Name: seeding and implantation of a biosynthetic tissue-engineered tracheal graft in a mouse model
Uploaded: 2019-04-01T14:30:00
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Wir würden gerne Robert Strouse und die Forschung Information Solutions & Innovationen Division bei Nationwide Children Hospital für ihre Unterstützung in Grafik-Design zu erkennen. Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss von der NIH (NHLBI K08HL138460) unterstützt.

Alle hier beschriebene Methoden wurden von der institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) am bundesweiten Kinderkrankenhaus genehmigt.
(1) Gerüst Herstellung
<ol><li>Vorbereiten eine Polymerlösung Nanofaser Vorläufer von: (1) Auflösung 8 Gew.-% PET in 1,1,1,3,3,3-Hexafluoroisopropanol und Heizlösung auf 60 ° C und durch 2) auflösen 3 Gew.-% PU in 1,1,1,3,3,3-Hexafluoroisopropanol bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Sobald Sie abgekühlt, kombinieren Sie die Lösungen um eine...

<ol>
	<li>Macchiarini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+transplantation+of+a+tissue-engineered+airway.">Clinical transplantation of a tissue-engineered airway.</a> The Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).</li><li>Jungebluth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracheobronchial+transplantation+with+a+stem-cell-seeded+bioartificial+nanocomposite:+A+proof-of-concept+study.">Tracheobronchial transplantation with a stem-cell-seeded bioartificial nanocomposite: A proof-of-concept study.</a> The Lancet. 378 (9808), 1997-2004 (2011).</li><li>Elliott, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-cell-based,+tissue+engineered+tracheal+replacement+in+a+child:+A+2-year+follow-up+study.">Stem-cell-based, tissue engineered tracheal replacement in a child: A 2-year follow-up study.</a> The Lancet. 380 (9846), 994-1000 (2012).</li><li>Chiang, T., Pepper, V., Best, C., Onwuka, E., Breuer, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Translation+of+Tissue+Engineered+Trachea+Grafts.">Clinical Translation of Tissue Engineered Trachea Grafts.</a> Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 125 (11), 873-885 (2016).</li><li>Clark, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cell+seeding+on+neotissue+formation+in+a+tissue+engineered+trachea.">Effect of cell seeding on neotissue formation in a tissue engineered trachea.</a> Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 49-55 (2016).</li><li>Cole, B. B., Smith, R. W., Jenkins, K. M., Graham, B. B., Reynolds, P. R., Reynolds, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracheal+basal+cells:+A+facultative+progenitor+cell+pool.">Tracheal basal cells: A facultative progenitor cell pool.</a> American Journal of Pathology. 177 (1), 362-376 (2010).</li><li>Onwuka, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+myeloid+cell-derived+PDGF-B+in+neotissue+formation+in+a+tissue-engineered+vascular+graft.">The role of myeloid cell-derived PDGF-B in neotissue formation in a tissue-engineered vascular graft.</a> Regenerative Medicine. 12 (3), 249-261 (2017).</li><li>Grimmer, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracheal+reconstruction+using+tissue-engineered+cartilage.">Tracheal reconstruction using tissue-engineered cartilage.</a> Archives of Otolaryngology - Head and Neck Surgery. 130 (10), 1191-1196 (2004).</li><li>Wood, M. W., Murphy, S. V., Feng, X., Wright, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracheal+reconstruction+in+a+canine+model.">Tracheal reconstruction in a canine model.</a> Otolaryngology - Head and Neck Surgery (United States). 150 (3), 428-433 (2014).</li><li>Haag, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+and+angiogenic+properties+of+tissue-engineered+rat+trachea+using+genipin+cross-linked+decellularized+tissue.">Biomechanical and angiogenic properties of tissue-engineered rat trachea using genipin cross-linked decellularized tissue.</a> Biomaterials. 33 (3), 780-789 (2012).</li><li>Best, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+a+tissue-engineered+tracheal+scaffold+for+preclinical+evaluation.">Designing a tissue-engineered tracheal scaffold for preclinical evaluation.</a> International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology. 104, 155-160 (2018).</li></ol>

