en Fiji para suavizar la imagen y obtener una mejor relación señal a ruido.</li>
	<li>IMOD16 se utiliza para realizar una segmentación manual y visualizar la estructura de interés en 3D. Abra el conjunto de datos en IMOD y seleccione herramientas de dibujo (especial > herramientas de dibujo) para realizar la segmentación manual. Diferentes herramientas manual pueden utilizarse para seguir la estructura de interés en todo el volumen (por ejemplo unir, Sculpt). Usar navegador de imágenes de microscopía (MIB17) para segmentación semiautomática.</li>
</ol>

<ol>
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No hay conflicto de interés declarado.

El protocolo fue desarrollado para ilustrar la conservación óptima y el contraste para realizar la proyección de imagen serial de cara de bloque con un FIB-SEM. Por lo tanto, elegimos aplicar crio-inmovilización seguida de coloración posterior usando sustitución de congelación y tratamiento asistido por microondas. Por lo tanto, este protocolo se limita a las muestras que son lo suficientemente pequeñas como para congelación de alta presión. Por el tamaño de la compañía de la muestra, que coincide con el tamaño de la muestra que se puede congelar correctamente con esta técnica se establecen las limitaciones de tamaño de 3 a 6 mm de ancho y espesor de ~ 200 μm. Esto es relevante para la muestra de nervio de ratón, ya que el nervio ciático es demasiado grande de diámetro para caber en los portadores de 0.2 mm que están obligados a garantizar la congelación adecuada. Por lo tanto, se recomienda la cuidadosa disección de un nervio más pequeños como el nervio tibial u otros nervio fino como el nervio femoral. Puesto que la vaina de mielina es sensible al estiramiento, gran debe tener cuidado durante la disección del nervio fresco y viable para evitar la manipulación de artefactos. En general, deben utilizarse sólo viables muestras para estudios de microscopio electrónico.
Proceso asistido por microondas e incrustación de resina mínima están diseñados para acelerar la preparación y proceso de focalización. El procesamiento asistido por microondas, aplicando un protocolo modificado de OTO4 se utiliza para la fijación química de temperatura ambiente. Un microondas doméstico no dará los mismos resultados, ya que hay una distribución homogénea de las microondas, su temperatura no es controlada, no vacío que puede ser aplicado. El más pequeño una muestra, la mayor penetración de los productos químicos; por lo tanto, los mejores resultados se obtienen muestras más pequeñas. Para evitar daños a la muestra por sobrecalentamiento, control de la temperatura y la aplicación de la potencia del microondas mínimamente requeridos son críticos. Los pasos del proceso asistida por microondas se pueden realizar en el banco si no hay microondas disponibles, que dará lugar a tiempos de procesamiento más largos. A directamente estructuras de destino en el SEM, es crucial eliminar tanta resina como sea posible de la parte superior de la muestra. Después de registrar un conjunto de datos, procesamiento posterior de los datos en bruto es necesario reducir el tamaño del archivo y mejorar la relación señal a ruido. Técnicas de imagen moderno volumen producen grandes cantidades de datos. Por lo tanto, para realizar el procesamiento de datos en forma rápida y suficiente, se necesita suficiente RAM en la estación de trabajo. Para las operaciones de alineación por lo menos dos veces más RAM que el tamaño del conjunto de datos se requiere.
Este protocolo ha sido probado en el tibialis de nervus del ratón así como en C. elegans. Hall et al.. 12 utiliza un paso de mejora similares después de su sustitución de congelar en el Banco para la preparación de C. elegans. Para cualquier otro organismo de modelo como el pez cebra, ajustes del protocolo son probablemente necesarias. Una modificación posible es cambiar la composición de la substitución de freeze coctel, como por la adición de agua que se utiliza para el realce de contraste18. Además, la duración de la sustitución de congelación tiene que estar adaptado a la muestra y puede acortarse considerablemente según la congelación rápida sustitución protocolo19. Una posibilidad es la aplicación de agitación para acelerar la congelación sustitución proceso20. Después de la sustitución de la congelación, otras modificaciones son posibles, como la aplicación repetida de mejora de los productos químicos y el tetróxido de osmio21. Durante el proceso del microondas, se puede variar la potencia, temperatura y tiempos de incubación para optimizar los resultados de la muestra respectiva.
