Name: seeding and implantation of a biosynthetic tissue-engineered tracheal graft in a mouse model
Uploaded: 2019-04-01T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Seeding and Implantation of a Biosynthetic Tissue-engineered Tracheal Graft in a Mouse Model at JoVE.com

हम रॉबर्ट Strouse और अनुसंधान सूचना समाधान & राष्ट्रव्यापी बच्चों के अस्पताल में नवाचार प्रभाग ग्राफिक डिजाइन में उनके समर्थन के लिए स्वीकार करना चाहते हैं । यह काम एनआईएच (NHLBI K08HL138460) से अनुदान द्वारा समर्थित था ।

यहां वर्णित सभी विधियों को संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा राष्ट्रव्यापी बच्चों के अस्पताल में अनुमोदित किया गया है ।
1. पाड़ विनिर्माण
<ol><li>द्वारा एक बहुलक नैनोफाइबर अग्रदूत स?...

<ol>
	<li>Macchiarini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+transplantation+of+a+tissue-engineered+airway.">Clinical transplantation of a tissue-engineered airway.</a> The Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).</li><li>Jungebluth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracheobronchial+transplantation+with+a+stem-cell-seeded+bioartificial+nanocomposite:+A+proof-of-concept+study.">Tracheobronchial transplantation with a stem-cell-seeded bioartificial nanocomposite: A proof-of-concept study.</a> The Lancet. 378 (9808), 1997-2004 (2011).</li><li>Elliott, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-cell-based,+tissue+engineered+tracheal+replacement+in+a+child:+A+2-year+follow-up+study.">Stem-cell-based, tissue engineered tracheal replacement in a child: A 2-year follow-up study.</a> The Lancet. 380 (9846), 994-1000 (2012).</li><li>Chiang, T., Pepper, V., Best, C., Onwuka, E., Breuer, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Translation+of+Tissue+Engineered+Trachea+Grafts.">Clinical Translation of Tissue Engineered Trachea Grafts.</a> Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 125 (11), 873-885 (2016).</li><li>Clark, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cell+seeding+on+neotissue+formation+in+a+tissue+engineered+trachea.">Effect of cell seeding on neotissue formation in a tissue engineered trachea.</a> Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 49-55 (2016).</li><li>Cole, B. B., Smith, R. W., Jenkins, K. M., Graham, B. B., Reynolds, P. R., Reynolds, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracheal+basal+cells:+A+facultative+progenitor+cell+pool.">Tracheal basal cells: A facultative progenitor cell pool.</a> American Journal of Pathology. 177 (1), 362-376 (2010).</li><li>Onwuka, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+myeloid+cell-derived+PDGF-B+in+neotissue+formation+in+a+tissue-engineered+vascular+graft.">The role of myeloid cell-derived PDGF-B in neotissue formation in a tissue-engineered vascular graft.</a> Regenerative Medicine. 12 (3), 249-261 (2017).</li><li>Grimmer, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracheal+reconstruction+using+tissue-engineered+cartilage.">Tracheal reconstruction using tissue-engineered cartilage.</a> Archives of Otolaryngology - Head and Neck Surgery. 130 (10), 1191-1196 (2004).</li><li>Wood, M. W., Murphy, S. V., Feng, X., Wright, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracheal+reconstruction+in+a+canine+model.">Tracheal reconstruction in a canine model.</a> Otolaryngology - Head and Neck Surgery (United States). 150 (3), 428-433 (2014).</li><li>Haag, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+and+angiogenic+properties+of+tissue-engineered+rat+trachea+using+genipin+cross-linked+decellularized+tissue.">Biomechanical and angiogenic properties of tissue-engineered rat trachea using genipin cross-linked decellularized tissue.</a> Biomaterials. 33 (3), 780-789 (2012).</li><li>Best, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+a+tissue-engineered+tracheal+scaffold+for+preclinical+evaluation.">Designing a tissue-engineered tracheal scaffold for preclinical evaluation.</a> International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology. 104, 155-160 (2018).</li></ol>

ऊतक इंजीनियर tracheas के लिए एक माउस मॉडल का विकास TETGs के नैदानिक अनुवाद सीमित है कारकों को समझने में आवश्यक है; अर्थात भ्रष्टाचार पतन, स्टेनोसिस और विलंबित उपकला4. कुछ कारकों है कि इन सीमाओं के लिए यो?...

