Name: seeding and implantation of a biosynthetic tissue-engineered tracheal graft in a mouse model
Uploaded: 2019-04-01T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Seeding and Implantation of a Biosynthetic Tissue-engineered Tracheal Graft in a Mouse Model at JoVE.com

Vi vil gerne anerkende Robert Strouse og forskning Information Solutions & innovationer division på Nationwide children's Hospital for deres støtte i grafisk design. Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra NIH (NHLBI K08HL138460).

Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) på Nationwide children's Hospital.
1. stillads fremstilling
<ol><li>Forberede en polymer nanofiber forløber løsning af: 1) opløsning 8 wt % PET i 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol og varme løsning til 60 ° C og ved 2) opløsning 3 wt % PU i 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol ved stuetemperatur.</li>
	<li>Når afkølet, kombinere løsninger for at oprette en endelige polymer blanding af PE...

<ol>
	<li>Macchiarini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+transplantation+of+a+tissue-engineered+airway.">Clinical transplantation of a tissue-engineered airway.</a> The Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).</li><li>Jungebluth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracheobronchial+transplantation+with+a+stem-cell-seeded+bioartificial+nanocomposite:+A+proof-of-concept+study.">Tracheobronchial transplantation with a stem-cell-seeded bioartificial nanocomposite: A proof-of-concept study.</a> The Lancet. 378 (9808), 1997-2004 (2011).</li><li>Elliott, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-cell-based,+tissue+engineered+tracheal+replacement+in+a+child:+A+2-year+follow-up+study.">Stem-cell-based, tissue engineered tracheal replacement in a child: A 2-year follow-up study.</a> The Lancet. 380 (9846), 994-1000 (2012).</li><li>Chiang, T., Pepper, V., Best, C., Onwuka, E., Breuer, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Translation+of+Tissue+Engineered+Trachea+Grafts.">Clinical Translation of Tissue Engineered Trachea Grafts.</a> Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 125 (11), 873-885 (2016).</li><li>Clark, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cell+seeding+on+neotissue+formation+in+a+tissue+engineered+trachea.">Effect of cell seeding on neotissue formation in a tissue engineered trachea.</a> Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 49-55 (2016).</li><li>Cole, B. B., Smith, R. W., Jenkins, K. M., Graham, B. B., Reynolds, P. R., Reynolds, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracheal+basal+cells:+A+facultative+progenitor+cell+pool.">Tracheal basal cells: A facultative progenitor cell pool.</a> American Journal of Pathology. 177 (1), 362-376 (2010).</li><li>Onwuka, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+myeloid+cell-derived+PDGF-B+in+neotissue+formation+in+a+tissue-engineered+vascular+graft.">The role of myeloid cell-derived PDGF-B in neotissue formation in a tissue-engineered vascular graft.</a> Regenerative Medicine. 12 (3), 249-261 (2017).</li><li>Grimmer, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracheal+reconstruction+using+tissue-engineered+cartilage.">Tracheal reconstruction using tissue-engineered cartilage.</a> Archives of Otolaryngology - Head and Neck Surgery. 130 (10), 1191-1196 (2004).</li><li>Wood, M. W., Murphy, S. V., Feng, X., Wright, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracheal+reconstruction+in+a+canine+model.">Tracheal reconstruction in a canine model.</a> Otolaryngology - Head and Neck Surgery (United States). 150 (3), 428-433 (2014).</li><li>Haag, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+and+angiogenic+properties+of+tissue-engineered+rat+trachea+using+genipin+cross-linked+decellularized+tissue.">Biomechanical and angiogenic properties of tissue-engineered rat trachea using genipin cross-linked decellularized tissue.</a> Biomaterials. 33 (3), 780-789 (2012).</li><li>Best, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+a+tissue-engineered+tracheal+scaffold+for+preclinical+evaluation.">Designing a tissue-engineered tracheal scaffold for preclinical evaluation.</a> International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology. 104, 155-160 (2018).</li></ol>

Udvikling af en musemodel for væv manipuleret tracheas er afgørende i forståelsen af de faktorer, der har begrænset klinisk oversættelse af TETGs; nemlig graft sammenbrud, stenose og forsinket epithelialization4. Et par faktorer, der bidrager til disse begrænsninger omfatter udvælgelsen af graft materiale, fremstillingsprocessen, stillads design og celle såning protokoller. Denne model giver mulighed for hurtigere evaluering af disse faktorer for at forstå de cellulære og molekylære mek...