Este protocolo muestra que dicha mejora puede combinarse con otros protocolos de congelación sustitución y diferentes tipos de muestras según lo descrito por Hall12 que se reflejada en un FIB-SEM o por microscopía electrónica de serie de cara de bloque. Estas técnicas de imagen requieren contraste, que es menos importante para microscopía electrónica de transmisión.

Congelación de alta presión es el método de preparación de muestra de elección para la obtención de alta calidad ultraestructural preservación, que representa el estado nativo de una muestra mucho mejor que los métodos convencionales de preparación mediante fijación química1. Este método de cryo-preparación es útil para las muestras como un requisito estricto para el uso del organismo modelo elegans de Caenorhabditis3mouse myelinated tejido2 . Después de la sustitución de congelación e incrustación de resina, estas muestras generalmente son analizadas por microscopia electrónica de transmisión (TEM) o la tomografía electrónica (ET). Si volúmenes más grandes deben ser reflejados mediante FIB-SEM o la proyección de imagen serial de cara de bloque para alta resolución reconstrucciones 3D a gran escala, en nuestra experiencia adecuada proyección de imagen por SEM es a menudo obstaculizada por la falta de contraste. En el FIB-SEM, la imagen generalmente se registra por la detección de backscattered electrones desde el haz de electrones primario. El rendimiento de backscattered electrones es proporcional al contenido de metales pesados en la muestra. Por lo tanto, protocolos fueron especialmente diseñados para imágenes para realzar el contraste de volumen de impregnación del metal pesado adicional. Tales métodos se basan en muestras fijadas químicamente y aplicarán una combinación de tetróxido de osmio-thiocarbohydrazide-osmio tetróxido4, según lo descrito por Knott et al5, para la serie de cara de bloque y centrado de la viga de ion, microscopía electrónica de barrido. Modificaciones, incluyendo el uso de formamida y pirogalol6 o plomo aspartato7 se han aplicado con éxito para diferentes técnicas de imagen.
El protocolo que aquí combina la cryo-preparación de muestras por HPF y la congelación de sustitución con posterior procesamiento para contraste con tetróxido de osmio/thiocarbohydrazide en acetona a temperatura ambiente asistido por microondas. Nos lo demuestran en el tibialis de nervus myelinated de ratones y en Caenorhabditis elegans, que representan las muestras que requieren alta presión de congelación para conservación ultraestructural de alta calidad. Además, se muestra cómo, después de la deshidratación y la infiltración, las muestras se encajan con como poco posible. Esta resina mínima inclusión8 permite para apuntar más rápido de la estructura de interés y reduce el tiempo empleado en el procesamiento de las muestras, incluyendo menos tiempo requerido para la exposición de la región de interés con la viga de ion. Después de realizar más pasos de preparación de la muestra en el microscopio, la proyección de imagen y molienda de la muestra se lleva a cabo continuamente para adquirir una pila de imágenes. Para la visualización 3D, software (IMOD) de procesamiento de imágenes se utilizan para reconstruir partes del conjunto de datos.