Entwicklung von einem Maus-Modell für Gewebezüchtungen Tracheas ist wesentlich für das Verständnis der Faktoren, die klinische Übersetzung von der TETGs begrenzt haben; nämlich Transplantat Zusammenbruch, Stenose und verzögerte Epithelisierung4. Ein paar Faktoren, die zu diesen Einschränkungen zählen Transplantat Materialauswahl, den Herstellungsprozess, Gerüst Design und Zelle Aussaat Protokolle. Dieses Modell ermöglicht eine schnellere Auswertung dieser Faktoren Verständnis der zellu...

Long-Segment trachealen Mängel können als seltene angeborene Erkrankungen wie komplette trachealen Ringe und trachealen Agenesie sowie Trauma, Bösartigkeit und Infektion darstellen. Bei Überschreitung von 6 cm bei Erwachsenen oder 30 % der trachealen Länge bei Kindern können diese Mängel durch chirurgische Rekonstruktion behandelt werden. Versuche, die Atemwege mit Eigengewebe, cadaveric Transplantationen und künstliche Konstrukte zu ersetzen haben chronische Infektion, Granulation, mechanisches Versagen und Stenose geplagt.
Gewebezüchtungen trachealen Transplantate (TETGs) können möglicherweise diese Probleme anzugehen, unter Vermeidung der Notwendigkeit einer lebenslangen Immunsuppression. In den letzten zehn Jahren wurden TETGs im Tiermodell getestet und klinisch eingesetzt, in seltenen Fällen von compassionate-Use1,2,3. In sowohl großen als auch klinische Untersuchungen an Tieren, postoperative Erholung von Gewebezüchtungen Atemwege Ersatz benötigt zahlreiche Interventionen zur Bekämpfung Stenose (definiert als > 50 % luminalen Verengung) und Durchgängigkeit der Atemwege zu erhalten. Zusätzliche TETG Arbeit hat versucht, diese Stenose durch Bewertung der Rolle der Zelle Aussaat Wahl, Vaskularisierung und Gerüst Design zu reduzieren. Zelle seeding Entscheidungen und Gerüst Design zur Wiederherstellung der native Luftröhre Struktur/Funktion haben sich vor allem auf respiratorische Epithelzellen und Chondrozyten auf verschiedenen decellularized, resorbierbaren und nicht resorbierbaren Gerüsten ausgesät konzentriert. Wie Vaskularisierung wahrscheinlich eine wichtige Rolle bei der Entwicklung der Stenose spielt, haben andere Gruppen fokussiert auf die Optimierung in Vitro oder heterotopisch Modelle Revaskularisation oder Neoangiogenese4zu beschleunigen. Dennoch bleibt es eine Herausforderung, erfolgreiche Vaskularisierung und gleichzeitig mechanisch kompetent und funktionelle TETG zu erreichen. Trotz der jüngsten Fortschritte bleibt die Minimierung der Stenose eine kritische Hindernis für klinische Übersetzung.
Um diese histopathologische Reaktion auf TETG Implantation in Vivozu untersuchen, haben wir eine Schafe Gewebezüchtungen trachealen Ersatz-Modell entwickelt. Das Transplantat bestand aus einer gemischten Polyethylenterephthalat (PET) und Polyurethan (PU)-Electrospun-Gerüst mit dem Knochenmark stammenden mononukleären Zellen (BM-MNU) ausgesät. In dieser kleinen Kohorte haben wir bewiesen, dass gesetzte autologe BM-MNCs Re Epithelisierung beschleunigt und Stenose5 verzögert. Aussaat mit autologen BM-MNCs verbessert überleben, bleibt unklar jedoch der zelluläre Mechanismus durch den BM-MNCs die Bildung von funktionalen Neotissue modulieren.
Untersuchung auf der zellulären Ebene erforderlichen Entwicklung ein Mausmodell des Gewebes entwickelt trachealen Ersatz. Ähnlich wie bei den Schafen Studie, wir nutzten ein PET:PU Electrospun Gerüst ausgesät mit BM-MNCs. in Übereinstimmung mit den Schafen Modell TETG Stenose entwickelt im Laufe der ersten zwei Wochen nach Implantation1,2,3 ,5. Dies suggeriert, dass das Mausmodell die Pathologie zuvor beobachtet es uns ermöglicht, weiter die zellulären Mechanismen, die Atemwege Stenose Verhören zusammengefaßt.
In diesem Bericht beschreiben wir unser Protokoll für Tissue Engineering trachealen Ersatz im Mausmodell einschließlich Gerüst Herstellung, BM-MNC Isolierung Transplantat Aussaat und Implantation (Abbildung 1, Abbildung 2).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:827px;" width="827">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">0.9% Sodium chloride injection</td>
			<td style="width:119px;">APP Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:119px;">NDC 63323-186-10</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">10cc serological pipet</td>
			<td style="width:119px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">357551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">18G 1.5in. Needle</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">305190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">1mL Syringe</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">24-well plate</td>
			<td style="width:119px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">25cc serological pipet</td>
			<td style="width:119px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">356535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">25G 1in. Needle</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">305125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">50cc tube</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">Alcohol prep pads</td>
			<td style="width:119px;">Fisher Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">NDC 69250-661-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">Baytril (enrofloxacin) solution</td>
			<td style="width:119px;">Bayer Healthcare, LLC</td>
