Name: seeding and implantation of a biosynthetic tissue-engineered tracheal graft in a mouse model
Uploaded: 2019-04-01T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Seeding and Implantation of a Biosynthetic Tissue-engineered Tracheal Graft in a Mouse Model at JoVE.com

ברצוננו להודות רוברט שטראוס, את פתרונות מידע מחקר & חטיבת חידושים מבית החולים לילדים ארצית על תמיכתם בעיצוב גרפי. עבודה זו נתמכה על ידי מענק של NIH (NHLBI K08HL138460).

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) בבית החולים לילדים ארצית.
1. לגרדום הייצור
<ol><li>להכין פתרון קודמן פולימר nanofiber מאת: 1) המסת 8 wt % מחמד 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol, חימום הפתרון עד 60 ° צלזיוס, על ידי 2) המסת 3% wt פו 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol בטמפרטורת ...

<ol>
	<li>Macchiarini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+transplantation+of+a+tissue-engineered+airway.">Clinical transplantation of a tissue-engineered airway.</a> The Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).</li><li>Jungebluth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracheobronchial+transplantation+with+a+stem-cell-seeded+bioartificial+nanocomposite:+A+proof-of-concept+study.">Tracheobronchial transplantation with a stem-cell-seeded bioartificial nanocomposite: A proof-of-concept study.</a> The Lancet. 378 (9808), 1997-2004 (2011).</li><li>Elliott, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-cell-based,+tissue+engineered+tracheal+replacement+in+a+child:+A+2-year+follow-up+study.">Stem-cell-based, tissue engineered tracheal replacement in a child: A 2-year follow-up study.</a> The Lancet. 380 (9846), 994-1000 (2012).</li><li>Chiang, T., Pepper, V., Best, C., Onwuka, E., Breuer, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Translation+of+Tissue+Engineered+Trachea+Grafts.">Clinical Translation of Tissue Engineered Trachea Grafts.</a> Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 125 (11), 873-885 (2016).</li><li>Clark, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cell+seeding+on+neotissue+formation+in+a+tissue+engineered+trachea.">Effect of cell seeding on neotissue formation in a tissue engineered trachea.</a> Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 49-55 (2016).</li><li>Cole, B. B., Smith, R. W., Jenkins, K. M., Graham, B. B., Reynolds, P. R., Reynolds, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracheal+basal+cells:+A+facultative+progenitor+cell+pool.">Tracheal basal cells: A facultative progenitor cell pool.</a> American Journal of Pathology. 177 (1), 362-376 (2010).</li><li>Onwuka, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+myeloid+cell-derived+PDGF-B+in+neotissue+formation+in+a+tissue-engineered+vascular+graft.">The role of myeloid cell-derived PDGF-B in neotissue formation in a tissue-engineered vascular graft.</a> Regenerative Medicine. 12 (3), 249-261 (2017).</li><li>Grimmer, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracheal+reconstruction+using+tissue-engineered+cartilage.">Tracheal reconstruction using tissue-engineered cartilage.</a> Archives of Otolaryngology - Head and Neck Surgery. 130 (10), 1191-1196 (2004).</li><li>Wood, M. W., Murphy, S. V., Feng, X., Wright, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracheal+reconstruction+in+a+canine+model.">Tracheal reconstruction in a canine model.</a> Otolaryngology - Head and Neck Surgery (United States). 150 (3), 428-433 (2014).</li><li>Haag, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+and+angiogenic+properties+of+tissue-engineered+rat+trachea+using+genipin+cross-linked+decellularized+tissue.">Biomechanical and angiogenic properties of tissue-engineered rat trachea using genipin cross-linked decellularized tissue.</a> Biomaterials. 33 (3), 780-789 (2012).</li><li>Best, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+a+tissue-engineered+tracheal+scaffold+for+preclinical+evaluation.">Designing a tissue-engineered tracheal scaffold for preclinical evaluation.</a> International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology. 104, 155-160 (2018).</li></ol>

התפתחות מודל העכבר tracheas רקמות מהונדסים חיוני בהבנת הגורמים מוגבל תרגום קלינית TETGs; כלומר שתל לכווץ, היצרות ועיכוב epithelialization4. מספר גורמים שתורמים מגבלות אלה כוללים מבחר של שתל חומר, תהליך הייצור, העיצוב לגרדום תא זריעה פרוטוקולים. דגם זה מאפשר הערכה מהירה יותר של גורמים אלו על ?...