दीर्घ-खंड श्वाशलता दोष के रूप में दुर्लभ जन्मजात स्थितियों जैसे कि पूरी तरह से श्वाशलता के छल्ले और श्वासंतक आगेनेसिस, साथ ही आघात, द्रोह, और संक्रमण के रूप में पेश कर सकते हैं । जब वयस्कों में 6 सेमी या बच्चों में श्वासक लंबाई के 30% से अधिक है, इन दोषों सर्जिकल पुनर्निर्माण द्वारा इलाज नहीं किया जा सकता है । ऑटोलॉजिकल ऊतक, कैडेवेरिक प्रत्यारोपण, और कृत्रिम निर्माणों के साथ एयरवे को बदलने के प्रयास पुराने संक्रमण, कणिकायन, यांत्रिक विफलता, और स्टेनोसिस से ग्रस्त हो गए हैं ।
ऊतक इंजीनियर श्वासोत्तक grafts (TETGs) संभावित जीवन लंबे immunosuppression के लिए की जरूरत से परहेज करते हुए इन समस्याओं का पता कर सकते हैं. पिछले दशक में, tetgs पशु मॉडल में परीक्षण किया गया है और अनुकंपा के प्रयोग के दुर्लभ उदाहरणों में चिकित्सकीय उपयोग1,2,3। दोनों नैदानिक और बड़े पशुओं के अध्ययन में, ऊतक इंजीनियर airway प्रतिस्थापन से बाद ऑपरेटिव वसूली स्टेनोसिस से निपटने के लिए कई हस्तक्षेपों की आवश्यकता (> 50% luminal संकुचन के रूप में परिभाषित) और एयरवे पैटेंसी बनाए रखने के । अतिरिक्त tetg काम सेल बोने की पसंद, vascularization और पाड़ डिजाइन की भूमिका का मूल्यांकन के माध्यम से इस स्टेनोसिस को कम करने की मांग की है । सेल बोने के विकल्प और पाड़ डिजाइन देशी श्वासनली संरचना बहाल करने के उद्देश्य से/समारोह मुख्य रूप से श्वसन उपकला कोशिकाओं और विभिंन रिसोलुबल, गैर रिसोल्ड और decellularized मचानों पर बोये chondrocytes पर ध्यान केंद्रित किया गया है । के रूप में vascularization संभावना stenosis के विकास में एक प्रमुख भूमिका निभाता है, अंय समूहों विट्रो या विषमस्थानिक मॉडल में अनुकूलन पर ध्यान केंद्रित किया है revascularization या neoangiogenesis4में तेजी लाने के लिए । बहरहाल, सफल vascularization हासिल करते हुए भी एक यंत्रवत् सक्षम और कार्यात्मक TETG बनाए रखने के एक चुनौती बनी हुई है । हाल ही में अग्रिम के बावजूद, कम करने का रोग नैदानिक अनुवाद करने के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा बनी हुई है ।
Vivo मेंtetg आरोपण करने के लिए इस histopathological प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए, हम ऊतक के एक ovine मॉडल इंजीनियर वातक प्रतिस्थापन विकसित की है । भ्रष्टाचार मिश्रित पॉलीथीन टेरेफ्थैलेट (पीईटी) और पॉलीयूरिथेन (पु) इलेक्ट्रोस्पन पाड़ से अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मोनोन्यूक्लियर सेल (बीएम-एमएनसी) से बना था । इस छोटे से सहगण में हमने यह दर्शाया है कि वरीयता प्राप्त ऑटोलॉजिस्ट बी एम एम-बहुराष्ट्रीय कंपनियों ने पुनः उपकला और विलंबित स्टेनोसिसमें तेजी लाई । हालांकि ऑटोलॉजिस्ट BM-MNCs के साथ सीडिंग अस्तित्व में सुधार, सेलुलर तंत्र जिसके द्वारा BM-MNCs कार्यात्मक neotissue के गठन को मिलाना अस्पष्ट बनी हुई है ।
सेलुलर स्तर पर जांच ऊतक इंजीनियर वातक प्रतिस्थापन के एक म्यूरिन मॉडल के विकास की आवश्यकता है । Ovine अध्ययन के लिए इसी प्रकार, हम एक पालतू पशु का उपयोग: पु electrospun पाड़ BM-mncs के साथ वरीयता प्राप्त ovine मॉडल के साथ संगत, tetg स्टेनोसिस पहले दो सप्ताह के दौरान आरोपण के बाद विकसित1,2,3 ,5. यह सुझाव दिया है कि म्यूरिन मॉडल पहले देखा विकृति को पुनः पूंजीकरण, हमें सक्षम करने के लिए आगे सेलुलर airway स्टेनोसिस अंतर्निहित तंत्र पूछताछ ।
इस रिपोर्ट में, हम विस्तार पाड़ विनिर्माण, बीएम-mnc अलगाव, भ्रष्टाचार बोने, और आरोपण (चित्रा 1, चित्रा 2) सहित माउस मॉडल में ऊतक इंजीनियर वातक प्रतिस्थापन के लिए हमारे प्रोटोकॉल ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:827px;" width="827">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">0.9% Sodium chloride injection</td>
			<td style="width:119px;">APP Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:119px;">NDC 63323-186-10</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">10cc serological pipet</td>
			<td style="width:119px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">357551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">18G 1.5in. Needle</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">305190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">1mL Syringe</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">24-well plate</td>
			<td style="width:119px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">25cc serological pipet</td>
			<td style="width:119px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">356535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">25G 1in. Needle</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">305125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">50cc tube</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">Alcohol prep pads</td>
			<td style="width:119px;">Fisher Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">NDC 69250-661-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">Baytril (enrofloxacin) solution</td>
			<td style="width:119px;">Bayer Healthcare, LLC</td>
			<td style="width:119px;">NDC 0859-2267-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:423px;">Black polyamide monofilament suture, 9-0</td>
			<td style="width:119px;">AROSurgical Instruments Corporation</td>
			<td style="width:119px;">T05A09N10-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">C57BL/6, female</td>
			<td style="width:119px;">Jackson laboratories</td>
			<td style="width:119px;">664</td>