			<td style="width:119px;">NDC 0859-2267-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:423px;">Black polyamide monofilament suture, 9-0</td>
			<td style="width:119px;">AROSurgical Instruments Corporation</td>
			<td style="width:119px;">T05A09N10-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">C57BL/6, female</td>
			<td style="width:119px;">Jackson laboratories</td>
			<td style="width:119px;">664</td>
			<td style="width:167px;">6-8 weeks old</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Citrate Buffer pH 6.0 20x concentrate</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Colibri retractors</td>
			<td style="width:119px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">17000-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Cotton tipped applicators</td>
			<td style="width:119px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">23-400-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Cytokeratin 14 Monoclonal Antibody</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">MA5-11599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td style="width:119px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Dumont #5/45 forceps</td>
			<td style="width:119px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Dumont #7 - Fine Forceps</td>
			<td style="width:119px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">11274-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">F4/80 Rat anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:119px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">MCA497R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Ficoll</td>
			<td style="width:119px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">10831-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Fine scissors- Sharp-blunt</td>
			<td style="width:119px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">14028-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Fisherbrand Premium Cover Glasses</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">12-548-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Fluoroshield Mounting Media with DAPI</td>
			<td style="width:119px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab104139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Goat-anti mouse IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Goat-anti Rabbit IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">A-11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Goat-anti Rat IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 647</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">A-21247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">Ibuprofen</td>
			<td style="width:119px;">Precision Dose, Inc</td>
			<td style="width:119px;">NDC 68094-494-59</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:423px;">Iodine prep pads</td>
			<td style="width:119px;">Professional disposables international, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">NDC 10819-3883-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Keratin 5 Polyclonal Antibody, Purified</td>
			<td style="width:119px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">905501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Ketamine hydrochloride injection</td>
			<td style="width:119px;">Hospira Inc.</td>
			<td style="width:119px;">NDC 0409-2053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Micro-Adson forceps</td>
			<td style="width:119px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">11018-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Microscope</td>
			<td style="width:119px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">M80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Non-woven sponges</td>
			<td style="width:119px;">Covidien</td>
			<td style="width:119px;">441401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:423px;">Opthalmic ointment</td>
			<td style="width:119px;">Dechra Veterinary products</td>
			<td style="width:119px;">NDC 17033-211-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">PBS</td>
			<td style="width:119px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">PET/PU (Polyethylene terephthalate &#38; Polyurethane) scaffolds</td>
			<td style="width:119px;">Nanofiber solutions</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom ordered</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Petri dish</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">RPMI 1640 Medium</td>
			<td style="width:119px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">TISH Needle Holder/Forceps</td>
			<td style="width:119px;">Micrins</td>
			<td style="width:119px;">MI1540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Trimmer</td>
			<td style="width:119px;">Wahl</td>
			<td style="width:119px;">9854-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vannas-T&#252;bingen Spring Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15008-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Warm water recirculator</td>
			<td style="width:119px;">Gaymar</td>
			<td style="width:119px;">TP-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">Xylazine sterile solution</td>
			<td style="width:119px;">Akorn animal health</td>
			<td style="width:119px;">NDC 59399-110-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

seeding and implantation of a biosynthetic tissue-engineered tracheal graft in a mouse model