פגמים והכו אותי לונג-קטע יכול להציג בתור נדיר מולדות כגון טבעות בקנה הנשימה מלאה, agenesis בקנה הנשימה, כמו גם טראומה, ממאירות זיהום. כאשר העולה על 6 ס"מ מבוגרים או 30% של אורך הנשימה אצל ילדים, פגמים אלה לא יכולים להיות מטופלים על ידי שחזור כירורגי. ניסיונות כדי להחליף את דרכי הנשימה autologous רקמות, השתלות cadaveric, מבנים מלאכותיים שייסרו על ידי דלקת כרונית, פרור, כשל מכני, היצרות.
שתלי והכו אותי רקמות מהונדסים (TETGs) יכול פוטנציאלי לטפל בבעיות אלה תוך הימנעות את הצורך החיסוני חיים ארוך. בעשור האחרון, TETGs נבדקו בבעלי חיים והוכחה מנוצל קלינית במקרים נדירים של השימוש רחום-1,-2,-3. במחקרים קליניים והן גדולים בעלי חיים, התאוששות החלפת רקמות מהונדסים דרכי הנשימה לאחר הניתוח הנדרש התערבויות רבות היצרות לחימה (כהגדרתו > היצרות luminal 50%) ולשמור על דרכי הנשימה patency. עבודה נוספת TETG ביקש להפחית את היצרות דרך להעריך את התפקיד של התא זריעה הבחירה, vascularization ועיצוב לגרדום. בחירות זריעה תא ועיצוב לגרדום שמטרתו קנה הנשימה מקורי מבנה/פונקציה יש בעיקר התמקדה בתאי אפיתל נשימתי, chondrocytes נזרע על פיגומים resorbable, שאינם resorbable, decellularized שונים. כפי vascularization סביר ממלא תפקיד מרכזי בהתפתחות של היצרות, קבוצות אחרות התמקדו מיטוב במבחנה או מודלים הטרוטופי כדי לזרז revascularization או neoangiogenesis4. למרות זאת, השגת vascularization מוצלח תוך שמירה גם TETG המוסמכים ופונקציונליים מכנית נשאר אתגר. למרות ההתקדמות, מזעור היצרות נותר מכשול קריטי תרגום קליניים.
כדי לבדוק תגובה זו histopathological TETG השרשה ויוו, פיתחנו מודל ovine של החלפת רקמות מהונדסים בקנה הנשימה. השתל היה מורכב של פוליאתילן מעורבת terephthalate (PET) פוליאוריטן לגרדום electrospun (PU) עם תאי תאי מח עצם-derived (מוניטור-MNCs). במדגם קטן זה, הפגנו כי הזריעה עצמיים BM-MNCs מואצת epithelialization מחדש, מתעכבת היצרות5. למרות זריעה עם ההישרדות השתפרו BM-MNCs עצמיים, מנגנון הסלולר שבה BM-MNCs לווסת את היווצרות neotissue תפקודית נשאר לא ברור.
חקירה על פיתוח הנדרש ברמה התאית מודל מאתר של רקמות מהונדסים החלפת בקנה הנשימה. בדומה ללימוד ovine, אנחנו מנוצל לפיגום electrospun PET:PU עם מוניטור-MNCs. מסתדר עם המודל ovine, היצרות TETG שפותחה במהלך השבועיים הראשונים שלאחר ההשתלה1,2,3 ,5. זה הציע כי המודל מאתר recapitulated את הפתולוגיה שנצפה קודם לכן, ומאפשרת לנו עוד לחקור את המנגנונים התאיים המשמשים כבסיס היצרות דרכי הנשימה.
בדו ח זה, אנו מפרטים פרוטוקול שלנו עבור רקמות מהונדסים החלפת והכו אותי במודל עכבר כולל ייצור לגרדום, מוניטור-MNC בידוד, שתל זריעה השרשה (איור 1, איור 2).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:827px;" width="827">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">0.9% Sodium chloride injection</td>
			<td style="width:119px;">APP Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:119px;">NDC 63323-186-10</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">10cc serological pipet</td>
			<td style="width:119px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">357551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">18G 1.5in. Needle</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">305190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">1mL Syringe</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">24-well plate</td>
			<td style="width:119px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">25cc serological pipet</td>
			<td style="width:119px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">356535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">25G 1in. Needle</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">305125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">50cc tube</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">Alcohol prep pads</td>
			<td style="width:119px;">Fisher Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">NDC 69250-661-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">Baytril (enrofloxacin) solution</td>
			<td style="width:119px;">Bayer Healthcare, LLC</td>
			<td style="width:119px;">NDC 0859-2267-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:423px;">Black polyamide monofilament suture, 9-0</td>
			<td style="width:119px;">AROSurgical Instruments Corporation</td>
			<td style="width:119px;">T05A09N10-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">C57BL/6, female</td>
			<td style="width:119px;">Jackson laboratories</td>
			<td style="width:119px;">664</td>
			<td style="width:167px;">6-8 weeks old</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Citrate Buffer pH 6.0 20x concentrate</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Colibri retractors</td>
			<td style="width:119px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">17000-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Cotton tipped applicators</td>
