Name: seeding and implantation of a biosynthetic tissue-engineered tracheal graft in a mouse model
Uploaded: 2019-04-01T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Seeding and Implantation of a Biosynthetic Tissue-engineered Tracheal Graft in a Mouse Model at JoVE.com

Vi ønsker å erkjenne Robert Strouse og forskning løsninger og innovasjoner divisjon landsomfattende barnesykehus for deres støtte i grafisk design. Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra NIH (NHLBI K08HL138460).

Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) på landsomfattende Children's Hospital.
1. stillaset produksjon
<ol><li>Forberede en polymer nanofiber forløper løsning av: 1) oppløsning 8 wt % PET i 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol og varme løsningen til 60 ° C og ved 2) oppløsning 3 wt % PU i 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol ved romtemperatur.</li>
	<li>Når avkjølt, kombinere løsningene for å lage en siste polymer blanding...

<ol>
	<li>Macchiarini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+transplantation+of+a+tissue-engineered+airway.">Clinical transplantation of a tissue-engineered airway.</a> The Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).</li><li>Jungebluth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracheobronchial+transplantation+with+a+stem-cell-seeded+bioartificial+nanocomposite:+A+proof-of-concept+study.">Tracheobronchial transplantation with a stem-cell-seeded bioartificial nanocomposite: A proof-of-concept study.</a> The Lancet. 378 (9808), 1997-2004 (2011).</li><li>Elliott, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-cell-based,+tissue+engineered+tracheal+replacement+in+a+child:+A+2-year+follow-up+study.">Stem-cell-based, tissue engineered tracheal replacement in a child: A 2-year follow-up study.</a> The Lancet. 380 (9846), 994-1000 (2012).</li><li>Chiang, T., Pepper, V., Best, C., Onwuka, E., Breuer, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Translation+of+Tissue+Engineered+Trachea+Grafts.">Clinical Translation of Tissue Engineered Trachea Grafts.</a> Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 125 (11), 873-885 (2016).</li><li>Clark, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cell+seeding+on+neotissue+formation+in+a+tissue+engineered+trachea.">Effect of cell seeding on neotissue formation in a tissue engineered trachea.</a> Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 49-55 (2016).</li><li>Cole, B. B., Smith, R. W., Jenkins, K. M., Graham, B. B., Reynolds, P. R., Reynolds, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracheal+basal+cells:+A+facultative+progenitor+cell+pool.">Tracheal basal cells: A facultative progenitor cell pool.</a> American Journal of Pathology. 177 (1), 362-376 (2010).</li><li>Onwuka, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+myeloid+cell-derived+PDGF-B+in+neotissue+formation+in+a+tissue-engineered+vascular+graft.">The role of myeloid cell-derived PDGF-B in neotissue formation in a tissue-engineered vascular graft.</a> Regenerative Medicine. 12 (3), 249-261 (2017).</li><li>Grimmer, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracheal+reconstruction+using+tissue-engineered+cartilage.">Tracheal reconstruction using tissue-engineered cartilage.</a> Archives of Otolaryngology - Head and Neck Surgery. 130 (10), 1191-1196 (2004).</li><li>Wood, M. W., Murphy, S. V., Feng, X., Wright, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracheal+reconstruction+in+a+canine+model.">Tracheal reconstruction in a canine model.</a> Otolaryngology - Head and Neck Surgery (United States). 150 (3), 428-433 (2014).</li><li>Haag, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+and+angiogenic+properties+of+tissue-engineered+rat+trachea+using+genipin+cross-linked+decellularized+tissue.">Biomechanical and angiogenic properties of tissue-engineered rat trachea using genipin cross-linked decellularized tissue.</a> Biomaterials. 33 (3), 780-789 (2012).</li><li>Best, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+a+tissue-engineered+tracheal+scaffold+for+preclinical+evaluation.">Designing a tissue-engineered tracheal scaffold for preclinical evaluation.</a> International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology. 104, 155-160 (2018).</li></ol>

Utvikling av en musemodell for vev utviklet tracheas er viktig i å forstå faktorene som har begrenset klinisk oversettelse av TETGs; nemlig pode kollapse, stenose og forsinket epithelialization4. Noen faktorer som bidrar til disse begrensningene inkluderer utvalg av pode materiale, produksjonsprosess, stillaset design og celle seeding protokoller. Denne modellen muliggjør raskere evaluering av disse faktorene for å forstå cellulære og molekylære mekanismer berører dem.
<p class="jove_c...