Nuestro flujo de trabajo describe cómo el contraste más adecuado de las muestras para la proyección de imagen de volumen se puede combinar con la mejor preservación ultraestructural por sustitución HPF y congelación. Esto es útil para las muestras que requieren estrictamente cryo-preparación. Aplicaciones se limitan a pequeñas muestras que se pueden preparar por HPF. En muestras de diferente naturaleza, como plantas o microorganismos, este protocolo requiere adaptación.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Instrumentation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica HPM100</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Freeze Substitution</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory microwave with temperature control unit</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM ACE600 with gold target</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crossbeam 540</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halogen lamp 12 V/ 20 W</td>
			<td>Osram</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>According to C. Elegans- A practical approach I.A.Hope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadecene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>52276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A type carrier</td>
			<td>Wohlwend GmbH</td>
			<td>#241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B type carrier</td>
			<td>Wohlwend GmbH</td>
			<td>#242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slit carrier</td>
			<td>Wohlwend GmbH</td>
			<td>#446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pasteur pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-1684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11200-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze substitution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>science services</td>
			<td>10015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tannic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>403040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>EMS</td>
			<td>19100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate</td>
			<td>SPI-Chem</td>
			<td>02624-AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>EMS</td>
			<td>10015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>223220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc CryoTubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V7884-450EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Watch glass dishes, 150 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>216-2189H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan resin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>44610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SEM stubs</td>
			<td>Science Services</td>
			<td>E75200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aclar</td>
			<td>Science Services</td>
			<td>50425-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpicks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>512-3618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conductive silver resin</td>
			<td>EMS</td>
			<td>12670-EE</td>
			<td>EPO-TEK EE 129-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>SmartSEM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Atlas5 A3D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing</td>
			<td>Open source</td>
			<td>Fiji</td>
			<td>http://fiji.sc/#download</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image visualization</td>
			<td>Open source</td>
			<td>IMOD</td>
			<td>http://bio3d.colorado.edu/imod/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biological sample preparation by high-pressure freezing, microwave-assisted contrast enhancement, and minimal resin embedding for volume imaging

La técnica de preparación de muestra descrito está diseñada para combinar la mejor calidad de preservación ultraestructural con el contraste más adecuado para la modalidad de proyección de imagen en un ion enfocado viga microscopio electrónico de barrido (FIB-SEM), que se utiliza para obtener pilas de imágenes secuenciales para la reconstrucción 3D y modelado. Alta presión (HPF) de congelación permite cerca de preservación estructural nativa, pero la posterior congelación de sustitución a menudo no proporcionan suficiente contraste, especialmente para un espécimen más grande, que es necesario para la proyección de imagen de alta calidad en el SEM para 3D reconstrucción. Por lo tanto, en este protocolo, después de la sustitución de congelación, medidas de contraste adicionales se llevan a cabo a temperatura ambiente. Aunque estos pasos se realizan en el microondas, también es posible seguir el proceso de banco tradicional, que requiere tiempos de incubación más largos. La incorporación posterior de cantidades mínimas de resina permite la más rápida y más precisa orientación y preparación dentro de la FIB-SEM. Este protocolo es especialmente útil para muestras que requieren de una preparación por congelación de alta presión para una preservación ultraestructural confiable pero no obtener suficiente contraste durante la sustitución de congelación para la proyección de imagen de volumen mediante FIB-SEM. En combinación con la incrustación de resina mínima, este protocolo proporciona un flujo de trabajo eficiente para la adquisición de datos de volumen de alta calidad.

El flujo de trabajo comienza con una muestra (aquí, un ratón recién disecados nervus tibialis) en portadores metálicos para la congelación de alta presión (Figura 1a). Los portadores son recuperados de nitrógeno líquido (Figura 1b) y colocados en una unidad de sustitución de congelación sobre la química primer congeladora cóctel (figura 1C). Después de una larga congelación protocolo de sustitución, incluyendo 2% de tetraóxido de osmio y 0,1% acetato de uranilo, las muestras se extraen de los portadores a la temperatura ambiente (figura 1 d). Para mejorar el contraste, las muestras se transfieren a tubos de plástico a ser procesado en el microondas (Figura 1e). La cámara de vacío y unidad de control de temperatura se utilizan para optimizar el proceso (figura 1f).