Long-segment trakeal defekter kan præsentere som sjældne medfødte sygdomme som komplet trakeal ringe og luftrør agenesi, samt traume, malignitet, og infektion. Når over 6 cm i voksne eller 30% af luftrør længde i børn, ikke kan disse mangler behandles ved kirurgisk rekonstruktion. Forsøg på at erstatte luftvejene med autologt væv, dødt transplantationer og kunstige konstruktioner har været plaget af kronisk infektion, granulering, mekaniske svigt og stenose.
Tissue Engineering trakeal grafts (TETGs) kan potentielt udbedre disse problemer samtidig undgå behovet for livslang immunosuppression. I det sidste årti, er TETGs blevet testet i dyremodeller og udnyttes klinisk i sjældne tilfælde af udleveringstilladelse1,2,3. I både klinisk og store dyreforsøg, postoperativ nyttiggørelse fra væv manipuleret luftvejene udskiftning kræves mange tiltag til at bekæmpe stenose (defineret som > 50% luminale forsnævring) og vedligeholde luftvejene passage. Yderligere TETG arbejde har søgt at reducere denne stenose gennem evaluering af celle seeding valgmuligheder, vascularization og stillads design rolle. Celle seeding valgmuligheder og stillads design med henblik på at genoprette indfødte luftrøret struktur og funktion har primært været fokuseret på respiratorisk epitel celler og chondrocytter seedede på forskellige resorberbare, ikke-resorberbare og decellularized stilladser. Som vascularization sandsynligvis spiller en stor rolle i udviklingen af stenose, har andre grupper fokuseret på at optimere in vitro- eller heterotopisk modeller til at fremskynde revaskularisering eller neoangiogenesis4. Ikke desto mindre, at opnå vellykkede vascularization samtidig også opretholde en mekanisk kompetente og funktionelle TETG er fortsat en udfordring. Trods de seneste fremskridt, minimere stenose er fortsat en afgørende hindring for kliniske oversættelse.
For at undersøge dette histopatologisk svar til TETG implantation i vivo, udviklede vi en fåre model af væv manipuleret trakeal udskiftning. Graften var sammensat af et blandet polyethylenterephthalat (PET) og polyurethan (PU) electrospun stillads seedede med knoglemarv-afledte mononukleære celler (BM-Middelhavspartnerlandene). I denne lille kohorte viste vi at seedede autolog BM-Middelhavspartnerlandene fremskyndet fornyet epithelialization og forsinket stenose5. Selv om såning med autolog BM-Middelhavspartnerlandene forbedret overlevelse, uklart den cellulære mekanisme som BM-Middelhavspartnerlandene modulere dannelsen af funktionelle neotissue.
Undersøgelse af det cellulære niveau kræves udvikling af en murine model af væv manipuleret trakeal udskiftning. Lig får undersøgelsen, vi udnyttet en PET:PU electrospun stillads seedede med BM-Middelhavspartnerlandene. konsekvent med fåre-model, TETG stenose udviklet i løbet af de første to uger efter implantation1,2,3 ,5. Dette foreslog, at modellens murine sammenfattet patologi observeret tidligere, gør det muligt for os at yderligere afhøre de cellulære mekanismer bag luftvejene stenose.
I denne betænkning detaljer vi vores protokol for væv manipuleret trakeal udskiftning i musemodel herunder stillads produktion, BM-MNC isolation, graft såning og implantation (figur 1, figur 2).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:827px;" width="827">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">0.9% Sodium chloride injection</td>
			<td style="width:119px;">APP Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:119px;">NDC 63323-186-10</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">10cc serological pipet</td>
			<td style="width:119px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">357551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">18G 1.5in. Needle</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">305190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">1mL Syringe</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">24-well plate</td>
			<td style="width:119px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">25cc serological pipet</td>
			<td style="width:119px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">356535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">25G 1in. Needle</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">305125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">50cc tube</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">Alcohol prep pads</td>
			<td style="width:119px;">Fisher Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">NDC 69250-661-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">Baytril (enrofloxacin) solution</td>
			<td style="width:119px;">Bayer Healthcare, LLC</td>
			<td style="width:119px;">NDC 0859-2267-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:423px;">Black polyamide monofilament suture, 9-0</td>
			<td style="width:119px;">AROSurgical Instruments Corporation</td>
			<td style="width:119px;">T05A09N10-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">C57BL/6, female</td>
			<td style="width:119px;">Jackson laboratories</td>
			<td style="width:119px;">664</td>
			<td style="width:167px;">6-8 weeks old</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Citrate Buffer pH 6.0 20x concentrate</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Colibri retractors</td>
			<td style="width:119px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">17000-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Cotton tipped applicators</td>
			<td style="width:119px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">23-400-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Cytokeratin 14 Monoclonal Antibody</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">MA5-11599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td style="width:119px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Dumont #5/45 forceps</td>
			<td style="width:119px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Dumont #7 - Fine Forceps</td>
			<td style="width:119px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">11274-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">F4/80 Rat anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:119px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">MCA497R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Ficoll</td>
			<td style="width:119px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">10831-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Fine scissors- Sharp-blunt</td>
			<td style="width:119px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">14028-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Fisherbrand Premium Cover Glasses</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">12-548-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Fluoroshield Mounting Media with DAPI</td>
			<td style="width:119px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab104139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Goat-anti mouse IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Goat-anti Rabbit IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">A-11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Goat-anti Rat IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 647</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">A-21247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">Ibuprofen</td>
			<td style="width:119px;">Precision Dose, Inc</td>
			<td style="width:119px;">NDC 68094-494-59</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:423px;">Iodine prep pads</td>
			<td style="width:119px;">Professional disposables international, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">NDC 10819-3883-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Keratin 5 Polyclonal Antibody, Purified</td>
			<td style="width:119px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">905501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Ketamine hydrochloride injection</td>
			<td style="width:119px;">Hospira Inc.</td>
			<td style="width:119px;">NDC 0409-2053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Micro-Adson forceps</td>
			<td style="width:119px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">11018-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Microscope</td>
			<td style="width:119px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">M80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Non-woven sponges</td>
			<td style="width:119px;">Covidien</td>
			<td style="width:119px;">441401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:423px;">Opthalmic ointment</td>
			<td style="width:119px;">Dechra Veterinary products</td>
			<td style="width:119px;">NDC 17033-211-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">PBS</td>
			<td style="width:119px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">PET/PU (Polyethylene terephthalate &#38; Polyurethane) scaffolds</td>
			<td style="width:119px;">Nanofiber solutions</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom ordered</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Petri dish</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">RPMI 1640 Medium</td>
			<td style="width:119px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">TISH Needle Holder/Forceps</td>
			<td style="width:119px;">Micrins</td>
			<td style="width:119px;">MI1540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Trimmer</td>
			<td style="width:119px;">Wahl</td>
			<td style="width:119px;">9854-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vannas-T&#252;bingen Spring Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15008-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Warm water recirculator</td>
			<td style="width:119px;">Gaymar</td>
			<td style="width:119px;">TP-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">Xylazine sterile solution</td>
			<td style="width:119px;">Akorn animal health</td>
			<td style="width:119px;">NDC 59399-110-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