Lang-segmentet tracheal defekter kan presentere som sjelden medfødt forhold som fullstendig tracheal ringer og tracheal agenesis, samt traumer, kreft og infeksjoner. Når overstiger 6 cm voksne eller 30% av den tracheal lengden i barn, kan ikke disse feilene behandles med kirurgisk gjenoppbygging. Forsøk på å erstatte luftveiene med autologous vev, cadaveric transplantasjoner og kunstig konstruksjoner har vært plaget av kronisk infeksjon, korning, mekanisk svikt og stenose.
Vev utvikling tracheal grafts (TETGs) kan potensielt løse problemene samtidig unngå behovet for livslang immunsuppresjon. I det siste tiåret, har TETGs blitt testet i dyremodeller og utnyttet klinisk i sjeldne tilfeller medfølende Bruk1,2,3. I både kliniske og store dyrestudier, postoperativ utvinning fra vev utvikling airway erstatning kreves mange tiltak for å bekjempe stenose (definert som > 50% luminal innsnevring) og vedlikeholde airway patency. Ekstra TETG arbeid har søkt å redusere denne stenose gjennom vurdere rollen celle seeding valg, endometrial blodkar og stillaset design. Cellen seeding valg og stillaset design sikte på å gjenopprette opprinnelige luftrøret struktur/funksjon har hovedsakelig vært fokusert på luftveiene epitelceller og chondrocytes seeded på ulike resorbable, ikke-resorbable og decellularized stillaser. Som endometrial blodkar sannsynligvis spiller en viktig rolle i utviklingen av stenose, har andre grupper fokusert på optimalisering i vitro eller heterotopic modeller å fremskynde revaskularisering eller neoangiogenesis4. Likevel, å oppnå vellykket endometrial blodkar samtidig opprettholde en mekanisk kompetente og funksjonelle TETG er fortsatt en utfordring. Til tross for nylige fremskritt forblir minimere stenose en kritisk utfordring for klinisk oversettelse.
For å undersøke dette histopathological svaret til TETG implantasjon i vivo, utviklet vi en ovine modell av vev utvikling tracheal erstatning. Graftet ble komponert av en blandet polyetylentereftalat (PET) og polyuretan (PU) electrospun stillaset plantet med Ben margtransplantasjon-avledet mononukleære celler (BM-MNCs). I denne liten kohort viste vi at seeded autologous BM-MNCs akselerert re epithelialization og forsinket stenose5. Selv om seeding autologous BM-MNCs bedre overlevelse, fortsatt mobilnettet mekanismen som BM-MNCs modulerer dannelsen av funksjonelle neotissue uklart.
Undersøkelse på mobilnettet nivå kreves utviklingen av murine modell av vev konstruert tracheal erstatning. Lik ovine studien, benyttet vi en PET:PU electrospun stillaset plantet med BM-MNCs. konsekvent med ovine modellen, som TETG stenose utviklet i løpet av de første to ukene etter implantasjon1,2,3 ,5. Dette foreslo at murine modellen recapitulated patologi observert tidligere, slik at vi kan ytterligere forhøre mobilnettet mekanismene bak airway stenose.
I denne rapporten detalj vi våre protokollen for vev utvikling tracheal erstatning i musemodell inkludert stillaset produksjon, BM-MNC isolasjon, pode såing og implantasjon (figur 1, figur 2).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:827px;" width="827">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">0.9% Sodium chloride injection</td>
			<td style="width:119px;">APP Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:119px;">NDC 63323-186-10</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">10cc serological pipet</td>
			<td style="width:119px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">357551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">18G 1.5in. Needle</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">305190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">1mL Syringe</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">24-well plate</td>
			<td style="width:119px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">25cc serological pipet</td>
			<td style="width:119px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">356535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">25G 1in. Needle</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">305125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">50cc tube</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">Alcohol prep pads</td>
			<td style="width:119px;">Fisher Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">NDC 69250-661-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">Baytril (enrofloxacin) solution</td>
			<td style="width:119px;">Bayer Healthcare, LLC</td>
			<td style="width:119px;">NDC 0859-2267-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:423px;">Black polyamide monofilament suture, 9-0</td>
			<td style="width:119px;">AROSurgical Instruments Corporation</td>
			<td style="width:119px;">T05A09N10-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">C57BL/6, female</td>
			<td style="width:119px;">Jackson laboratories</td>
			<td style="width:119px;">664</td>
			<td style="width:167px;">6-8 weeks old</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Citrate Buffer pH 6.0 20x concentrate</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Colibri retractors</td>
			<td style="width:119px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">17000-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Cotton tipped applicators</td>
			<td style="width:119px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">23-400-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Cytokeratin 14 Monoclonal Antibody</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">MA5-11599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td style="width:119px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Dumont #5/45 forceps</td>
			<td style="width:119px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Dumont #7 - Fine Forceps</td>
			<td style="width:119px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">11274-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">F4/80 Rat anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:119px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">MCA497R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Ficoll</td>
			<td style="width:119px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">10831-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Fine scissors- Sharp-blunt</td>
			<td style="width:119px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">14028-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Fisherbrand Premium Cover Glasses</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">12-548-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Fluoroshield Mounting Media with DAPI</td>
			<td style="width:119px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab104139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Goat-anti mouse IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Goat-anti Rabbit IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">A-11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Goat-anti Rat IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 647</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">A-21247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">Ibuprofen</td>
			<td style="width:119px;">Precision Dose, Inc</td>
			<td style="width:119px;">NDC 68094-494-59</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:423px;">Iodine prep pads</td>
			<td style="width:119px;">Professional disposables international, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">NDC 10819-3883-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Keratin 5 Polyclonal Antibody, Purified</td>
			<td style="width:119px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">905501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Ketamine hydrochloride injection</td>
			<td style="width:119px;">Hospira Inc.</td>
			<td style="width:119px;">NDC 0409-2053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Micro-Adson forceps</td>
			<td style="width:119px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">11018-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Microscope</td>
			<td style="width:119px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">M80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Non-woven sponges</td>
			<td style="width:119px;">Covidien</td>
			<td style="width:119px;">441401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:423px;">Opthalmic ointment</td>
			<td style="width:119px;">Dechra Veterinary products</td>
			<td style="width:119px;">NDC 17033-211-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">PBS</td>
			<td style="width:119px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">PET/PU (Polyethylene terephthalate &#38; Polyurethane) scaffolds</td>
			<td style="width:119px;">Nanofiber solutions</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom ordered</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Petri dish</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">RPMI 1640 Medium</td>
			<td style="width:119px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">TISH Needle Holder/Forceps</td>
			<td style="width:119px;">Micrins</td>
			<td style="width:119px;">MI1540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Trimmer</td>
			<td style="width:119px;">Wahl</td>
			<td style="width:119px;">9854-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vannas-T&#252;bingen Spring Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15008-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Warm water recirculator</td>
			<td style="width:119px;">Gaymar</td>
			<td style="width:119px;">TP-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">Xylazine sterile solution</td>
			<td style="width:119px;">Akorn animal health</td>
			<td style="width:119px;">NDC 59399-110-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