Para poder realizar la incrustación de resina mínimo, se necesitan hojas de película de plástico y palillos de dientes (Figura 2a). Después de infiltrarse en las muestras con resina utilizando el horno de microondas, son colocados en las piezas de la película plástica y movidos alrededor hasta que no quede resina en la superficie de la muestra. Una lámpara halógena se utiliza para drenar la resina restante y dejar la muestra mínimamente integrada (figura 2b) en la película de plástico. Cabe señalar que la resina más quitada de la parte superior de la muestra es buena. Todavía debe haber una pequeña cantidad debajo de la muestra para mantenerla unida al sustrato. La muestra ser polimerizada en la película de plástico se corta y en la parte superior del trozo de SEM con resina conductora de plata (figura 2 c). El trozo se polimeriza durante al menos 4 h a 60 ° C (Figura 2d). Se deben mezclar bien los componentes o la mezcla no puede polimerizar correctamente. Para evitar carga en el microscopio electrónico de barrido, el talón es Farfullar revestido con oro o platino/paladio (figura 2e).
Las muestras se colocan en el FIB-SEM y fotografiadas con un detector de electrones secundarios a la región de interés (figura 3ae). Un haz de iones se utiliza para remover el material directamente en frente de la región de interés para exponer una sección (figura 3b-d, 3f-h). Protocolos estándar a menudo sufren de falta de contraste de la membrana (figura 3bf), mientras que el protocolo mejorado proporciona un contraste fuerte de la membrana (figura 3 c-d, 3 g-h).
Los datos de EM (después de postprocesado) se visualizan con IMOD, una imagen de procesamiento y modelado de programa. Para lograr una mejor comprensión de la información 3D, se utiliza el reslicing virtual de los datos (figura 4a). Diferentes estructuras del conjunto de datos están segmentadas manualmente (Figura 4b-d).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59156/59156fig1.jpg"> Figura 1: de alta presión de congelación, congelación-sustitución y transformación asistida por microondas. (a) portador que contiene el tibialis de nervus de ratón de la muestra, la escala bar 3 m m. (b) portamuestras que contiene el tibialis de nervus de ratón después de alta presión congelación, bar 3 mm. (c) automático congelación sustitución (AFS) unidad de escala con las muestras. Recuadro: recipiente de metal por encargo para hasta 23 cubetas y dos frascos grandes de productos químicos en el AFS. (d) muestras de portadores en un plato de cristal en la acetona, la escala bar 3 mm. (e) muestras en tubos de reacción para poner en el microondas para el procesamiento. unidad (f) vacío cámara y control de temperatura del horno de microondas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59156/59156fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59156/59156fig2.jpg"> Figura 2: incrustación de resina mínima y preparación para el FIB-SEM. (a) plástico y palillos de dientes que se utilizan para la resina mínima inclusión, escala bar 4 cm. (b) Nervus tibialis vaciado de resina encima de la película plástica, escala bar 250 μm. (c) tibialis de Nervus polimerizado en película plástica, entonces corte y montado sobre el trozo de SEM con resina conductiva de plata, escala bar 250 μm. (d) muestras polimerizadas en la parte superior del trozo de SEM, escala bar 3 mm. (e) las muestras recubiertas con oro en el talón de la SEM, escala bar 3 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59156/59156fig2large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59156/59156fig3.jpg"> Figura 3: preparación de la muestra dentro de la FIB-SEM. (una e) Imagen secundaria del electrón dentro del FIB-SEM de la muestra de la superficie (a) escala de tibialis de Nervus, barra 100 μm. (e) C. elegans, escala de la barra 2 μm. (b-d) y sección (f-h) a través de muestra utilizando detector de ESB para la proyección de imagen. (b y c) Tibialis de Nervus, escala de la barra 2 μm. (f y g) C. elegans, escala de la barra 1 μm y 200 nm. (b y f) Se muestran los resultados de alta presión congelación y congelación sustitución sin realce, mientras que todas las otras imágenes muestran resultados de sustitución mayor congelación. (d y h) Imagen detallada de la muestra utilizando el detector ESB. (d) tibialis de Nervus, escala de la barra 200 nm. (h) escala de C. elegans, barra 200 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59156/59156fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59156/59156fig4.jpg"> Figura 4: adquisición y visualización de la imagen. (a) datos EM IMOD con casi resliced x / z - y y-z-planos, escala de la barra 2 μm. (b) segmentado axones en EM datos (azul) Remak (rojo) de paquetes, envolturas de myelin (amarillo y naranja) y mitocondrias (turquesas), escalan de la barra 3D modelo de 2 μm. (c y d), escala de la barra 2 μm y 500 nm . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59156/59156fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Aquí presentamos un protocolo para la combinación de dos técnicas de procesamiento de muestra, alta presión de congelación y procesamiento de las muestras asistida por microondas, seguido por la resina mínima inclusión para la adquisición de datos con un ion enfocado viga microscopio electrónico (FIB-SEM). Así lo demuestran con una muestra de nervio tibial de ratón y elegans de Caenorhabditis.