			<td style="width:119px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">23-400-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Cytokeratin 14 Monoclonal Antibody</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">MA5-11599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td style="width:119px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Dumont #5/45 forceps</td>
			<td style="width:119px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Dumont #7 - Fine Forceps</td>
			<td style="width:119px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">11274-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">F4/80 Rat anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:119px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">MCA497R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Ficoll</td>
			<td style="width:119px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">10831-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Fine scissors- Sharp-blunt</td>
			<td style="width:119px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">14028-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Fisherbrand Premium Cover Glasses</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">12-548-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Fluoroshield Mounting Media with DAPI</td>
			<td style="width:119px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab104139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Goat-anti mouse IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Goat-anti Rabbit IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">A-11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Goat-anti Rat IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 647</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">A-21247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">Ibuprofen</td>
			<td style="width:119px;">Precision Dose, Inc</td>
			<td style="width:119px;">NDC 68094-494-59</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:423px;">Iodine prep pads</td>
			<td style="width:119px;">Professional disposables international, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">NDC 10819-3883-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Keratin 5 Polyclonal Antibody, Purified</td>
			<td style="width:119px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">905501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Ketamine hydrochloride injection</td>
			<td style="width:119px;">Hospira Inc.</td>
			<td style="width:119px;">NDC 0409-2053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Micro-Adson forceps</td>
			<td style="width:119px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">11018-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Microscope</td>
			<td style="width:119px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">M80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Non-woven sponges</td>
			<td style="width:119px;">Covidien</td>
			<td style="width:119px;">441401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:423px;">Opthalmic ointment</td>
			<td style="width:119px;">Dechra Veterinary products</td>
			<td style="width:119px;">NDC 17033-211-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">PBS</td>
			<td style="width:119px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">PET/PU (Polyethylene terephthalate &#38; Polyurethane) scaffolds</td>
			<td style="width:119px;">Nanofiber solutions</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom ordered</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Petri dish</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">RPMI 1640 Medium</td>
			<td style="width:119px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">TISH Needle Holder/Forceps</td>
			<td style="width:119px;">Micrins</td>
			<td style="width:119px;">MI1540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Trimmer</td>
			<td style="width:119px;">Wahl</td>
			<td style="width:119px;">9854-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vannas-T&#252;bingen Spring Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15008-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Warm water recirculator</td>
			<td style="width:119px;">Gaymar</td>
			<td style="width:119px;">TP-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">Xylazine sterile solution</td>
			<td style="width:119px;">Akorn animal health</td>
			<td style="width:119px;">NDC 59399-110-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

