Name: seeding and implantation of a biosynthetic tissue-engineered tracheal graft in a mouse model
Uploaded: 2019-04-01T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Seeding and Implantation of a Biosynthetic Tissue-engineered Tracheal Graft in a Mouse Model at JoVE.com

Wij willen erkennen van Robert Strouse en de Research Information Solutions & innovaties divisie in landelijk Children's Hospital voor hun steun in grafisch ontwerp. Dit werk werd gesteund door een subsidie van de NIH (NHLBI K08HL138460).

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) in landelijk Children's Hospital.
1. steiger productie
<ol><li>Bereid een polymeer nanofiber voorloper oplossing door: 1) oplossen 8 wt % PET in 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol en verwarming van de oplossing tot 60 ° C en door 2) 3 wt % PU in 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Eenmaal afgekoeld, combineren de oplossingen voor het maken van ...

<ol>
	<li>Macchiarini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+transplantation+of+a+tissue-engineered+airway.">Clinical transplantation of a tissue-engineered airway.</a> The Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).</li><li>Jungebluth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracheobronchial+transplantation+with+a+stem-cell-seeded+bioartificial+nanocomposite:+A+proof-of-concept+study.">Tracheobronchial transplantation with a stem-cell-seeded bioartificial nanocomposite: A proof-of-concept study.</a> The Lancet. 378 (9808), 1997-2004 (2011).</li><li>Elliott, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-cell-based,+tissue+engineered+tracheal+replacement+in+a+child:+A+2-year+follow-up+study.">Stem-cell-based, tissue engineered tracheal replacement in a child: A 2-year follow-up study.</a> The Lancet. 380 (9846), 994-1000 (2012).</li><li>Chiang, T., Pepper, V., Best, C., Onwuka, E., Breuer, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Translation+of+Tissue+Engineered+Trachea+Grafts.">Clinical Translation of Tissue Engineered Trachea Grafts.</a> Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 125 (11), 873-885 (2016).</li><li>Clark, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cell+seeding+on+neotissue+formation+in+a+tissue+engineered+trachea.">Effect of cell seeding on neotissue formation in a tissue engineered trachea.</a> Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 49-55 (2016).</li><li>Cole, B. B., Smith, R. W., Jenkins, K. M., Graham, B. B., Reynolds, P. R., Reynolds, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracheal+basal+cells:+A+facultative+progenitor+cell+pool.">Tracheal basal cells: A facultative progenitor cell pool.</a> American Journal of Pathology. 177 (1), 362-376 (2010).</li><li>Onwuka, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+myeloid+cell-derived+PDGF-B+in+neotissue+formation+in+a+tissue-engineered+vascular+graft.">The role of myeloid cell-derived PDGF-B in neotissue formation in a tissue-engineered vascular graft.</a> Regenerative Medicine. 12 (3), 249-261 (2017).</li><li>Grimmer, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracheal+reconstruction+using+tissue-engineered+cartilage.">Tracheal reconstruction using tissue-engineered cartilage.</a> Archives of Otolaryngology - Head and Neck Surgery. 130 (10), 1191-1196 (2004).</li><li>Wood, M. W., Murphy, S. V., Feng, X., Wright, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracheal+reconstruction+in+a+canine+model.">Tracheal reconstruction in a canine model.</a> Otolaryngology - Head and Neck Surgery (United States). 150 (3), 428-433 (2014).</li><li>Haag, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+and+angiogenic+properties+of+tissue-engineered+rat+trachea+using+genipin+cross-linked+decellularized+tissue.">Biomechanical and angiogenic properties of tissue-engineered rat trachea using genipin cross-linked decellularized tissue.</a> Biomaterials. 33 (3), 780-789 (2012).</li><li>Best, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+a+tissue-engineered+tracheal+scaffold+for+preclinical+evaluation.">Designing a tissue-engineered tracheal scaffold for preclinical evaluation.</a> International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology. 104, 155-160 (2018).</li></ol>

Ontwikkeling van een muismodel voor weefsel ontworpen tracheas is essentieel in het begrip van de factoren die hebben beperkte klinische vertaling van de TETGs; namelijk graft ineenstorting, stenose en vertraagde epithelialization4. Een paar factoren die aan deze beperkingen bijdragen omvatten selectie van graft materiaal, het productieproces, de steiger ontwerp en de cel protocollen zaaien. Dit model zorgt voor snellere evaluatie van deze factoren om te begrijpen van de cellulaire en moleculaire ...