seeding and implantation of a biosynthetic tissue-engineered tracheal graft in a mouse model

Behandlingsmulighederne for medfødt eller sekundære lang segment trakeal defekter har historisk set været begrænset på grund af manglende evne til at erstatte funktionelle væv. Vævsmanipulering holder meget lovende som en mulig løsning med sin evne til at integrere celler og signalering molekyler i en 3-dimensional stillads. Seneste arbejde med væv manipuleret trakeal grafts (TETGs) har set nogle succes men deres oversættelse har været begrænset af transplantat stenose, pode sammenbrud, og forsinket epithelialization. For at undersøge de mekanismer, der driver disse spørgsmål, har vi udviklet en musemodel for væv manipuleret trakeal graft implantation. TETGs blev bygget ved hjælp af electrospun polymerer polyethylenterephthalat (PET) og polyurethan (PU) i en blanding af PET og PU (20:80 procent vægt). Stilladser blev derefter seedede ved hjælp af knoglemarven mononukleære celler isoleret fra 6-8 ugers-gamle C57BL/6 mus af gradient centrifugering. Ti millioner celler pr. graft var seedet til lumen af skafottet og tilladt at udruge natten før implantation mellem de tredje og syvende trakeal ringe. Disse udtagne transplantater var i stand til at sammenfatte resultaterne af stenose og forsinket epithelialization, som det fremgår af histologiske analyse og mangel på Keratin 5 og Keratin 14 basal epitelceller på immunfluorescens. Denne model vil tjene som et redskab til at undersøge cellulære og molekylære mekanismer involveret i vært remodeling.

Figur 1 viser et skematisk TETG såning og implantation. Knoglemarven er høstet fra C57BL/6 mus og kulturperler i vitro. BM-Middelhavspartnerlandene blev isoleret ved tæthed centrifugering og seedet på TETG. Seedede TETGs blev implanteret i en syngeneic C57BL/6 recipient mus.
Figur 2 er en oversigt over de PET:PU TETG stillads fremstillingsproces. Pet:pu lø...

Watch this Scientific Journal Video about Seeding and Implantation of a Biosynthetic Tissue-engineered Tracheal Graft in a Mouse Model at JoVE.com

Seeding and Implantation of a Biosynthetic Tissue-engineered Tracheal Graft in a Mouse Model

Transplantat stenose udgør en afgørende hindring i tissue Engineering luftvejene udskiftning. For at undersøge cellulære mekanismer bag stenose, benytter vi en murine model af væv manipuleret trakeal udskiftning med seedede knoglemarv mononukleære celler (BM-MNC). Her, detalje vi vores protokol, herunder stillads produktion, BM-MNC isolation, graft såning og implantation.

Såning og Implantation af en biosyntetiske væv-manipuleret trakeal Graft i en musemodel

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional ...