Behandlungsmöglichkeiten bei angeborenen oder sekundäre langes Segment trachealen Mängel wurden historisch beschränkt aufgrund einer Unfähigkeit, funktionale Gewebe ersetzen. Gewebetechnik hält großes Versprechen als eine mögliche Lösung mit seiner Fähigkeit, Zellen und Signalmoleküle in eine 3-dimensionale Gerüst zu integrieren. Neuere Arbeiten mit Gewebezüchtungen trachealen Transplantationen (TETGs) hat einige Erfolge gesehen, aber ihre Übersetzung von Transplantat Stenose begrenzt, Transplantat Zusammenbruch und Epithelisierung verzögert. Um die Mechanismen fahren diese Fragen zu untersuchen, haben wir ein Mausmodell für Gewebezüchtungen trachealen Graft Implantation entwickelt. TETGs wurden unter Verwendung Electrospun Polymere Polyethylenterephthalat (PET) und Polyurethan (PU) in einer Mischung aus PET und PU (20: 80 Prozent Gewicht) konstruiert. Gerüste wurden dann ausgesät mit Knochenmark mononukleären Zellen isoliert von 6-8 Wochen-alte C57BL/6 Mäusen durch gradient zentrifugieren. 10 Millionen Zellen pro Graft waren auf das Lumen des Gerüstes ausgesät und erlaubt über Nacht vor der Implantation zwischen dem dritten und siebten trachealen Ringe auszubrüten. Diese Transplantate konnten die Ergebnisse der Stenose zu rekapitulieren und Epithelisierung verzögert, wie histologische Analyse und Mangel an Keratin 5 und Keratin 14 basalen Epithelzellen auf Immunfluoreszenz zeigen. Dieses Modell dient als Instrument für die Untersuchung von zellulärer und molekularer Mechanismen Host Umgestaltung beteiligt.

Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung des TETG Aussaat und Implantation. Knochenmark von Mäusen C57BL/6 geerntet wurde und in Vitrokultiviert. BM-MNCs wurden durch Dichte Zentrifugierung isoliert und auf den TETG ausgesät. Kernigen TETGs wurden in einem Phänomen C57BL/6 Empfänger Maus implantiert.
Abbildung 2 zeigt eine Übersicht über die PET:PU...

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Seeding and Implantation of a Biosynthetic Tissue-engineered Tracheal Graft in a Mouse Model

Transplantat Stenose stellt eine kritische Hindernis Gewebezüchtungen Atemwege Ersatz. Um zellulären Mechanismen, die Stenose zu untersuchen, verwenden wir ein Mausmodell entwickelt trachealen Gewebeersatz mit kernigen Knochenmark mononukleären Zellen (BM-MNC). Hier zeigen wir unsere Protokoll, einschließlich Gerüst Herstellung, BM-MNC Isolierung Transplantat Aussaat und Implantation.

Aussaat und Implantation von einem biosynthetischen Tissue-Engineering trachealen Transplantat in einem Mausmodell

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional ...