seeding and implantation of a biosynthetic tissue-engineered tracheal graft in a mouse model

אפשרויות הטיפול פגמים מולדים או משנית קטע ארוך והכו אותי מבחינה היסטורית היה מוגבל בשל חוסר היכולת להחליף רקמה תפקודית. הנדסת רקמות טומן בחובו הבטחה גדולה כמו פתרון אפשרי עם היכולת שלה לשלב של תאים, מולקולות איתות, לפיגום תלת-ממדי. עבודה עם שתלי והכו אותי רקמות מהונדסים (TETGs) ראה הצלחה מסוימת אך התרגום שלהם היה מוגבל על ידי היצרות שתל, להשתיל התמוטטות, עיכוב epithelialization. על מנת לחקור את מנגנוני נהיגה בנושאים אלה, פיתחנו מודל העכבר להשתלה רקמות מהונדסים שתל בקנה הנשימה. TETGs נבנו תוך שימוש electrospun פולימרים פוליאתילן terephthalate (PET), פוליאוריטן (פו) בתערובת של חיית המחמד, פו (20:80 אחוז משקל). פיגומים היו אז נזרע באמצעות תאי תאי מח עצם מבודד בשבוע 6-8-עכברים C57BL/6 הישן על ידי צנטריפוגה הדרגתיות. עשרה מיליון תאים לכל שתל נזרע לתוך לומן של לגרדום, רשאית דגירה בין לילה לפני ההשתלה בין הטבעות השלישי, שביעית בקנה הנשימה. שתלים אלה הצליחו לסכם את הממצאים של היצרות ועיכוב epithelialization כפי שמתואר על ידי ניתוח היסטולוגית וחוסר קרטין 5 ו-14 קרטין תאים אפיתל הבזליים על immunofluorescence. מודל זה ישמש ככלי לחקור מנגנונים תאית ומולקולרית מעורב מארח שיפוץ.

איור 1 מדגימה סכימטי של TETG זריעה, השרשה. מח העצם היה שנקטפו עכברים C57BL/6 ותרבותית במבחנה. BM-MNCs היו מבודדים על ידי צנטריפוגה צפיפות, נזרע על גבי TETG. TETGs הזריעה היו מושתלים לתוך עכבר הנמען syngeneic C57BL/6.
איור 2 הו...

Watch this Scientific Journal Video about Seeding and Implantation of a Biosynthetic Tissue-engineered Tracheal Graft in a Mouse Model at JoVE.com

Seeding and Implantation of a Biosynthetic Tissue-engineered Tracheal Graft in a Mouse Model

היצרות השתל מהווה מכשול קריטי החלפת רקמות מהונדסים דרכי הנשימה. כדי לחקור את המנגנונים התאיים המשמשים כבסיס היצרות, אנו מנצלים את מודל מאתר של החלפת רקמות מהונדסים והכו אותי עם תאי תאי מח עצם הזריעה (מוניטור-MNC). כאן, אנו מפרטים פרוטוקול שלנו, כולל ייצור לגרדום, מוניטור-MNC בידוד, שתל זריעה השרשה.

Seeding, השרשת biosynthetic הוחלף נגזר רקמות מהונדסים בקנה הנשימה השתלה במודל של עכברים

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional ...

