Name: seeding and implantation of a biosynthetic tissue-engineered tracheal graft in a mouse model
Uploaded: 2019-04-01T14:30:00
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Vorremmo ringraziare Robert Strouse e la divisione di innovazioni all'ospedale dei bambini a livello nazionale per il loro supporto e soluzioni di ricerca informazioni in progettazione grafica. Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione dal NIH (NHLBI K08HL138460).

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) all'ospedale dei bambini a livello nazionale.
1. produzione di ponteggio
<ol><li>Preparare una soluzione di precursore nanofibre polimeriche di: 1) dissoluzione 8 wt % PET in 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol e riscaldamento la soluzione a 60 ° C e sciogliendo 2) 3 wt % PU in 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol a temperatura ambiente.</li>
	<li>Una volta raffreddato, combinare le soluzioni ...

<ol>
	<li>Macchiarini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+transplantation+of+a+tissue-engineered+airway.">Clinical transplantation of a tissue-engineered airway.</a> The Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).</li><li>Jungebluth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracheobronchial+transplantation+with+a+stem-cell-seeded+bioartificial+nanocomposite:+A+proof-of-concept+study.">Tracheobronchial transplantation with a stem-cell-seeded bioartificial nanocomposite: A proof-of-concept study.</a> The Lancet. 378 (9808), 1997-2004 (2011).</li><li>Elliott, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-cell-based,+tissue+engineered+tracheal+replacement+in+a+child:+A+2-year+follow-up+study.">Stem-cell-based, tissue engineered tracheal replacement in a child: A 2-year follow-up study.</a> The Lancet. 380 (9846), 994-1000 (2012).</li><li>Chiang, T., Pepper, V., Best, C., Onwuka, E., Breuer, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Translation+of+Tissue+Engineered+Trachea+Grafts.">Clinical Translation of Tissue Engineered Trachea Grafts.</a> Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 125 (11), 873-885 (2016).</li><li>Clark, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cell+seeding+on+neotissue+formation+in+a+tissue+engineered+trachea.">Effect of cell seeding on neotissue formation in a tissue engineered trachea.</a> Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 49-55 (2016).</li><li>Cole, B. B., Smith, R. W., Jenkins, K. M., Graham, B. B., Reynolds, P. R., Reynolds, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracheal+basal+cells:+A+facultative+progenitor+cell+pool.">Tracheal basal cells: A facultative progenitor cell pool.</a> American Journal of Pathology. 177 (1), 362-376 (2010).</li><li>Onwuka, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+myeloid+cell-derived+PDGF-B+in+neotissue+formation+in+a+tissue-engineered+vascular+graft.">The role of myeloid cell-derived PDGF-B in neotissue formation in a tissue-engineered vascular graft.</a> Regenerative Medicine. 12 (3), 249-261 (2017).</li><li>Grimmer, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracheal+reconstruction+using+tissue-engineered+cartilage.">Tracheal reconstruction using tissue-engineered cartilage.</a> Archives of Otolaryngology - Head and Neck Surgery. 130 (10), 1191-1196 (2004).</li><li>Wood, M. W., Murphy, S. V., Feng, X., Wright, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracheal+reconstruction+in+a+canine+model.">Tracheal reconstruction in a canine model.</a> Otolaryngology - Head and Neck Surgery (United States). 150 (3), 428-433 (2014).</li><li>Haag, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+and+angiogenic+properties+of+tissue-engineered+rat+trachea+using+genipin+cross-linked+decellularized+tissue.">Biomechanical and angiogenic properties of tissue-engineered rat trachea using genipin cross-linked decellularized tissue.</a> Biomaterials. 33 (3), 780-789 (2012).</li><li>Best, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+a+tissue-engineered+tracheal+scaffold+for+preclinical+evaluation.">Designing a tissue-engineered tracheal scaffold for preclinical evaluation.</a> International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology. 104, 155-160 (2018).</li></ol>

Sviluppo di un modello murino per i tracheas tessutale è essenziale nella comprensione dei fattori che hanno limitato la traslazione clinica TETGs; vale a dire dell'innesto crollo, stenosi ed epithelialization in ritardo4. Alcuni fattori che contribuiscono a queste limitazioni includono la selezione del materiale dell'innesto, il processo di fabbricazione, design di impalcatura e semina protocolli cellulare. Questo modello tiene conto la valutazione più veloce di questi fattori al fine di compre...