Lange-segment tracheale gebreken kunnen presenteren als zeldzame aangeboren aandoeningen zoals volledige tracheale ringen tracheale agenesie, evenals trauma, maligniteit en infectie. Wanneer meer dan 6 cm in volwassenen of 30% van de trachea lengte bij kinderen, worden deze gebreken niet behandeld door chirurgische reconstructie. Pogingen om de luchtweg vervangen door autoloog weefsel, dode foetussen transplantaties en kunstmatige constructies hebben geteisterd door chronische infectie, granulatie, mechanische storing en stenose.
Weefsel ontworpen tracheale transplantaties (TETGs) kunnen potentieel deze problemen aangepakt terwijl het vermijden van de noodzaak van levenslang bij immuunsuppressie. In het laatste decennium, zijn TETGs getest in diermodellen en klinisch gebruikt in zeldzame gevallen voor gebruik in schrijnende gevallen1,2,3. In zowel de klinische als de grote dierproeven, post-operatieve herstel van weefsel ontworpen airway vervanging vereist vele interventies voor de bestrijding stenose (gedefinieerd als > 50% luminal vernauwing) en onderhouden van de luchtwegen bij. Extra TETG werk heeft getracht om deze stenose door evaluatie van de rol van cel seeding keuze, vascularisatie en steiger ontwerp. Cel seeding keuzes en steiger ontwerp voor het herstel van de inheemse luchtpijp structuur/functie hebben hoofdzakelijk gericht geweest op de luchtwegen epitheliale cellen en chondrocyten ontpit op verschillende resorbeerbare, niet-resorbeerbare en decellularized steigers. Zoals vascularisatie waarschijnlijk een belangrijke rol in de ontwikkeling van stenose speelt, hebben andere groepen gericht op het optimaliseren van in vitro of heterotopic modellen voor het versnellen van revascularisatie of neoangiogenesis4. Succesvolle vascularisatie ook behoud van een mechanisch bevoegde en functionele TETG bereiken blijft echter een uitdaging. Ondanks de recente vooruitgang blijft minimaliseren van stenose een belangrijke belemmering klinische vertaling.
Om te onderzoeken dit histopathologisch antwoord op TETG implantatie in vivo, ontwikkelden we een schapen model van weefsel ontworpen tracheale vervanging. De prothese was samengesteld uit een gemengde polyethyleentereftalaat (PET) en polyurethaan (PU) electrospun steiger bezaaid met beenmerg-afgeleide mononucleaire cellen (BM-MDL). In dit kleine cohort bewezen we dat geplaatste autologe BM-MDL opnieuw epithelialization versnelde en vertraagd stenose5. Hoewel zaaien met autologe BM-MDL verbeterd overleven, blijft de cellulaire mechanisme waarmee BM-MDL de vorming van functionele neotissue moduleren onduidelijk.
Onderzoek op het cellulaire niveau vereist ontwikkeling van een lymfkliertest model van weefsel ontworpen tracheale vervanging. Gelijkaardig aan de schapen studie, wij gebruikt een PET:PU electrospun steiger bezaaid met BM-MDL. Consistent met de schapen model, TETG stenose ontwikkelde in de loop van de eerste twee weken na implantatie1,2,3 ,5. Dit stelde dat de lymfkliertest model gerecapituleerd de pathologie waargenomen eerder, zodat we kunnen verder ondervragen de cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de luchtweg stenose.
In dit verslag detailleren wij ons protocol voor weefsel ontworpen tracheale vervanging in het muismodel met inbegrip van de steiger productie, BM-MNC isolatie, graft zaaien en implantatie (Figuur 1, Figuur 2).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:827px;" width="827">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">0.9% Sodium chloride injection</td>
			<td style="width:119px;">APP Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:119px;">NDC 63323-186-10</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">10cc serological pipet</td>
			<td style="width:119px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">357551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">18G 1.5in. Needle</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">305190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">1mL Syringe</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">24-well plate</td>
			<td style="width:119px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">25cc serological pipet</td>
			<td style="width:119px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">356535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">25G 1in. Needle</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">305125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">50cc tube</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">Alcohol prep pads</td>
			<td style="width:119px;">Fisher Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">NDC 69250-661-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">Baytril (enrofloxacin) solution</td>
			<td style="width:119px;">Bayer Healthcare, LLC</td>
			<td style="width:119px;">NDC 0859-2267-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:423px;">Black polyamide monofilament suture, 9-0</td>
			<td style="width:119px;">AROSurgical Instruments Corporation</td>
			<td style="width:119px;">T05A09N10-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">C57BL/6, female</td>
			<td style="width:119px;">Jackson laboratories</td>
			<td style="width:119px;">664</td>
			<td style="width:167px;">6-8 weeks old</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Citrate Buffer pH 6.0 20x concentrate</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Colibri retractors</td>
			<td style="width:119px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">17000-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Cotton tipped applicators</td>
			<td style="width:119px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">23-400-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Cytokeratin 14 Monoclonal Antibody</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">MA5-11599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td style="width:119px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Dumont #5/45 forceps</td>
			<td style="width:119px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Dumont #7 - Fine Forceps</td>
			<td style="width:119px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">11274-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">F4/80 Rat anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:119px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">MCA497R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Ficoll</td>
			<td style="width:119px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">10831-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Fine scissors- Sharp-blunt</td>
			<td style="width:119px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">14028-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Fisherbrand Premium Cover Glasses</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">12-548-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Fluoroshield Mounting Media with DAPI</td>
			<td style="width:119px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab104139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Goat-anti mouse IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Goat-anti Rabbit IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">A-11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Goat-anti Rat IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 647</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">A-21247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">Ibuprofen</td>
			<td style="width:119px;">Precision Dose, Inc</td>
			<td style="width:119px;">NDC 68094-494-59</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:423px;">Iodine prep pads</td>
			<td style="width:119px;">Professional disposables international, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">NDC 10819-3883-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Keratin 5 Polyclonal Antibody, Purified</td>
			<td style="width:119px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">905501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Ketamine hydrochloride injection</td>
			<td style="width:119px;">Hospira Inc.</td>
			<td style="width:119px;">NDC 0409-2053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Micro-Adson forceps</td>
			<td style="width:119px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">11018-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Microscope</td>
			<td style="width:119px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">M80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Non-woven sponges</td>
			<td style="width:119px;">Covidien</td>
			<td style="width:119px;">441401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:423px;">Opthalmic ointment</td>
			<td style="width:119px;">Dechra Veterinary products</td>
			<td style="width:119px;">NDC 17033-211-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">PBS</td>
			<td style="width:119px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">PET/PU (Polyethylene terephthalate &#38; Polyurethane) scaffolds</td>
			<td style="width:119px;">Nanofiber solutions</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom ordered</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Petri dish</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">RPMI 1640 Medium</td>
			<td style="width:119px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">TISH Needle Holder/Forceps</td>
			<td style="width:119px;">Micrins</td>
			<td style="width:119px;">MI1540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Trimmer</td>
			<td style="width:119px;">Wahl</td>
			<td style="width:119px;">9854-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vannas-T&#252;bingen Spring Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15008-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Warm water recirculator</td>
			<td style="width:119px;">Gaymar</td>
			<td style="width:119px;">TP-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">Xylazine sterile solution</td>
			<td style="width:119px;">Akorn animal health</td>
			<td style="width:119px;">NDC 59399-110-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