			<td style="width:167px;">6-8 weeks old</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Citrate Buffer pH 6.0 20x concentrate</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Colibri retractors</td>
			<td style="width:119px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">17000-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Cotton tipped applicators</td>
			<td style="width:119px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">23-400-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Cytokeratin 14 Monoclonal Antibody</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">MA5-11599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td style="width:119px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Dumont #5/45 forceps</td>
			<td style="width:119px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Dumont #7 - Fine Forceps</td>
			<td style="width:119px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">11274-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">F4/80 Rat anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:119px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">MCA497R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Ficoll</td>
			<td style="width:119px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">10831-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Fine scissors- Sharp-blunt</td>
			<td style="width:119px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">14028-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Fisherbrand Premium Cover Glasses</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">12-548-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Fluoroshield Mounting Media with DAPI</td>
			<td style="width:119px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab104139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Goat-anti mouse IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Goat-anti Rabbit IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">A-11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Goat-anti Rat IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 647</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">A-21247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">Ibuprofen</td>
			<td style="width:119px;">Precision Dose, Inc</td>
			<td style="width:119px;">NDC 68094-494-59</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:423px;">Iodine prep pads</td>
			<td style="width:119px;">Professional disposables international, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">NDC 10819-3883-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Keratin 5 Polyclonal Antibody, Purified</td>
			<td style="width:119px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">905501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Ketamine hydrochloride injection</td>
			<td style="width:119px;">Hospira Inc.</td>
			<td style="width:119px;">NDC 0409-2053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Micro-Adson forceps</td>
			<td style="width:119px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">11018-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Microscope</td>
			<td style="width:119px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">M80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Non-woven sponges</td>
			<td style="width:119px;">Covidien</td>
			<td style="width:119px;">441401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:423px;">Opthalmic ointment</td>
			<td style="width:119px;">Dechra Veterinary products</td>
			<td style="width:119px;">NDC 17033-211-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">PBS</td>
			<td style="width:119px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">PET/PU (Polyethylene terephthalate &#38; Polyurethane) scaffolds</td>
			<td style="width:119px;">Nanofiber solutions</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom ordered</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Petri dish</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">RPMI 1640 Medium</td>
			<td style="width:119px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">TISH Needle Holder/Forceps</td>
			<td style="width:119px;">Micrins</td>
			<td style="width:119px;">MI1540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Trimmer</td>
			<td style="width:119px;">Wahl</td>
			<td style="width:119px;">9854-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vannas-T&#252;bingen Spring Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15008-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Warm water recirculator</td>
			<td style="width:119px;">Gaymar</td>
			<td style="width:119px;">TP-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">Xylazine sterile solution</td>
			<td style="width:119px;">Akorn animal health</td>
			<td style="width:119px;">NDC 59399-110-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