Kliniske anvendelser af vævsudviklet luftrør har været begrænset på grund af graft stenose og forsinket epitelisering. En musemodel af ortopisk trakeal udskiftning tillader undersøgelse af de cellulære mekanismer kørsel regenerering. Langsegmentdefekter i luftvejene kan overstige, hvad de nuværende behandlinger er i stand til at helbrede.Den væv-manipuleret luftrør giver mulighed for at skabe en erstatning organ for disse betingelser. Denne model kan anvendes på dyr med transgene og afstamning sporing egenskaber. Vi kan derefter modulere værtsfaktorer, der bidrager til graft regenerering.En af de vigtigste udfordringer i produktionen af stilladser vil være at måle og bestemme, at elektrospinning parametre er de samme hver gang. Så hver gang du producerer et stillads, skal du måle tip-til-samler afstand, fugtighed, og temperaturen for at sikre stilladser er de samme hver gang. Afgørende for succes af denne model er raffinement af de mikrokirurgiske teknikker og vedligeholdelse af den korrekte plan af anæstesi at tillade spontan ventilation under hele proceduren.Da værten luftrøret har en indre diameter på omkring en millimeter, graft og indfødte væv håndtering og sutur placering er vigtige og bedst demonstreres visuelt. Begynd med at opløse otte vægt procent polyethylenterephthalat, eller PET, i hexafluoroisopropanol og opvarmning af den resulterende opløsning til 60 grader Celsius. Mens opløsningen opvarmes, opløses tre vægtprocent polyurethan eller PU i hexafluoroisopropanol, der kombinerer opløsningerne, når PET-opløsningen er afkølet.Læg en 60-milliliter sprøjte udstyret med en 20-gauge stump-tip nål med polymer blandingen. Brug sprøjten og en højspænding DC strømforsyning indstillet til positive 14 kilovolts på nålen, en anden højspænding DC strømforsyning indstillet til minus tre kilovolts, en fem-milliliter-per-time strømningshastighed, og en 20-centimeter tip-til-substrat afstand til electrospin polymeren på en en-millimeter diameter rustfrit stål stang bliver drejet ved 350 rotationer i minuttet. Fortsæt elektrospinning indtil en 300-mikrometer stillads vægtykkelse er opnået.Skub derefter stilladset af stangen, placer stilladset under vakuum natten over for at fjerne eventuelle resterende opløsningsmiddel, og sterilisere stilladset med en ultraviolet lys dosis på 350 millijoule per centimeter kvadreret i ca 15 minutter. Under sterile forhold, fjerne huden fra baglemmer af en seks til otte uger gamle, kvindelige, C57-Black/6 mus med fine saks og mikro-Adson kraftang, og bruge Dumont nummer fem kraftbecer og Dumont nummer 5/45 kraftveksler til at fjerne fascia og sener. Adskaf knoglerne, så hver af dem kan skæres i begge ender, og brug en fem millilitersprøjte udstyret med en 25-gauge nål til at skylle knoglemarven i en petriskål indeholdende 30 milliliter RPMI medium.Når alle knoglerne er skyllet, filtreres knoglemarven gennem en 70-mikrometer nyloncelles si i et 50-milliliter konisk rør, og rør til et biosikkerhedsskab overføres. Tilsæt forsigtigt den filtrerede mononukleære celleopløsning ned ad siden af et 15-milliliterrør, der indeholder fem milliliter polysucrose og natriumdiatrizoat uden at blande lagene, og adskille plasmaet fra de hvide og røde blodlegemer ved densitetsgradientadseparation. Ved centrifugeringsafslutningen opsamler det midterste klare lag bestående af knoglemarvsmonukleare celler, og knoglemarvsmonukleare celler vaskes i et en-til-en-forhold i PBS ved centrifugering.Pelletsuspendrer pelletet op igen i fem milliliter PBS til endnu en vask efterfulgt af resuspension i 10 milliliter frisk RPMI-medium til tælling. Derefter indsamles cellerne med en ekstra centrifugering, og cellerne fortyndes til en gange 10 til de syv celler pr. fem mikroliter frisk RPMI-koncentration. Før såning af stilladset skæres polymeren til en fem millimeter lang længde efter behov, og stilladset skal du bruge fem