seeding and implantation of a biosynthetic tissue-engineered tracheal graft in a mouse model

Behandelingsopties voor aangeboren of secundaire lange segment tracheale gebreken historisch beperkt gebleven als gevolg van een onvermogen om functionele weefsel vervangen. Weefselengineering houdt grote belofte als een mogelijke oplossing met haar vermogen om te integreren van cellen en signalering moleculen in een 3-dimensionale steiger. Recent werk met weefsel ontworpen tracheale transplantaties (TETGs) heeft gezien enig succes, maar hun vertaling heeft is beperkt door de stenose van de graft, graft ineenstorting en epithelialization vertraagd. Om te onderzoeken de mechanismen die deze kwesties rijden, hebben we een muismodel voor weefsel ontworpen tracheale graft implantatie. TETGs werden gebouwd met behulp van electrospun polymeren polyethyleentereftalaat (PET) en polyurethaan (PU) in een mengsel van PET en PU (20:80 percentage gewicht). Steigers werden vervolgens bezaaid met behulp van beenmerg mononucleaire cellen geïsoleerd van 6-8 week-oude C57BL/6 muizen door kleurovergang centrifugeren. Tien miljoen cellen per graft waren uitgezaaid op het lumen van de steiger en toegestaan om te broeden 's nachts vóór implantatie tussen de derde en zevende de tracheale ringen. Deze transplantaties in staat waren om de bevindingen van stenose recapituleren en vertraagd epithelialization zoals blijkt uit de histologische analyse en gebrek aan keratine 5 en keratine 14 basale epitheliale cellen op immunofluorescentie. Dit model zal dienen als een instrument voor het onderzoeken van cellulaire en moleculaire mechanismen die betrokken zijn in het remodelleren van de ontvangst.