Preparación de muestras biológicas por congelación de alta presión, realce del contraste asistida por microondas y mínima inclusión de proyección de imagen de volumen

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Esta técnica de preparación de muestras está diseñada para combinar la mejor calidad de preservación de la ultraestructura con el contraste más adecuado para la modalidad de imagen en un microscopio electrónico de barrido de haz iónico enfocado. Este protocolo es especialmente útil para muestras que requieren preparación mediante congelación a alta presión para una preservación fiable de la ultraestructura, pero no obtienen suficiente contraste durante la sustitución por congelación para imágenes por volumen. Para una incrustación mínima de resina es esencial eliminar la mayor cantidad de resina posible para permitir una orientación adecuada más adelante en el microscopio electrónico de barrido de haz iónico enfocado.Para comenzar, utilice la pipeta para gotear una gota de 20%PVP PBS en la estera de corte. Sumerja el nervus tibialis diseccionado en la gota. Utilice el bisturí para cortar dos milímetros de longitud de la muestra.Utilice fórceps finos para colocar la muestra en un soporte de muestra de metal de 0,2 milímetros de profundidad. Transfiera el soporte a la placa central del cartucho. Coloque el soporte tipo B recubierto de hexadecán en la parte superior como tapa.Cierre el conjunto bajando la mitad superior del cartucho. Cierre el cartucho de tres piezas en la estación de carga del congelador de alta presión. Pulse el botón de proceso y proceda de acuerdo con las instrucciones de funcionamiento del fabricante.En un baño de nitrógeno líquido, coloque los portadores de muestras en viales criográficos que contengan dos mililitros de ácido tánico congelado y acetona y cierre las tapas. Coloque los viales crios en la unidad de sustitución de congelación a menos 90 grados centígrados. Inicie el programa y mantenga las muestras allí durante 100 horas.En la unidad de sustitución de congelación, lave las muestras con dos mililitros de acetona tres veces durante 30 minutos. Coloque 2%tetróxido de osmio en 0,1%acetato de uranilo en la unidad de sustitución de congelación para enfriar y agréguelo a las muestras durante siete horas de tinción continua a menos 90 grados centígrados. Cuando la temperatura del programa en la unidad de sustitución de congelación alcance menos 20 grados Celsius, mantenga las muestras allí durante otras 16 horas.Cuando la temperatura suba a 4 grados centígrados, deseche el líquido en los viales y rellene la acetona pura. Retire los viales crios de la unidad de sustitución de congelación. El manejo de muestras antes de la congelación y después de la osmoficación es crítico, ya que la muestra puede dañarse gravemente.En una campana de humo, utilice fórceps finos para retirar los portadores metálicos de los viales de crio y transferir las muestras de los portadores para sumergirlas en un plato de cristal de reloj de 150 milímetros de profundidad lleno de acetona. Utilice fórceps finos para transferir las muestras a dos tubos de reacción mililitros llenos de acetona. Ajuste el microondas a 250 vatios durante 40 segundos e inicie el microondas para lavar las muestras y repetir cuatro veces.Pipetear un mililitro de 1%solución tiocarbohydrazide en el tubo de reacción y ponerlo en el microondas. Encienda la función de vacío con dos minutos encendido y dos minutos de apagado, iterando durante un total de 14 minutos y establézcalo en 150 vatios. Arranca el microondas.Lave la muestra cuatro veces en acetona como antes. Pipetear un mililitro