Lungo-segmento tracheali difetti possono presentare come congenite rare condizioni come completi anelli tracheali e agenesia della trachea, così come traumi, malignità e infezione. Quando superiore a 6 cm in 30% della lunghezza trachea in bambini o adulti, questi difetti non possono essere trattati con ricostruzione chirurgica. Tentativo di sostituire le vie respiratorie con tessuto autologo, trapianto cadaverico e costrutti artificiali è stati afflitti da infezione cronica, granulazione, guasto meccanico e stenosi.
Innesti di tessuto ingegnerizzato tracheali (TETGs) possono potenzialmente risolvere questi problemi, evitando la necessità di immunosoppressione tutta la vita. Nell'ultimo decennio, TETGs sono stati testati in modelli animali e utilizzate clinicamente in rari casi di uso compassionevole1,2,3. Negli studi sugli animali sia clinici che grandi, recupero post-operatorio da tessutale delle vie respiratorie sostituzione necessari numerosi interventi per stenosi combattimento (definita come > 50% lo stringimento luminal) e mantenere la pervietà delle vie aeree. Lavoro supplementare TETG ha cercato di ridurre questa stenosi attraverso valutare il ruolo della semina scelta, vascolarizzazione e impalcatura design cellulare. Impalcatura design finalizzate al ripristino nativo trachea struttura/funzione e scelte semina delle cellule sono stati concentrati principalmente su cellule epiteliali respiratorie e condrociti seminati su vari ponteggi riassorbibili, non riassorbibile e decellularizzati. Come vascolarizzazione probabilmente gioca un ruolo importante nello sviluppo di stenosi, altri gruppi hanno messo a fuoco sull'ottimizzazione in vitro o eterotopica modelli per accelerare la rivascolarizzazione o neoangiogenesi4. Ciò nonostante, ottenendo successo vascolarizzazione pur mantenendo un TETG meccanicamente competenti e funzionale rimane una sfida. Nonostante i recenti progressi, riducendo al minimo la stenosi rimane un ostacolo fondamentale alla traduzione clinica.
Per studiare questa risposta istopatologica a TETG l'impianto in vivo, abbiamo sviluppato un modello ovino di sostituzione tracheale tessutale. L'innesto era composto da un misto di polietilene tereftalato (PET) e poliuretano dell'impalcatura elettrofilate (PU) seminati con cellule mononucleari derivate da midollo osseo (BM-MNC). In questo piccolo gruppo, abbiamo dimostrato che seminato autologo BM-MNC accelerata riepitelizzazione e stenosi5in ritardo. Sebbene la semina con autologo BM-MNC migliorata sopravvivenza, il meccanismo cellulare da cui BM-MNC modulano la formazione di tessuto funzionale rimane poco chiaro.
Indagine sullo sviluppo richiesto livello cellulare di un modello murino di tessuto ingegnerizzato sostituzione tracheale. Simile allo studio degli ovini, abbiamo utilizzato un ponteggio elettrofilate PET:PU seminato con BM-MNCs. coerentemente con il modello ovino, stenosi TETG sviluppato nel corso delle prime due settimane dopo l'impianto1,2,3 ,5. Ciò ha suggerito che il modello murino ha ricapitolato la patologia osservata in precedenza, che ci permette di interrogare ulteriormente i meccanismi cellulari alla base di stenosi della via aerea.
In questo rapporto, abbiamo dettaglio il nostro protocollo per ingegneria tessutale sostituzione trachea nel modello del topo tra cui impalcatura produzione, isolamento BM-MNC, innesto semina e l'impianto (Figura 1, Figura 2).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:827px;" width="827">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">0.9% Sodium chloride injection</td>
			<td style="width:119px;">APP Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:119px;">NDC 63323-186-10</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">10cc serological pipet</td>
			<td style="width:119px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">357551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">18G 1.5in. Needle</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">305190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">1mL Syringe</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">24-well plate</td>
			<td style="width:119px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">25cc serological pipet</td>
			<td style="width:119px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">356535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">25G 1in. Needle</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">305125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">50cc tube</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">Alcohol prep pads</td>
			<td style="width:119px;">Fisher Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">NDC 69250-661-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">Baytril (enrofloxacin) solution</td>
			<td style="width:119px;">Bayer Healthcare, LLC</td>
			<td style="width:119px;">NDC 0859-2267-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:423px;">Black polyamide monofilament suture, 9-0</td>
			<td style="width:119px;">AROSurgical Instruments Corporation</td>