Figuur 1 illustreert een schematische voorstelling van TETG zaaien en implantatie. Beenmerg is gekapt uit C57BL/6 muizen en gekweekt in vitro. BM-MDL waren geïsoleerd door dichtheid centrifugeren en ontpit op de TETG. Geplaatste TETGs waren een syngeneic C57BL/6 ontvangende muis ingeplant.
Figuur 2 is een overzicht van de PET:PU TETG steiger productieproces. P...

Watch this Scientific Journal Video about Seeding and Implantation of a Biosynthetic Tissue-engineered Tracheal Graft in a Mouse Model at JoVE.com

Seeding and Implantation of a Biosynthetic Tissue-engineered Tracheal Graft in a Mouse Model

Graft stenose vormt een kritische obstakel in weefsel ontworpen airway vervanging. Om te onderzoeken cellulaire mechanismen ten grondslag liggen aan stenose, gebruiken we een lymfkliertest model van weefsel ontworpen tracheale vervanging met geplaatste beenmerg mononucleaire cellen (BM-MNC). Hier, detail we onze protocol, met inbegrip van de steiger productie, BM-MNC isolatie, graft zaaien en implantatie.

Zaaien en implantatie van een Biosynthetic weefsel-engineered tracheale Graft in een muismodel

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional ...