de 2%solución de tetróxido de osmio en el tubo de reacción. Coloque la muestra en el microondas y utilice los mismos ajustes de microondas que con la tiocarbohidrazida.Lave la muestra cuatro veces en acetona como antes. Pipetear un mililitro de 25% de resina en acetona en el tubo de reacción y ponerlo en el microondas. Encienda la función de vacío durante tres minutos y establézcala en 250 vatios.Arranca el microondas. Utilice un palillo de dientes para extraer el nervus tibialis del tubo de reacción y colóquelos en un pedazo de película de plástico. Coloque una lámpara halógena cerca de las muestras para calentar la resina.Con un palillo de dientes, empuje suavemente la muestra sobre la película de plástico hasta que no se detecte resina restante. Coloque la película de plástico con la muestra en la parte superior en el horno y ajuste la temperatura a 60 grados Celsius para polimerizar las muestras durante al menos 48 horas. Utilice una cuchilla de afeitar para cortar las muestras polimerizadas junto con la película de plástico en un tamaño que se ajuste al talón SEM.Utilice un palillo de dientes para añadir resina de plata conductora en los talones SEM y adjunte las muestras cortadas a él. Y luego añadir resina alrededor de las muestras. Ponga los talones SEM en el horno para polimerizar a 60 grados Celsius durante al menos 4 horas o durante la noche.Después de la polimerización, coloque los talones SEM en una recubridora. Ajuste la cubierta de pulverización a 35 miliamperios y aplique un recubrimiento o una capa de oro grueso de 10 nanómetros durante un minuto. Después del recubrimiento, coloque los talones SEM dentro del microscopio electrónico de barrido de haz iónico enfocado.En este estudio, se realizó un protocolo mejorado para nervus tibialis del ratón, así como C.elegans para ilustrar la preservación óptima y el contraste para realizar imágenes de volumen 3D con un microscopio electrónico de barrido de haz iónico enfocado. Los protocolos estándar a menudo sufren de una falta de contraste de membrana donde como el protocolo mejorado proporciona un fuerte contraste de membrana. Las imágenes de sección transversal de C.elegans con protocolo mejorado y protocolo estándar muestran una diferencia distintiva.Además de para las imágenes de sección transversal de nervus tibialis, el protocolo mejorado ayuda a mostrar un contraste de membrana más fuerte en comparación con el protocolo estándar. Después del postprocesamiento, los datos del microscopio electrónico se visualizan utilizando IMOD, un programa de procesamiento y modelado de imágenes. El área resaltada en azul muestra los axones segmentados.El área resaltada en rojo muestra los paquetes de Remak. Las áreas de color amarillo y naranja muestran vainas de mielina. Y el área turquesa muestra mitocondrias.La reliquia virtual y el modelo tridimensional ilustran la arquitectura de tejido fino y ayudan a entender su función. Se pueden utilizar otros métodos de microscopía electrónica de barrido de volumen, como la microscopía electrónica de barrido de bloques serie y la tomografía por matriz. Este protocolo también se puede utilizar para la microscopía electrónica de transmisión y otros tipos de muestras como muestras del sistema nervioso central.El tetróxido de osmio, la tiocarbohidozida y el acetato de uranilo son sustancias químicas tóxicas y deben utilizarse con cuidado. La resina también es dañina y debe utilizarse con cuidado. El equipo de protección personal, como guantes y bata de laboratorio, debe usarse para el protocolo completo.

Research

JoVE Journal

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