seeding and implantation of a biosynthetic tissue-engineered tracheal graft in a mouse model

जन्मजात या माध्यमिक लंबे खंड वातक दोषों के लिए उपचार के विकल्प ऐतिहासिक रूप से कार्यात्मक ऊतक की जगह असमर्थता के कारण सीमित किया गया है । ऊतक इंजीनियरिंग एक 3 आयामी पाड़ में कोशिकाओं और संकेत अणुओं को एकीकृत करने की क्षमता के साथ एक संभावित समाधान के रूप में महान वादा रखती है । ऊतक के साथ हाल ही में काम कर रहे है वातक grafts इंजीनियर (tetgs) कुछ सफलता देखा है, लेकिन उनके अनुवाद grafts stenosis, भ्रष्टाचार पतन, और देरी उपकला द्वारा सीमित किया गया है । आदेश में इन मुद्दों ड्राइविंग तंत्र की जांच करने के लिए, हम ऊतक के लिए एक माउस मॉडल विकसित किया है वातक भ्रष्टाचार आरोपण इंजीनियर । TETGs का निर्माण किया गया था electrospun पॉलिमर पॉलीथीन terephthalate (पीईटी) और polyurethane (पु) के एक मिश्रण में पीईटी और पु (20:80 प्रतिशत वजन) । मचानों तो अस्थि मज्जा मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं का उपयोग 6-8 सप्ताह पुराने C57BL से अलग किया गया-ढाल केंद्रापसारक द्वारा चूहों भ्रष्टाचार प्रति १०,०००,००० कोशिकाओं पाड़ के लुमेन पर बोये गए और तीसरे और सातवें वातक छल्ले के बीच आरोपण से पहले रातोंरात सेने की अनुमति दी । इन grafts एक प्रकार का रोग और विलंबित उपकला के निष्कर्षों के रूप में ऊतकीय विश्लेषण और केरातिन 5 और केरातिन 14 बेसल उपकला कोशिकाओं immunofluorescence पर की कमी के द्वारा प्रदर्शित करने में सक्षम थे । यह मॉडल सेलुलर और आणविक मेजबान remodeling में शामिल तंत्र की जांच के लिए एक उपकरण के रूप में काम करेंगे ।

चित्रा 1 tetg बोने और आरोपण के एक योजनाबद्ध दिखाता है । अस्थि मज्जा C57BL/6 चूहों और विट्रो मेंसुसंस्कृत से काटा गया था । BM-बहुराष्ट्रीय कंपनियां घनत्व अपकेंद्रण द्वारा अलग-थलग थीं ?...

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Seeding and Implantation of a Biosynthetic Tissue-engineered Tracheal Graft in a Mouse Model

Graft एक प्रकार का रोग ऊतक में एक महत्वपूर्ण बाधा बन गया है एयरवे रिप्लेसमेंट इंजीनियर । एक प्रकार का रोग अंतर्निहित सेलुलर तंत्र की जांच करने के लिए, हम बोये अस्थि मज्जा मोनोन्यूक्लियर सेल (बीएम-MNC) के साथ ऊतक इंजीनियर ट्रेकल रिप्लेसमेंट के एक म्यूरिन मॉडल का उपयोग । यहां, हम विस्तार पाड़ विनिर्माण, बीएम-mnc अलगाव, भ्रष्टाचार बोने, और आरोपण सहित हमारे प्रोटोकॉल, ।

एक माउस मॉडल में एक जैव सिंथेटिक ऊतक इंजीनियर Tracheal भ्रष्टाचार के बोने और आरोपण

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional ...