			<td style="width:119px;">T05A09N10-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">C57BL/6, female</td>
			<td style="width:119px;">Jackson laboratories</td>
			<td style="width:119px;">664</td>
			<td style="width:167px;">6-8 weeks old</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Citrate Buffer pH 6.0 20x concentrate</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Colibri retractors</td>
			<td style="width:119px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">17000-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Cotton tipped applicators</td>
			<td style="width:119px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">23-400-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Cytokeratin 14 Monoclonal Antibody</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">MA5-11599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td style="width:119px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Dumont #5/45 forceps</td>
			<td style="width:119px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Dumont #7 - Fine Forceps</td>
			<td style="width:119px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">11274-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">F4/80 Rat anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:119px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">MCA497R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Ficoll</td>
			<td style="width:119px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">10831-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Fine scissors- Sharp-blunt</td>
			<td style="width:119px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">14028-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Fisherbrand Premium Cover Glasses</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">12-548-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Fluoroshield Mounting Media with DAPI</td>
			<td style="width:119px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab104139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Goat-anti mouse IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Goat-anti Rabbit IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">A-11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Goat-anti Rat IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 647</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">A-21247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">Ibuprofen</td>
			<td style="width:119px;">Precision Dose, Inc</td>
			<td style="width:119px;">NDC 68094-494-59</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:423px;">Iodine prep pads</td>
			<td style="width:119px;">Professional disposables international, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">NDC 10819-3883-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Keratin 5 Polyclonal Antibody, Purified</td>
			<td style="width:119px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">905501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Ketamine hydrochloride injection</td>
			<td style="width:119px;">Hospira Inc.</td>
			<td style="width:119px;">NDC 0409-2053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Micro-Adson forceps</td>
			<td style="width:119px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">11018-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Microscope</td>
			<td style="width:119px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">M80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Non-woven sponges</td>
			<td style="width:119px;">Covidien</td>
			<td style="width:119px;">441401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:423px;">Opthalmic ointment</td>
			<td style="width:119px;">Dechra Veterinary products</td>
			<td style="width:119px;">NDC 17033-211-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">PBS</td>
			<td style="width:119px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">PET/PU (Polyethylene terephthalate &#38; Polyurethane) scaffolds</td>
			<td style="width:119px;">Nanofiber solutions</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom ordered</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Petri dish</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">RPMI 1640 Medium</td>
			<td style="width:119px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">TISH Needle Holder/Forceps</td>
			<td style="width:119px;">Micrins</td>
			<td style="width:119px;">MI1540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Trimmer</td>
			<td style="width:119px;">Wahl</td>
			<td style="width:119px;">9854-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vannas-T&#252;bingen Spring Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15008-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Warm water recirculator</td>
			<td style="width:119px;">Gaymar</td>
			<td style="width:119px;">TP-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">Xylazine sterile solution</td>
			<td style="width:119px;">Akorn animal health</td>
			<td style="width:119px;">NDC 59399-110-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