יישומים קליניים של קנה הנשימה מהונדס רקמות הוגבלו עקב התעצמות השתל אפיתליזציה מאוחרת. מודל עכבר של החלפת קנה דרך אורתוטופית מאפשר את חקר המנגנונים התאיים המניעים התחדשות. פגמים ארוכים של דרכי הנשימה יכולים לעלות על מה הטיפולים הנוכחיים מסוגלים לרפא.קנה הנשימה מהונדס רקמות מציע את הפוטנציאל ליצור איבר חלופי עבור תנאים אלה. מודל זה יכול להיות מיושם על בעלי חיים עם תכונות מעקב מהומן שושלת. לאחר מכן אנו יכולים לווסת את הגורמים המארחים התורמים להתחדשות השתלים.אחד האתגרים המרכזיים בהפקת הפיגומים יהיה מדידה וקביעה כי הפרמטרים electrospinning זהים בכל פעם. אז בכל פעם שאתה מייצר פיגום, אתה צריך למדוד את המרחק קצה לאספן, הלחות, ואת הטמפרטורה כדי להבטיח את הפיגומים זהים בכל פעם. קריטי להצלחת מודל זה הוא עידון של טכניקות מיקרוכירורגיות ותחזוקה של המישור הנכון של הרדמה כדי לאפשר אוורור ספונטני לאורך כל ההליך.מאז קנה הנשימה המארח יש קוטר פנימי של סביב מילימטר אחד, השתל טיפול ברקמות ילידים מיקום תפר חשובים והוכח בצורה הטובה ביותר חזותית. התחל על ידי המסת שמונה אחוזי משקל פוליאתילן טרפתאלאט, או PET, ב hexafluoroisopropanol וחימום הפתרון וכתוצאה מכך 60 מעלות צלזיוס. בעוד הפתרון הוא להיות מחומם, להמיס שלושה משקל אחוז פוליאוריטן, או PU, ב hexafluoroisopropanol, שילוב הפתרונות לאחר פתרון PET התקרר.לטעון מזרק 60 מיליליטר מצויד מחט 20-קצה קהה עם תערובת פולימר. השתמש במזרק ובספק כוח DC במתח גבוה מוגדרים ל-14 קילו-וולטים חיוביים על המחט, עוד ספק כוח DC במתח גבוה שנקבע למינוס שלושה קילו-וולט, קצב זרימה של חמישה מיליליטר לשעה ומרחק של 20 ס"מ מטיפ למצע כדי להפוך את הפולימר לאלקטרוספין למוט נירוסטה בקוטר של מילימטר אחד. המשך electrospinning עד עובי קיר פיגום 300 מיקרומטר מושגת.לאחר מכן, להחליק את הפיגום מהמוט, למקם את הפיגום תחת ואקום לילה כדי להסיר כל ממס שיורית, ולעקר את הפיגום עם מינון אור אולטרה סגול של 350 millijoules לסנטימטר בריבוע במשך כ 15 דקות. בתנאים סטריליים, הסר את העור מהגפיים האחוריות של עכבר בן שישה עד שמונה שבועות, נקבה, C57-Black/6 עם מספריים עדין ומלקחיים מיקרו-אדסון, ולהשתמש מלקחיים מספר דומונט מספר חמש ודומונט מספר 5/45 מלקחיים כדי להסיר את fascia ואת הגידים. להפריד את העצמות כדי לאפשר לכל אחד מהם להיחתך בשני הקצוות, ולהשתמש מזרק חמישה מיליליטר מצויד מחט 25-מד כדי לשטוף את מח העצם לתוך צלחת פטרי המכיל 30 מיליליטר של מדיום RPMI.כאשר כל העצמות כבר סמוקות, לסנן את מח העצם דרך מסננת תא ניילון 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר, ולהעביר את הצינור לארון biosafety. מוסיפים בעדינות את תסנובת התא המונונוקלארי המסוננת לאורך הצד של צינור 15 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר של פוליזוקרוז ונתרן diatrizoate מבלי לערבב את השכבות, ולהפריד את הפלזמה מתאי הדם הלבנים והאדום על ידי הפרדת שיפוע צפיפות. בסוף הצנטריפוגה, לאסוף את השכבה האמצעית ברור המורכבת תאים mononuclear מח העצם, ולשטוף את תאי מונונוקלאר מח העצם ביחס של אחד לאחד PBS על ידי צנטריפוגה.תן את גלולה בחמישה מיליליטר של PBS לשטוף השני, ואחריו התפלה ב 10 מיליליטר של מדיום RPMI טרי לספירה. לאחר מכן, לאסוף את התאים עם צנטריפוגה נוספת, ולדלל את התאים לאחת פעמים 10 לשבעה תאים לכל חמישה microliters של ריכוז RPMI טרי. לפני זריעת הפיגום, חותכים את הפולימר לאורך של חמישה מילימטר לפי הצורך, ומרטיבים את הפיגום עם חמישה מיקרוליטרים של מדיום RPMI למשך חמש דקות.