ऊतक-इंजीनियर श्वासनली के नैदानिक अनुप्रयोगों को भ्रष्टाचार स्टेनोसिस और विलंबित एपिथेलिलाइजेशन के कारण सीमित किया गया है। ऑर्थोटोपिक श्वासनली प्रतिस्थापन का एक माउस मॉडल सेलुलर तंत्र के अध्ययन को पुनर्जनन ड्राइविंग की अनुमति देता है। वायुमार्ग के लंबे खंड दोष क्या वर्तमान चिकित्सा का इलाज करने में सक्षम है पार कर सकते हैं ।ऊतक इंजीनियर श्वासनली इन स्थितियों के लिए एक प्रतिस्थापन अंग बनाने की क्षमता प्रदान करता है । इस मॉडल को ट्रांसजेनिक और वंश ट्रेसिंग गुणों वाले जानवरों पर लागू किया जा सकता है। इसके बाद हम भ्रष्टाचार उत्थान में योगदान देने वाले मेजबान कारकों को मिलाना कर सकते हैं ।मचान के उत्पादन में प्रमुख चुनौतियों में से एक को मापने और निर्धारित किया जाएगा कि इलेक्ट्रोस्पिनिंग पैरामीटर हर बार एक ही हैं । तो हर बार जब आप एक पाड़ का उत्पादन, आप टिप को मापने की जरूरत है-कलेक्टर दूरी, आर्द्रता, और तापमान को सुनिश्चित करने के लिए मचान हर बार एक ही हैं । इस मॉडल की सफलता के लिए महत्वपूर्ण प्रक्रिया के दौरान सहज वेंटिलेशन की अनुमति देने के लिए संज्ञाहरण के सही विमान के माइक्रोसर्जिकल तकनीकों और रखरखाव का शोधन है।चूंकि मेजबान श्वासनली में लगभग एक मिलीमीटर का आंतरिक व्यास होता है, इसलिए भ्रष्टाचार और देशी ऊतक हैंडलिंग और सीवन प्लेसमेंट महत्वपूर्ण और सबसे अच्छा नेत्रहीन प्रदर्शन करते हैं। हेक्साफ्लोरोइसोप्रोपेनोल में आठ वजन प्रतिशत पॉलीथीन टेरेफ्थेलेट, या पीईटी को भंग करके और परिणामस्वरूप समाधान को 60 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करके शुरू करें। जबकि समाधान गर्म किया जा रहा है, तीन वजन प्रतिशत पॉलीयूरेथेन, या पीयू, हेक्साफ्लोरोइसोप्रोपेनॉल में भंग, समाधान के संयोजन एक बार पीईटी समाधान ठंडा हो गया है ।बहुलक मिश्रण के साथ 20 गेज कुंद-टिप सुई से लैस 60-मिलीलीटर सिरिंज लोड करें। सिरिंज और एक उच्च वोल्टेज डीसी बिजली की आपूर्ति का उपयोग करें सुई पर सकारात्मक 14 किलोवोल्ट के लिए सेट, एक और उच्च वोल्टेज डीसी बिजली की आपूर्ति शूंय से तीन किलोवोल्ट, एक पांच मिलीलीटर प्रति घंटे प्रवाह दर, और एक 20 सेंटीमीटर टिप करने के लिए सब्सट्रेट दूरी एक मिलीमीटर व्यास स्टेनलेस स्टील रॉड पर बहुलक इलेक्ट्रोस्पिन करने के लिए सेट प्रति मिनट ३५० घूर्णन पर बदल दिया जा रहा है । इलेक्ट्रोस्पिनिंग जारी रखें जब तक कि 300-माइक्रोमीटर पाड़ की दीवार की मोटाई प्राप्त न हो जाए।फिर, छड़ी से पाड़ स्लाइड, किसी भी अवशिष्ट विलायक को दूर करने के लिए रात भर वैक्यूम के तहत पाड़ जगह है, और के बारे में 15 मिनट के लिए चुकता सेंटीमीटर प्रति ३५० मिलीजोल की एक पराबैंगनी प्रकाश खुराक के साथ पाड़ निष्फल । बाँझ परिस्थितियों में, एक छह से आठ सप्ताह पुराने, महिला, C57-काले/6 माउस के पिछले अंगों से ठीक कैंची और माइक्रो-एसन संदंश के साथ त्वचा को हटा दें, और प्रावरणी और टेंडन को हटाने के लिए ड्यूमोंट नंबर पांच संदंश और ड्यूमोंट नंबर 5/45 संदंश का उपयोग करें । हड्डियों को अलग करने के लिए उनमें से प्रत्येक दोनों सिरों पर कटौती की अनुमति है, और एक पांच मिलीलीटर सिरिंज एक 25 गेज सुई से सुसज्जित करने के लिए एक पेट्री एक पेट्री पकवान में बोन मैरो फ्लश का उपयोग करें RPMI माध्यम के 30 मिलीलीटर युक्त ।