mikroliter RPMI-medium i fem minutter.Ved slutningen af inkubationen fjernes det overskydende medium, og stilladslummen vejes med fem mikroliter af knoglemarvsmonuklear celleopløsningen i 10 minutter. Derefter indsættes en 21-gauge nål gennem stilladsets lumen, og placer transplantatet i en milliliter RPMI medium natten over i en 37-graders Celsius inkubator. Efter induktion af generel anæstesi, bekræfte en manglende reaktion på tå knivspids i recipientdyret, og anvende salve til dyrets øjne.Klip håret på operationsstedet fra hage til kraveben, og placere dyret på en kirurgisk pad i en dorsal liggende position. Brug aseptisk teknik, desinficere operationsstedet med en sekventiel povidone-jod, 70% ethanol, povidone-jod tørre serien, og flytte musen under en dissekere mikroskop med hovedet på 12:00. Brug fine saks og mikro-Adson kraftpind til at gøre en midterlinjen snit fra kraveben til hyoid knoglen, og bruge Dumont nummer fem og nummer syv fine kraftang og en steril vatpind til at rense fascia før du indsætter en selvbevarende Colibri retractor i snittet.Brug tangen til at åbne stropmusklerne for at udsætte skjoldbruskkirtlen brusk, cricoid brusk, og luftrør, og stumpt adskille luftrøret fra de tilbagevendende larynx nerver kører parallelt på hver side af vævet, efterfulgt af circumferential adskillelse af luftrøret fra spiserøret. Ved hjælp af en 20-gauge nål og kirurgisk markør, pletten den forreste del af luftrøret. Lav et snit under den tredje trakeal brusk ring ved hjælp af et par Vannas-Tubingen foråret saks og et par Dumont nummer syv fine kraftvices til at sekære en tre-ring del af luftrøret.Hold luftrøret med de fine buede stænvidde, brug en steril 9-0 nylonsutur for at sikre den distale ende af luftrøret til brystbenet for at skabe en midlertidig trakeostomi, og brug 20-gauge nålen og kirurgisk markør til at plette den forreste del af transplantatet. For at implantere transplantatet skal du bruge en 9-0 steril nylonsutur, Dumont nummer syv fine forpinte og en nåleholder til at indsætte de proksimale-posterior, proksimale laterale og proksimale forreste sting, og drej dyret 180 grader. Når musen er i position, slip den midlertidige trakeostomi, og lav et lateralt snit fem millimeter væk fra den forreste del af transplantatet for at lette den distale anastomose.For at fuldføre den distale anastomose, placere suturer på samme måde som den proksimale anastomose, og omdiskaere graft position og rem muskler. Luk derefter snittet med 9-0 sterile nylonsuturer i et løbemønster, og placer dyret alene i et genvindingsbur placeret på en varmepude med overvågning, indtil fuld helbredelse. To uger efter implantation, et par basal epitelceller kan observeres ved basal celle keratin fem og 14 farvning i væv-manipuleret luftrøret transplantat væv sektioner.Basalceller detekteres også på transplantatets luminaloverflade syv dage efter implantationen. Ved explantation og histologisk analyse er graft stenose blevet identificeret som den vigtigste medvirkende faktor i graft-implanterede mus, der viser tegn på åndedrætsbesvær og stridor. Bemærk, at teleskopi af transplantatet og indfødte luftrør er et fælles fund som følge af den kirurgiske teknik.Farvning for F4/80 afslører vært makrofager inden for stenotiske region af transplantatet i forbindelse med tilstedeværelsen af de basale epitelceller. Undgå manipulation af de tilbagevendende larynx nerver, og sikre, at de proksimale og distale suturer er på plads for at tillade en lufttæt forsegling på anastomose. Da denne protokol omhandler knoglemarvsmonukleare celler, der stammer fra biosikkerhedsniveau 1 agentmus, er det vigtigt at bære passende personlige værnemidler for at undgå kontaminering.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Autologous Endothelial Progenitor Cell-Seeding Technology and Biocompatibility Testing For Cardiovascular Devices in Large Animal Model