בסוף הדגירה, להסיר את המדיום עודף, ולדעון את לומן פיגום עם חמישה microliters של פתרון התא מונונוקלארי מח העצם במשך 10 דקות. לאחר מכן, להכניס מחט 21-מד דרך לומן של הפיגום, ולהכניס את השתל במיליליטר אחד של מדיום RPMI לילה באינקובטור 37 מעלות צלזיוס. לאחר אינדוקציה של הרדמה כללית, לאשר חוסר תגובה קמצוץ בוהן בבעל החיים המטופל, ולהחיל משחה על העיניים של החיה.גזור את השיער באתר הניתוח מסנטר לעצם הבריח, והצב את החיה על כרית כירורגית בתווית שקע הגבית. באמצעות טכניקה אספטית, לחטא את האתר הכירורגי עם povidone-יוד רציף, 70%אתנול, povidone-יוד לנגב סדרה, ולהזיז את העכבר תחת מיקרוסקופ ניתוח עם הראש בשעה 12. השתמש במספריים עדינים ומלקחיים מיקרו-אדסון כדי לבצע חתך קו האמצע מן עצם הבריח לעצם הלשון, ולהשתמש Dumont מספר חמש ומספר שבע מלקחיים עדינים ספוגית כותנה סטרילית כדי לנקות את fascia לפני החדרת נסיגה קוליברי שמירה עצמית לתוך החתך.השתמש במקלות כדי לפתוח את שרירי הרצועה כדי לחשוף את הסחוס בבלוטת התריס, סחוס cricoid, קנה הנשימה, ולהפריד בבוטות את קנה הנשימה מן עצבי הגרון החוזרים ונשנים פועל במקביל משני צדי הרקמה, ואחריו הפרדה היקפית של קנה הנשימה מן הוושט. באמצעות מחט 20-מד וסמן כירורגי, להכתים את החלק הראשון של קנה הנשימה. בצע חתך מתחת לטבעת הסחוס הטרצ'לית השלישית באמצעות זוג מספריים של קפיץ ואנה-טובינגן וזוג מטחנים עדין של דומונט מספר שבע כדי לכרות קטע של שלוש טבעות של קנה הנשימה.מחזיקים את קנה הנשימה עם ממטרים מעוגלים עדין, להשתמש בתפר ניילון סטרילי 9-0 כדי לאבטח את הקצה הדיסטלי של קנה הנשימה אל עצם החזה כדי ליצור tracheostomy זמני, ולהשתמש מחט 20 מד סמן כירורגי כדי להכתים את החלק הראשון של השתל. כדי להשתיל את השתל, השתמש בתפר ניילון סטרילי 9-0, דומונט מספר שבע מלקחיים עדין, ומחזיק מחט כדי להכניס את התפרים הפרוקסימליים-אחוריים, הפרוקסימליים-צדדיים והפרוקסימליים-לפנים, ולהפוך את החיה ל-180 מעלות. כאשר העכבר נמצא בעמדה, לשחרר את קנה הנשימה הזמני, ולעשות חתך בצד השני חמישה מילימטרים מן החלק הראשון של השתל כדי להקל על anastomosis דיסטלי.כדי להשלים את anastomosis דיסטלי, מניחים את התפרים באופן דומה לאנסטומוזיס הפרוקסימלי, ולמקר מחדש את תנוחת השתל ואת שרירי הרצועה. לאחר מכן, לסגור את החתך עם 9-0 תפרים ניילון סטרילי בתבנית ריצה, ולניח את החיה לבד בכלוב התאוששות להציב על כרית חימום עם ניטור עד החלמה מלאה. שבועיים לאחר ההשתלה, כמה תאי אפיתל בסיס ניתן לראות על ידי קרטין התא הבסיסי חמש ו 14 כתמים בסעיפים רקמה מהונדסים רקמה השתלת קנה דרך.תאים בזליים מזוהים גם על פני השטח הזוהרים של השתל בשבעה ימים לאחר ההשתלה. עם ההשתלה והניתוח ההיסטולוגי, זוהתה ההטמנה של השתל כגורם התורם העיקרי בעכברים מושתלים המודגמים סימנים של מצוקה נשימתית וחנק. שים לב כי טלסקופ של השתל קנה הנשימה המקומי הוא ממצא נפוץ כתוצאה של הטכניקה הכירורגית.כתמים עבור F4/80 חושף מקרופאגים מארחים בתוך האזור הסטנוטי של השתל בשילוב עם נוכחותם של תאי האפיתל הבסיסיים. הימנע מניפולציה של עצבי הגרון החוזרים ונשנים, ולהבטיח כי התפרים הפרוקסימליים והדיסטליים נמצאים במקום כדי לאפשר חותם אטום על anastomosis. כמו פרוטוקול זה עוסק בתאים mononuclear מח עצם נגזר עכברים סוכן ברמה biosafety אחד, חשוב ללבוש ציוד מגן אישי המתאים, כדי למנוע זיהום.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