Klinische Anwendungen von gewebetechnischen Luftröhren wurden aufgrund von Transplantatstenose und verzögerter Epithelisierung eingeschränkt. Ein Mausmodell des orthotopischen Trachealersatzes ermöglicht die Untersuchung der zellulären Mechanismen, die die Regeneration vorantreiben. Langsegmentdefekte der Atemwege können über das hinausgehen, was aktuelle Therapien heilen können.Die gewebegefertigte Luftröhre bietet das Potenzial, ein Ersatzorgan für diese Bedingungen zu schaffen. Dieses Modell kann auf Tiere mit transgenen und Linienverfolgungseigenschaften angewendet werden. Wir können dann die Wirtsfaktoren modulieren, die zur Transplantatregeneration beitragen.Eine der wichtigsten Herausforderungen bei der Herstellung der Gerüste wird die Messung und Bestimmung sein, dass die Elektrospinnparameter jedes Mal gleich sind. Jedes Mal, wenn Sie ein Gerüst herstellen, müssen Sie den Abstand von Spitze zu Kollektor, die Luftfeuchtigkeit und die Temperatur messen, um sicherzustellen, dass die Gerüste jedes Mal gleich sind. Entscheidend für den Erfolg dieses Modells ist die Verfeinerung der mikrochirurgischen Techniken und die Aufrechterhaltung der richtigen Anästhesieebene, um eine spontane Beatmung während des gesamten Verfahrens zu ermöglichen.Da die Wirtstsrache einen Innendurchmesser von rund einem Millimeter hat, sind Transplantat und nativegewebehandhabung und Nahtplatzierung wichtig und am besten visuell demonstriert. Beginnen Sie mit der Auflösung von acht Gewichtsprozent Polyethylenterephthalat oder PET in Hexafluorisopropanol und erhitzen Sie die resultierende Lösung auf 60 Grad Celsius. Während die Lösung erwärmt wird, lösen Sie drei Gewichtsprozent Polyurethan oder PU in Hexafluoroisopropanol auf und kombinieren Sie die Lösungen, sobald die PET-Lösung abgekühlt ist.Laden Sie eine 60-Milliliter-Spritze mit einer 20-Spur-Stumpfspitzennadel mit dem Polymergemisch. Verwenden Sie die Spritze und ein Hochspannungs-GLEICHstrom-Netzteil auf positive 14 Kilovolt auf der Nadel, eine weitere Hochspannungs-Gleichstrom-Stromversorgung auf minus drei Kilovolt, eine Durchflussrate von fünf Millilitern pro Stunde und einen 20-Zentimeter-Spitzen-substrat-Abstand zum Elektrospin des Polymers auf einen Edelstahlstab mit einem Durchmesser von einem Millimeter, der mit 350 Rotationen pro Minute gedreht wird. Weiter Elektrospinnen, bis eine 300-Mikrometer Gerüstwanddicke erreicht ist.Dann schieben Sie das Gerüst von der Stange, legen Sie das Gerüst über Nacht unter Vakuum, um restlicheLösungsmittel zu entfernen, und sterilisieren Sie das Gerüst mit einer ultravioletten Lichtdosis von 350 Millijoule pro Zentimeter quadratisch für etwa 15 Minuten. Entfernen Sie unter sterilen Bedingungen die Haut von den Hinterbeinen einer sechs bis acht Wochen alten, weiblichen, C57-Black/6 Maus mit feiner Schere und Mikro-Adson-Zange, und verwenden Sie Dumont Nummer fünf Zangen und Dumont Nummer 5/45 Zangen, um die Faszien und die Sehnen zu entfernen. Trennen Sie die Knochen, damit jeder von ihnen an beiden Enden geschnitten werden kann, und verwenden Sie eine Fünf-Milliliter-Spritze, die mit einer 25-Spur-Nadel ausgestattet ist, um das Knochenmark in eine Petrischale mit 30 Milliliter RPMI-Medium zu spülen.Wenn alle Knochen gespült wurden, filtern Sie das Knochenmark durch ein 70-Mikrometer Nylon-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Konikonrohr und übertragen Sie das Rohr in einen Biosicherheitsschrank. Fügen Sie die gefilterte mononukleäre Zelllösung vorsichtig an der Seite eines 15-Milliliter-Rohrs mit fünf Millilitern Polysucrose und Natriumdiatrizoat hinzu, ohne die Schichten zu mischen, und trennen Sie das Plasma von den weißen und roten Blutkörperchen durch Dichtegradiententrennung. Am Ende der Zentrifugation die mittlere klare Schicht, die aus den mononukleären Knochenmarkzellen besteht, zu sammeln und die mononukleären Knochenmarkzellen im PBS-Verhältnis durch Zentrifugation eins zu eins zu waschen.Setzen Sie das Pellet in fünf Milliliter PBS für eine zweite Wäsche wieder auf, gefolgt von einer Resuspension in 10 Milliliter frisches RPMI-Medium zum Zählen. Dann sammeln Sie die Zellen mit einer zusätzlichen Zentrifugation, und verdünnen Sie die Zellen auf ein mal 10 bis die sieben Zellen pro fünf Mikroliter frischer RPMI-Konzentration. Vor dem Aussäen des Gerüstes das Polymer bei Bedarf auf eine Länge von fünf Millimetern schneiden und das Gerüst fünf Minuten lang mit fünf Mikrolitern