Klinische toepassingen van weefsel-engineered luchtpijp zijn beperkt als gevolg van grafttenose en vertraagde epitheelialisatie. Een muismodel van orthotopische tracheale vervanging maakt de studie van de cellulaire mechanismen die regeneratie drijven mogelijk. Lange segment defecten van de luchtwegen kunnen groter zijn dan wat de huidige therapieën in staat zijn om te genezen.De weefsel-engineered luchtpijp biedt het potentieel om een vervangend orgaan voor deze voorwaarden te creëren. Dit model kan worden toegepast op dieren met transgene en lijntraceringseigenschappen. We kunnen dan moduleren de gastheer factoren die bijdragen aan graft regeneratie.Een van de belangrijkste uitdagingen bij het produceren van de steigers zal zijn het meten en bepalen dat de elektrospinning parameters zijn hetzelfde elke keer. Dus elke keer dat je een steiger produceert, moet je de tip-to-collector afstand, de vochtigheid en de temperatuur meten om ervoor te zorgen dat de steigers elke keer hetzelfde zijn. Cruciaal voor het succes van dit model is verfijning van de microchirurgische technieken en het onderhoud van het juiste verdovingsvlak om spontane ventilatie gedurende de hele procedure mogelijk te maken.Aangezien de gastheer luchtpijp heeft een interne diameter van ongeveer een millimeter, graft en inheemse weefsel behandeling en hechting plaatsing zijn belangrijk en het best visueel aangetoond. Begin met het oplossen van acht gewichts procent polyethyleentereftalaat, of PET, in hexafluoroisopropanol en het verwarmen van de resulterende oplossing tot 60 graden Celsius. Terwijl de oplossing wordt opgewarmd, los drie gewichts procent polyurethaan, of PU, in hexafluoroisopropanol, het combineren van de oplossingen zodra de PET-oplossing is afgekoeld.Laad een spuit van 60 milliliter uitgerust met een 20-gauge botpuntnaald met het polymeermengsel. Gebruik de spuit en een hoogspanningsstroomvoeding die is ingesteld op positieve 14 kilovolt op de naald, een andere hoogspanningsstroomvoeding die is ingesteld op min drie kilovolt, een stroomsnelheid van vijf milliliter per uur en een afstand van 20 centimeter tot substraat tot elektrospin het polymeer op een roestvrijstalen staaf met een diameter van één millimeter die bij 350 rotaties per minuut wordt gedraaid. Blijf elektrospinning tot een 300-micrometer steiger wanddikte is bereikt.Dan, schuif de steiger van de staaf, plaats het schavot onder vacuüm 's nachts om eventuele resterende oplosmiddel te verwijderen, en steriliseren het steiger met een ultraviolet licht dosering van 350 millijoule per centimeter in het kwadraat voor ongeveer 15 minuten. Onder steriele omstandigheden, verwijder de huid uit de achterste ledematen van een zes tot acht weken oude, vrouwelijke, C57-Black/6 muis met fijne schaar en micro-Adson tangen, en gebruik Dumont nummer vijf tangen en Dumont nummer 5/45 tangen om de fascia en de pezen te verwijderen. Scheid de botten om elk van hen te snijden aan beide uiteinden, en gebruik een vijf-milliliter spuit uitgerust met een 25-gauge naald om het beenmerg te spoelen in een petrischaal met 30 milliliter van RPMI medium.Wanneer alle botten zijn gespoeld, filter het beenmerg door een 70-micrometer nylon cel zeef in een 50-milliliter conische buis, en breng de buis naar een biosafety kabinet. Voeg voorzichtig de gefilterde mononucleaire celoplossing toe langs de zijkant van een buis van 15 milliliter met vijf milliliter polysucrose en natriumditrizoaat zonder de lagen te mengen, en scheid het plasma van de witte en rode bloedcellen door dichtheidgradiëntscheiding. Verzamel aan het einde van de centrifugatie de middelste heldere laag bestaande uit de beenmergmonnucleaire cellen en was de beenmergmonnucleaire cellen bij een één-op-één verhouding in PBS door centrifugatie.Resuspend de pellet in vijf milliliter PBS voor een tweede wasbeurt, gevolgd door resuspension in 10 milliliter van verse RPMI medium voor het tellen. Verzamel vervolgens de cellen met een extra centrifugatie en verdun de cellen tot een een keer 10 tot de zeven cellen per vijf microliter van verse RPMI-concentratie. Voordat u het steiger zaait, snijdt u het polymeer zo nodig tot een lengte van vijf millimeter en bevochtig het steiger met vijf microliters rpmi-medium gedurende vijf minuten.Verwijder aan het einde van de incubatie het overtollige medium en laad het steigerlumen met vijf microliter van de beenmergmonnucleaire celoplossing gedurende 10 minuten. Steek vervolgens een naald van 21 meter door het lumen van het schavot en plaats het transplantaat 's nachts in een 37-graden Celsius-incubator. Na inductie van algemene anesthesie, bevestig een gebrek aan reactie op teen knijpen in de ontvanger dier, en van toepassing zalf op de ogen van het dier.Clip het haar op de chirurgische site van kin tot sleutelbeenderen, en plaats het dier op een chirurgische pad in een dorsale ligfiets positie. Met behulp van aseptische techniek, desinfecteren de chirurgische site met een sequentiële povidone-jodium, 70%ethanol, povidone-jodium veeg serie, en beweeg de muis onder een ontleden microscoop met het hoofd op 12 uur. Gebruik fijne schaar en micro-Adson tangen om een middellijn incisie van de sleutelbeentjes aan het tongbeen te maken, en gebruik Dumont nummer vijf en nummer zeven fijne tangen en een steriel wattenstaafje om de fascia schoon te maken voordat u een zelfbehoudende Colibri-oprolmechanisme in de incisie plaatst.Gebruik de tangen om de riemspieren te openen om het schildklierkraakbeen, cricoid kraakbeen en luchtpijp bloot te stellen en de luchtpijp botweg te scheiden van de terugkerende laryngeale zenuwen die parallel lopen aan weerszijden van het weefsel, gevolgd door omtrekscheiding van de luchtpijp van de slokdarm. Met behulp van een 20-gauge naald en chirurgische marker, vlek het voorste gedeelte van de luchtpijp. Maak een incisie onder de derde tracheale kraakbeen ring met behulp van een paar Vannas-Tubingen voorjaar schaar en een paar Dumont nummer zeven fijne tangen om een drie-ring sectie van luchtpijp resect.Houd de luchtpijp met de fijne gebogen tangen, gebruik een steriele 9-0 nylon hechting om het distale uiteinde van de luchtpijp aan het borstbeen te beveiligen om een tijdelijke tracheostomie te creëren, en gebruik de 20-meter naaldmeter en chirurgische marker om het voorste gedeelte van het transplantaat te bevlekken. Om het transplantaat te implanteren, gebruik je een 9-0 steriele nylon hechting, Dumont nummer zeven fijne tangen en een naaldhouder om de proximale achterste, proximale-laterale en proximale voorste steken in te brengen en het dier 180 graden te draaien. Wanneer de muis in positie is, laat u de tijdelijke tracheostomie los en maak een laterale incisie vijf millimeter verwijderd van het voorste gedeelte van het transplantaat om de distale anastomose te vergemakkelijken.Om de distale anastomose te voltooien, plaatst u de hechtingen op een vergelijkbare manier als de proximale anastomose en benaadt u de graftpositie en riemspieren opnieuw. Sluit vervolgens de incisie met 9-0 steriele nylon hechtingen in een looppatroon en plaats het dier alleen in een herstelkooi die op een verwarmingskussen is geplaatst met controle tot volledig herstel. Twee weken na de implantatie kunnen enkele basale epitheelcellen worden waargenomen door basale celkeratine vijf en 14 kleuring in weefsel-engineered tracheale graft weefselsecties.Basale cellen worden ook gedetecteerd op het luminale oppervlak van het transplantaat op zeven dagen na implantatie. Bij explantatie en histologische analyse is grafttenose geïdentificeerd als de belangrijkste factor bij het transplanteren van geïmplanteerde muizen die tekenen van ademhalingsproblemen en stridor vertonen. Merk op dat telescopische van de graft en inheemse luchtpijp is een veel voorkomende bevinding als gevolg van de chirurgische techniek.Kleuring voor F4/80 onthult gastheermacrofagen binnen het stenotische gebied van het transplantaat in combinatie met de aanwezigheid van de basale epitheelcellen. Vermijd manipulatie van de terugkerende laryngeale zenuwen, en zorg ervoor dat de proximale en distale hechtingen op hun plaats zijn om een luchtdichte afdichting bij de anastomose mogelijk te maken. Aangezien dit protocol betrekking heeft op beenmergmonnucleaire cellen die zijn afgeleid van bioveiligheidsniveau één a-agentmuizen, is het belangrijk om passende persoonlijke beschermingsmiddelen te dragen om besmetting te voorkomen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Het creëren van twee-dimensionale Patterned Substraten voor eiwit en Cell opsluiting