seeding and implantation of a biosynthetic tissue-engineered tracheal graft in a mouse model

Opzioni di trattamento per difetti tracheale congenita o secondaria lungo segmento storicamente sono state limitate a causa di un'incapacità di sostituire il tessuto funzionale. Ingegneria tissutale tiene la grande promessa come potenziale soluzione con la sua capacità di integrare le cellule e molecole di segnalazione di un'impalcatura 3-dimensionale. Lavoro recente con innesti di tessuto ingegnerizzato tracheale (TETGs) ha visto un certo successo, ma loro traduzione è stata limitata dalla stenosi dell'innesto, innesto crollo e ritardato epithelialization. Al fine di indagare i meccanismi che guidano questi problemi, abbiamo sviluppato un modello murino per l'impianto di protesi tracheale ingegnerizzata. TETGs sono stati costruiti utilizzando elettrofilate polimeri in polietilene tereftalato (PET) e poliuretano (PU) in una miscela di PET e PU (20: 80 per cento del peso). Ponteggi sono state seminate utilizzando cellule mononucleari del midollo osseo isolate da 6-8 settimana-vecchi topi C57BL/6 tramite centrifugazione di pendenza. 10 milioni di cellule per innesto sono state seminate sul lume dell'impalcatura e lasciate Incubare durante la notte prima dell'impianto tra i terzi e settimo tracheali anelli. Questi innesti sono stati in grado di riassumere i risultati di stenosi e ritardato epithelialization come dimostrato dall'analisi istologica e la mancanza di cheratina 5 e la cheratina 14 cellule epiteliali basali su immunofluorescenza. Questo modello servirà come uno strumento per indagare i meccanismi cellulari e molecolari coinvolti nel rimodellamento di host.

La figura 1 illustra uno schema di TETG semina e l'impianto. Midollo osseo è stato raccolto dai topi C57BL/6 e coltivate in vitro. BM-MNC sono stati isolati mediante centrifugazione di densità e seminate sul TETG. TETGs teste di serie sono stati impiantati in un syngeneic del topo destinatario C57BL/6.
Figura 2 è una panoramica dello scaffold PET:PU TETG pro...

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Seeding and Implantation of a Biosynthetic Tissue-engineered Tracheal Graft in a Mouse Model

Stenosi dell'innesto per rappresentare un ostacolo critico in sostituzione di tessuto ingegnerizzato delle vie respiratorie. Per studiare i meccanismi cellulari alla base di stenosi, utilizziamo un modello murino di tessuti ingegnerizzati sostituzione tracheale con cellule mononucleari seminato del midollo osseo (BM-MNC). Qui, abbiamo dettaglio nostro protocollo, compreso produzione dell'impalcatura, BM-MNC isolamento, innesto semina e l'impianto.

Semina e impianto di un innesto trachea tessutale biosintetico in un modello murino

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional ...