RPMI-Medium befeuchten.Am Ende der Inkubation das überschüssige Medium entfernen und das Gerüstlumen mit fünf Mikrolitern der mononukleären Zelllösung des Knochenmarks 10 Minuten beladen. Legen Sie dann eine 21-Spur-Nadel durch das Lumen des Gerüsts und legen Sie das Transplantat über Nacht in einem 37-Grad-Celsius-Inkubator in einem Milliliter RPMI-Medium. Nach der Induktion der Vollnarkose, bestätigen Sie einen Mangel an Reaktion auf Zehenstich im Empfängertier, und tragen Salbe auf die Augen des Tieres.Schneiden Sie das Haar auf der chirurgischen Stelle vom Kinn bis zu den Claviken, und legen Sie das Tier auf einem chirurgischen Pad in einer dorsalen Liegeposition. Mit aseptischer Technik desinfizieren Sie die operationsische Stelle mit einem sequenziellen Povidon-Jod, 70% Ethanol, Povidon-Jod-Wischserie, und bewegen Sie die Maus unter einem Sezieren Mikroskop mit dem Kopf bei 12 Uhr. Verwenden Sie feine Schere und Mikro-Adson Zange, um einen Mittellinienschnitt von den Clavuinus zum Hyoidknochen zu machen, und verwenden Sie Dumont Nummer fünf und Nummer sieben feine Zangen und einen sterilen Wattestäbchen, um die Faszie zu reinigen, bevor Sie einen selbsterhaltenden Colibri-Retraktor in den Schnitt einfügen.Verwenden Sie die Zange, um die Riemenmuskeln zu öffnen, um die Schilddrüsenknorpel, Cricoid Knorpel, und Luftröhre, und stumpf trennen Sie die Luftröhre von den wiederkehrenden Kehlkopfnerven parallel auf beiden Seiten des Gewebes laufen, gefolgt von umfangren Trennung der Luftröhre von der Speiseröhre. Mit einer 20-Spur-Nadel und chirurgischen Marker, Färben Sie den vorderen Teil der Luftröhre. Machen Sie einen Schnitt unterhalb des dritten Trachealknorpelrings mit einer Vannas-Tubingen-Federschere und einem Paar Dumont-Nummer sieben feiner Zangen, um einen Drei-Ring-Abschnitt der Luftröhre wiederherzustellen.Halten Sie die Luftröhre mit den feinen gekrümmten Zangen, verwenden Sie eine sterile 9-0 Nylon Naht, um das distale Ende der Luftröhre zum Brustbein zu sichern, um eine temporäre Tracheostomie zu erstellen, und verwenden Sie die 20-Spur-Nadel und chirurgischen Marker, um den vorderen Teil des Transplantats zu färben. Um das Transplantat zu implantieren, verwenden Sie eine 9-0 sterile Nylonnaht, Dumont Nummer sieben feine Zangen und einen Nadelhalter, um die proximal-posterior, proximal-lateral und proximal-anterior Stiche einzufügen, und drehen Sie das Tier um 180 Grad. Wenn die Maus in Position ist, lassen Sie die temporäre Tracheostomie los und machen Sie einen seitlichen Schnitt fünf Millimeter vom vorderen Teil des Transplantats entfernt, um die distale Anastomose zu erleichtern.Um die distale Anastomose zu vervollständigen, legen Sie die Nähte in ähnlicher Weise wie die proximale Anastomose, und nähern Sie die Transplantatposition und die Riemenmuskulatur wieder an. Schließen Sie dann den Schnitt mit 9-0 sterilen Nylonnähten in einem Laufmuster, und legen Sie das Tier allein in einen Erholungskäfig, der auf einem Heizkissen mit Überwachung bis zur vollständigen Genesung platziert ist. Zwei Wochen nach der Implantation können einige Basalepithelzellen durch Basalzellkeratin fünf und 14 Färbungen in gewebetechnischen Trachealtransplantatgewebeabschnitten beobachtet werden.Basalzellen werden auch sieben Tage nach der Implantation auf der luminalen Oberfläche des Transplantats nachgewiesen. Nach der Explantation und histologischen Analyse wurde die Transplantatstenose als Hauptfaktor bei transplantatimplantierten Mäusen identifiziert, die Anzeichen von Atemnot und Stridor aufwiesen. Beachten Sie, dass das Teleskopieren des Transplantats und der nativen Luftröhre ein häufiges Ergebnis der chirurgischen Technik ist.Die Färbung für F4/80 zeigt Wirtsmakrophagen innerhalb der stenotischen Region des Transplantats in Verbindung mit dem Vorhandensein der Basalepithelzellen. Vermeiden Sie manipulationder Kehlkopfnerven und stellen Sie sicher, dass die proximalen und distalen Nähte vorhanden sind, um eine luftdichte Abdichtung an der Anastomose zu ermöglichen. Da sich dieses Protokoll mit mononukleären Knochenmarkzellen befasst, die von Mäusen auf Biosicherheitsstufe 1 stammen, ist es wichtig, geeignete persönliche Schutzausrüstung enden zu lassen, um eine Kontamination zu vermeiden.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Erstellen Zweidimensionale Patterned Substrate für Protein-und Zell-Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Forschung