जब हड्डियों के सभी निकाल दिया गया है, एक ७० माइक्रोमीटर नायलॉन सेल छलनी के माध्यम से एक ५० मिलीलीटर शंकु नली में अस्थि मज्जा फिल्टर, और एक जैवसेफ्टी कैबिनेट के लिए ट्यूब हस्तांतरण । धीरे-धीरे एक 15 मिलीलीटर ट्यूब के किनारे नीचे फ़िल्टर मोनोन्यूक्लियर सेल समाधान जोड़ें जिसमें परतों को मिलाए बिना पॉलीसुक्रोस और सोडियम डायट्रिज़ोएट के पांच मिलीलीटर होते हैं, और घनत्व ढाल पृथक्करण द्वारा प्लाज्मा को सफेद और लाल रक्त कोशिकाओं से अलग करते हैं। अपकेंद्रित्र के अंत में, बोन मैरो मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं से मिलकर मध्य स्पष्ट परत एकत्र करें, और अपकेंद्रित्र द्वारा पीबीएस में एक-से-एक अनुपात में बोन मैरो मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को धोएं।एक दूसरे धोने के लिए पीबीएस के पांच मिलीलीटर में गोली को फिर से खर्च करें, इसके बाद मतगणना के लिए ताजा आरपीएमआई माध्यम के 10 मिलीलीटर में पुनर्स्पितर्शी करें । फिर, कोशिकाओं को एक अतिरिक्त अपकेंद्रित्र के साथ इकट्ठा करें, और कोशिकाओं को ताजा आरपीएमआई एकाग्रता के पांच माइक्रोलीटर प्रति सात कोशिकाओं को एक बार 10 तक पतला करें। पाड़ बोने से पहले, आवश्यक के रूप में पांच मिलीमीटर लंबाई के लिए बहुलक काट, और पांच मिनट के लिए RPMI माध्यम के पांच माइक्रोलीटर के साथ पाड़ गीला ।इनक्यूबेशन के अंत में, अतिरिक्त माध्यम को हटा दें, और 10 मिनट के लिए बोन मैरो मोनोन्यूक्लियर सेल समाधान के पांच माइक्रोलीटर के साथ पाड़ ल्यूमेन लोड करें। फिर, पाड़ के ल्यूमेन के माध्यम से 21 गेज की सुई डालें, और भ्रष्टाचार को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रात भर आरपीएमआई माध्यम के एक मिलीलीटर में रखें। सामान्य संज्ञाहरण के प्रेरण के बाद, प्राप्तकर्ता जानवर में अंगुली चुटकी के लिए प्रतिक्रिया की कमी की पुष्टि करें, और जानवर की आंखों पर मरहम लगाएं।ठोड़ी से क्लैविक्स तक सर्जिकल साइट पर बालों को क्लिप करें, और जानवर को एक पृष्ठीय रेक्यूम्बेंट स्थिति में सर्जिकल पैड पर रखें। एस्पेटिक तकनीक का उपयोग करके, सर्जिकल साइट को अनुक्रमिक पोविडोन-आयोडीन, 70% इथेनॉल, पोविडोन-आयोडीन वाइप श्रृंखला के साथ कीटाणुरहित करें, और 12 बजे सिर के साथ एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे माउस को स्थानांतरित करें। क्लैविकल्स से हाइइड बोन तक मिडलाइन चीरा लगाने के लिए ठीक कैंची और माइक्रो-एडसन संदंश का उपयोग करें, और चीरा में एक आत्म-बनाए रखने वाले कोलिबरी रिट्रैक्टर डालने से पहले प्रावरणी को साफ करने के लिए ड्यूमोंट नंबर पांच और नंबर सात ठीक संदंश और एक बाँझ कपास झाड़ू का उपयोग करें।थायराइड उपास्थि, क्रिकॉइड उपास्थि और श्वासनली को बेनकाब करने के लिए पट्टा मांसपेशियों को खोलने के लिए संदंश का उपयोग करें, और स्पष्ट रूप से ऊतक के दोनों ओर समानांतर चल रहे आवर्ती लैरिंजियल नसों से श्वासनली को अलग करें, इसके बाद घेघा से श्वासनली के परिधीय अलगाव। 