Le applicazioni cliniche della trachea ingegnerizzata dai tessuti sono state limitate a causa della stenosi dell'innesto e dell'epitelializzazione ritardata. Un modello di topo di sostituzione tracheale ortotopica consente lo studio dei meccanismi cellulari che guidano la rigenerazione. I difetti a lungo segmento delle vie aeree possono superare ciò che le terapie attuali sono in grado di curare.La trachea di ingegneria tissutale offre il potenziale per creare un organo sostitutivo per queste condizioni. Questo modello può essere applicato agli animali con proprietà transgeniche e di tracciamento del lignaggio. Possiamo quindi modulare i fattori ospiti che contribuiscono alla rigenerazione dell'innesto.Una delle sfide principali nella produzione delle impalcature sarà misurare e determinare che i parametri di elettrofilatura sono sempre gli stessi. Quindi ogni volta che produci un'impalcatura, devi misurare la distanza da punta a collettore, l'umidità e la temperatura per assicurarti che le impalcature siano le stesse ogni volta. Fondamentale per il successo di questo modello è il perfezionamento delle tecniche microchirurgiche e il mantenimento del piano corretto dell'anestesia per consentire la ventilazione spontanea durante tutta la procedura.Poiché la trachea ospite ha un diametro interno di circa un millimetro, la manipolazione e il posizionamento della sutura dei tessuti nativi sono importanti e meglio dimostrati visivamente. Inizia sciogliendo l'otto volte il peso percentuale di polietilene tereftalato, o PET, in esafluoroisopropanolo e riscaldando la soluzione risultante a 60 gradi Celsius. Mentre la soluzione viene riscaldata, sciogliere il tre volte il peso per cento di poliuretano, o PU, in esafluoroisopropanolo, combinando le soluzioni una volta raffreddata la soluzione pet.Caricare una siringa da 60 millilitri dotata di un ago a punta smussata calibro 20 con la miscela polimerica. Utilizzare la siringa e un alimentatore CC ad alta tensione impostato su 14 kilovolt positivi sull'ago, un altro alimentatore CC ad alta tensione impostato su meno tre kilovolt, una portata di cinque millilitri all'ora e una distanza punta-substrato di 20 centimetri per elettrofilare il polimero su un'asta di acciaio inossidabile di un millimetro di diametro ruotata a 350 rotazioni al minuto. Continuare l'elettrofilatura fino a ottenere uno spessore della parete dell'impalcatura di 300 micrometri.Quindi, far scorrere l'impalcatura dall'asta, posizionare l'impalcatura sotto vuoto durante la notte per rimuovere qualsiasi solvente residuo e sterilizzare l'impalcatura con un dosaggio di luce ultravioletta di 350 millijoule per centimetro squadrato per circa 15 minuti. In condizioni sterili, rimuovere la pelle dagli arti posteriori di un topo C57-Black/6 di sei-otto settimane, femmina, con forbici fini e forcep micro-Adson, e utilizzare le forcep Dumont numero cinque e le forcep Dumont numero 5/45 per rimuovere la fascia e i tendini. Separare le ossa per consentire a ciascuna di esse di essere tagliate su entrambe le estremità e utilizzare una siringa da cinque millilitri dotata di un ago calibro 25 per sciacquare il midollo osseo in una piastra di Petri contenente 30 millilitri di mezzo RPMI.Una volta che tutte le ossa sono state larcate, filtrare il midollo osseo attraverso un filtro cellulare in nylon da 70 micrometri in un tubo conico da 50 millilitri e trasferire il tubo in un armadio di biosicurezza. Aggiungere delicatamente la soluzione di cellule mononucleari filtrate lungo il lato di un tubo da 15 millilitri contenente cinque millilitri di polisucrose e diatrizoato di sodio senza mescolare gli strati e separare il plasma dai globuli bianchi e rossi per separazione del gradiente di densità. Alla fine della centrifugazione, raccogliere lo strato cristallino medio costituito dalle cellule mononucleari del midollo osseo e lavare le cellule mononucleari del midollo osseo con un rapporto uno a uno in PBS mediante centrifugazione.Resuspend il pellet in cinque millilitri di PBS per un secondo lavaggio, seguito da resuspensione in 10 millilitri di mezzo RPMI fresco per il conteggio. Quindi, raccogliere le cellule con una centrifugazione aggiuntiva e diluire le cellule a una per 10 alle sette cellule per cinque microlitri di concentrazione di RPMI fresca. Prima di seminare l'impalcatura, tagliare il polimero a una