Implantable cardiovascular devices are manufactured from artificial materials (e.g. titanium (Ti), expanded polytetrafluoroethylene), which pose the risk ...

Protocol for Relative Hydrodynamic Assessment of Tri-leaflet Polymer Valves

Protokol for Relativ Hydrodynamic Vurdering af Tri-brochure Polymer Valves

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of ...

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

Kirurgisk Teknik for implantation af manipuleret væv kargrafter og efterfølgende<em&gt; In Vivo</em&gt; Overvågning

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large ...

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

Generation og podning af væv-manipuleret Fartøjer i en musemodel

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Produktion, karakterisering og potentielle anvendelse af en 3D-Tissue-manipuleret humant Esophageal Mucosal Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

En kombineret 3D manipuleret væv<em&gt; In vitro</em&gt; /<em&gt; I Silico</em&gt; Lunge Tumor Model for Forudsigelse Drug Effektivitet i specifikke mutations baggrunde

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

anvendelser af<em&gt; In vivo</em&gt; Funktionel Test af Rat tibialis anterior for Evaluering manipuleret væv Skeletal Muscle Repair

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Tre-dimensionelle Tissue Engineering justeret Astrocyte netværk for at sammenfatte udviklingsmæssige mekanismer og lette nervesystem regenerering

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Fabrikation af brugerdefinerede Agarosen Wells for celle såning og væv Ring samlesæt bruger 3D-trykt forme

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...