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Autologous Endothelial Progenitor Cell-Seeding Technology and Biocompatibility Testing For Cardiovascular Devices in Large Animal Model

Autologe endotheliale voorlopercellen-zaaien Technologie en biocompatibiliteitstests voor cardiovasculaire apparaten in grote Animal Model

Implantable cardiovascular devices are manufactured from artificial materials (e.g. titanium (Ti), expanded polytetrafluoroethylene), which pose the risk ...

Protocol for Relative Hydrodynamic Assessment of Tri-leaflet Polymer Valves

Protocol voor Relatieve Hydrodynamische Beoordeling van Tri-folder Polymer Valves

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of ...

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

Chirurgische techniek voor de inplanting van Tissue Engineered vaattransplantaten en de daaropvolgende<em&gt; In Vivo</em&gt; Monitoring

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large ...

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

Generatie en enten van-Weefselmanipulatieproducten Schepen in een muismodel

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Productie, karakterisering en toepassingsmogelijkheden van een 3D Tissue-engineered Human Slokdarmkanker Mucosale Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

Een gecombineerde 3D Weefselmanipulatieproducten<em&gt; In Vitro</em&gt; /<em&gt; In Silico</em&gt; Lung Tumor Model voor het voorspellen van de Drug Effectiveness in Specifieke Mutatie Achtergronden

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

toepassingen van<em&gt; In Vivo</em&gt; Functioneel testen van de Rat tibialis anterior voor de evaluatie van Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Drie-dimensionale weefsel ontworpen uitgelijnd Astrocyt netwerken vergemakkelijken zenuwstelsel regeneratie te recapituleren Developmental mechanismen

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Fabricage van aangepaste Agarose putten voor het zaaien van de cellen en weefsel Ring zelf-assemblage met behulp van 3D-gedrukte mallen

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...