lunghezza di cinque millimetri se necessario e bagnare l'impalcatura con cinque microlitri di mezzo RPMI per cinque minuti.Al termine dell'incubazione, rimuovere il mezzo in eccesso e caricare il lume dell'impalcatura con cinque microlitri della soluzione cellulare mononucleare del midollo osseo per 10 minuti. Quindi, inserire un ago calibro 21 attraverso il lume dell'impalcatura e posizionare l'innesto in un millilitro di mezzo RPMI durante la notte in un incubatore Celsius di 37 gradi. Dopo l'induzione dell'anestesia generale, confermare una mancanza di risposta al dito del piedi nell'animale ricevente e applicare unguento agli occhi dell'animale.Ritagliare i capelli sul sito chirurgico dal mento alle claviole e posizionare l'animale su un cuscinetto chirurgico in una posizione reclinata dorsale. Utilizzando la tecnica aseptica, disinfettare il sito chirurgico con un povidone-iodio sequenziale, il 70% di etanolo, la serie di salviette povidone-iodio e spostare il mouse al microscopio sezionato con la testa a ore 12. Utilizzare forbici fini e forcelle micro-Adson per fare un'incisione della linea mediana dalle claviole all'osso ioide, e utilizzare le forcelle fini Dumont numero cinque e numero sette e un batuffolo di cotone sterile per pulire la fascia prima di inserire un retrattore Colibri autoserronte nell'incisione.Usa le pinie per aprire i muscoli della cinghia per esporre la cartilagine tiroidea, la cartilagine cricoide e la trachea e separare senza mezzi termini la trachea dai nervi laringei ricorrenti che corrono paralleli su entrambi i lati del tessuto, seguita dalla separazione circonferenziale della trachea dall'esofago. Utilizzando un ago calibro 20 e un marcatore chirurgico, macchiare la porzione anteriore della trachea. Fai un'incisione sotto il terzo anello di cartilagine tracheale usando un paio di forbici a molla Vannas-Tubingen e un paio di forcette fini Dumont numero sette per resect una sezione a tre anelli di trachea.Tenendo la trachea con le pinza curva fine, utilizzare una sutura sterile in nylon 9-0 per fissare l'estremità distale della trachea allo sterno per creare una tracheostomia temporanea e utilizzare l'ago calibro 20 e il marcatore chirurgico per macchiare la porzione anteriore dell'innesto. Per impiantare l'innesto, utilizzare una sutura di nylon sterile 9-0, dumont numero sette pinza fine e un portaaghi per inserire i punti prossimale-posteriore, prossimale-laterale e prossimale-anteriore e girare l'animale di 180 gradi. Quando il topo è in posizione, rilasciare la tracheostomia temporanea e fare un'incisione laterale a cinque millimetri di distanza dalla porzione anteriore dell'innesto per facilitare l'anastomosi distale.Per completare l'anastomosi distale, posizionare le suture in modo simile all'anastomosi prossimale e ri-approssimare la posizione dell'innesto e i muscoli del cinturino. Quindi, chiudere l'incisione con 9-0 suture sterili in nylon in un modello di corsa e posizionare l'animale da solo in una gabbia di recupero posta su una pastiglia riscaldante con monitoraggio fino al pieno recupero. Due settimane dopo l'impianto, alcune cellule epiteliali basali possono essere osservate dalla cheratina cellulare basale cinque e 14 colorazione in sezioni di tessuto di innesto tracheale ingegnerizzate dai tessuti.Le cellule basali vengono rilevate anche sulla superficie luminare dell'innesto a sette giorni dall'impianto. Dopo l'espianto e l'analisi istologica, la stenosi dell'innesto è stata identificata come il principale fattore che contribuisce nei topi impiantati innesto dimostrando segni di disagio respiratorio e stridor. Si noti che il telescopio dell'innesto e della trachea nativa è una scoperta comune come risultato della tecnica chirurgica.La colorazione per F4/80 rivela macrofagi ospiti all'interno della regione stenotica dell'innesto in combinazione con la presenza delle cellule epiteliali basali. Evitare la manipolazione dei nervi laringei ricorrenti e assicurarsi che le suture prossimali e distale siano in posizione per consentire una tenuta ermetica all'anastomosi. Poiché questo protocollo riguarda le cellule mononucleari del midollo osseo derivate da topi agenti di livello uno di biosicurezza, è importante indossare dispositivi di protezione individuale adeguati per evitare la contaminazione.

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