Biotechnik

Autologous Endothelial Progenitor Cell-Seeding Technology and Biocompatibility Testing For Cardiovascular Devices in Large Animal Model

Autologe endotheliale Vorläuferzellen Cell-Sätechnik und Biokompatibilitätstestung Für Herz-Kreislauf-Geräte in Großtiermodell

Implantable cardiovascular devices are manufactured from artificial materials (e.g. titanium (Ti), expanded polytetrafluoroethylene), which pose the risk ...

Protocol for Relative Hydrodynamic Assessment of Tri-leaflet Polymer Valves

Protokoll für Relative Hydrodynamische Beurteilung der Tri-Polymer Merkblatt Ventile

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of ...

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

Operationstechnik zur Implantation von Tissue Engineered Gefäßprothesen und Folge<em&gt; In-vivo-</em&gt; Überwachung

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large ...

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

Generierung und Pfropfen von Tissue Engineering Gefäße in einem Maus-Modell

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Herstellung, Charakterisierung und Einsatzmöglichkeiten von 3D-Tissue-Engineering Menschen Ösophagus-Schleimhaut-Modell

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

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Ein kombiniertes 3D-Gewebezüchtungen<em&gt; In Vitro</em&gt; /<em&gt; In Silico</em&gt; Lungentumormodell für Hintergründe in bestimmten Mutations Drug Wirksamkeit vorhersagen

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

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Anwendungen<em&gt; In Vivo</em&gt; Funktionstest der Ratte Vorderer Schienbeingewebe Skeletal Muscle Repair Engineered für die Bewertung

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Dreidimensionale Gewebezüchtungen ausgerichtet Astrozyten Netzwerke Nervensystem Regeneration zu rekapitulieren Entwicklungsmechanismen

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Herstellung von benutzerdefinierten Agarose Brunnen für die Aussaat von Zelle und Gewebe Ring Selbstmontage mit 3D-Druck Formen

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