יצירת דו מימדי מצעים Patterned עבור החזקת חלבון ו-Cell

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Autologous Endothelial Progenitor Cell-Seeding Technology and Biocompatibility Testing For Cardiovascular Devices in Large Animal Model

עצמיים אבי האנדותל Cell-מתזמן טכנולוגיה בדיקה biocompatibility עבור התקנים לב וכלי דם במודל חיה גדולה

Implantable cardiovascular devices are manufactured from artificial materials (e.g. titanium (Ti), expanded polytetrafluoroethylene), which pose the risk ...

Protocol for Relative Hydrodynamic Assessment of Tri-leaflet Polymer Valves

פרוטוקול להערכה הידרודינמית יחסית של הפולימר שסתום Tri-עלון

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of ...

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

טכניקה כירורגית להשתלה של רקמות שתלי כלי דם מהונדסים ולאחר<em&gt; In vivo</em&gt; ניטור

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large ...

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

דור והארכת כלי רקמות מהונדסות במודל עכבר

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

ייצור, אפיון ופוטנציאל שימושים של הוושט רירי דגם אדם מהונדס-רקמות 3D

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

רקמת 3D משולב תכנון הנדסי<em&gt; במבחנה</em&gt; /<em&gt; סיליקו</em&gt; דגם גידול ריאות לניבוי יעילות טיפול תרופתי רקעים מוטציוני ספציפיים

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

יישומים של<em&gt; In vivo</em&gt; בדיקות פונקציונליות של עכברוש השוקה הקדמי להערכת רקמות מהונדסות תיקון שרירי שלד

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

תלת מימדי רקמות מהונדסים מיושר אסטרוציט רשתות כדי לסכם מנגנונים התפתחותית וכדי להקל על מערכת העצבים התחדשות

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

ייצור של בארות Agarose מותאם אישית עבור תא זריעה וטבעת רקמות הרכבה עצמית תוך שימוש בתבניות מודפס 3D

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...