20 गेज सुई और सर्जिकल मार्कर का उपयोग करना, श्वासनली के पूर्वकाल भाग को दाग दें। तीसरे श्वासनली उपास्थि अंगूठी के नीचे एक चीरा बनाना Vannas-Tubingen वसंत कैंची की एक जोड़ी और डुमोंट नंबर सात ठीक संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करने के लिए श्वासनली के एक तीन अंगूठी अनुभाग पुनः प्राप्त ।ठीक घुमावदार संदंश के साथ श्वासनली पकड़े हुए, एक अस्थायी ट्रेकोस्टोमी बनाने के लिए ट्रेकिया के डिस्टल अंत को सुरक्षित करने के लिए एक बाँझ 9-0 नायलॉन सीवन का उपयोग करें, और भ्रष्टाचार के पूर्वकाल भाग को दाग देने के लिए 20 गेज सुई और सर्जिकल मार्कर का उपयोग करें। भ्रष्टाचार को प्रत्यारोपित करने के लिए, एक 9-0 बाँझ नायलॉन सीवन, ड्यूमोंट नंबर सात ठीक संदंश का उपयोग करें, और एक सुई धारक समीपस्थ-पीछे, समीपस्थ-पार्श्व, और समीपस्थ-पूर्वकाल टांके डालने के लिए, और जानवर १८० डिग्री बारी । जब माउस स्थिति में हो, तो अस्थायी ट्रेकिओस्टोमी छोड़ें, और डिस्टल एनास्टोमोसिस की सुविधा के लिए भ्रष्टाचार के पूर्वकाल भाग से पांच मिलीमीटर दूर एक पार्श्व चीरा बनाएं।डिस्टल एनास्टोमोसिस को पूरा करने के लिए, टांके को समीपस्थ एनास्टोमोसिस के समान तरीके से रखें, और भ्रष्टाचार की स्थिति और पट्टा मांसपेशियों को फिर से अनुमानित करें। फिर, एक चल पैटर्न में 9-0 बाँझ नायलॉन टांके के साथ चीरा बंद करें, और पूर्ण वसूली तक निगरानी के साथ एक हीटिंग पैड पर रखा एक वसूली पिंजरे में अकेले जानवर जगह है । प्रत्यारोपण के दो सप्ताह बाद, कुछ बेसल एपिथेलियल कोशिकाओं को बेसल सेल केराटिन पांच और 14 टिश्यू-इंजीनियर श्वासनली भ्रष्टाचार ऊतक वर्गों में धुंधला करके देखा जा सकता है।प्रत्यारोपण के सात दिनों में भ्रष्टाचार की चमकदार सतह पर बेसल कोशिकाओं का भी पता लगाया जाता है । निष्कासन और हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण पर, भ्रष्टाचार स्टेनोसिस को श्वसन संकट और स्ट्रीडोर के लक्षणों का प्रदर्शन करने वाले भ्रष्टाचार-प्रत्यारोपित चूहों में मुख्य योगदान कारक के रूप में पहचाना गया है। ध्यान दें कि सर्जिकल तकनीक के परिणामस्वरूप भ्रष्टाचार और देशी श्वासनली की टेलीस्कोपिंग एक आम खोज है।F4/80 के लिए धुंधला बेसल एपिथेलियल कोशिकाओं की उपस्थिति के साथ संयोजन के रूप में भ्रष्टाचार के स्टेनोटिक क्षेत्र के भीतर मेजबान मैक्रोफेज से पता चलता है । आवर्ती लैरिंजियल नसों में हेरफेर से बचें, और यह सुनिश्चित करें कि समीपस्थ और डिस्टल टांके एनास्टोमोसिस पर एयरटाइट सील की अनुमति देने के लिए मौजूद हैं। चूंकि यह प्रोटोकॉल जैव सुरक्षा स्तर एक एजेंट चूहों से प्राप्त बोन मैरो मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं से संबंधित है, इसलिए संदूषण से बचने के लिए उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनना महत्वपूर्ण है।

Research

JoVE Journal

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