seeding and implantation of a biosynthetic tissue-engineered tracheal graft in a mouse model

Behandlingsalternativer for medfødt eller sekundær lang segmentet tracheal mangler har historisk vært begrenset på grunn av en manglende evne til å erstatte funksjonelle vev. Tissue engineering har store løftet som en potensiell løsning med sin evne til å integrere celler og signalnettverk molekyler i en 3-dimensjonal stillaset. Nye studier av vev utvikling tracheal grafts (TETGs) har sett noen suksess, men deres oversettelse har vært begrenset av pode stenose, pode sammenbruddet og forsinket epithelialization. For å undersøke mekanismer kjører disse spørsmålene, har vi utviklet en musemodell for vev utvikling tracheal pode implantasjon. TETGs ble bygget med electrospun polymerer polyetylentereftalat (PET) og polyuretan (PU) i en blanding av PET og PU (20:80 prosent vekt). Stillaser var så frø bruke benmarg mononukleære celler isolert fra 6-8-uke-gamle C57BL/6 mus med gradient sentrifugering. Ti millioner celler per pode var sådd på lumen av stillaset og lov til å ruge over natten før implantasjon mellom tredje og sjuende tracheal ringene. Disse grafts kunne recapitulate resultatene av stenose og forsinket epithelialization som demonstrert av histologiske analyse og mangel på Keratin 5 og Keratin 14 basale epitelceller på immunofluorescence. Denne modellen vil fungere som et verktøy for å undersøke mobilnettet og molekylære mekanismer involvert i vert remodeling.

Figur 1 illustrerer en skjematisk av TETG frø og implantasjon. Benmarg ble høstet fra C57BL/6 mus og kultivert i vitro. BM-MNCs var isolert av tetthet sentrifugering og sådd på TETG. Seeded TETGs ble implantert i en syngeneic C57BL/6 mottaker mus.
Figur 2 er en oversikt over PET:PU TETG stillaset produksjonsprosess. Pet:PU løsningen var electrospun på en ...

Watch this Scientific Journal Video about Seeding and Implantation of a Biosynthetic Tissue-engineered Tracheal Graft in a Mouse Model at JoVE.com

Seeding and Implantation of a Biosynthetic Tissue-engineered Tracheal Graft in a Mouse Model

Pode stenose utgjør en viktig hindring i vev utvikling airway erstatning. For å undersøke mobilnettet mekanismene bak stenose, benytter vi en murine modell av vev utvikling tracheal erstatning med seeded benmarg mononukleære celler (BM-MNC). Her, detalj vi våre protokollen, inkludert stillaset produksjon, BM-MNC isolasjon, pode såing og implantasjon.

Såing og implantering av en biosyntetiske vev-konstruert Tracheal pode i en musemodell

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional ...

Kliniske anvendelser av vevskonstruert luftrør har vært begrenset på grunn av graft stenose og forsinket epitelisering. En musemodell av ortotopisk trakealerstatning tillater studiet av cellulære mekanismer som driver regenerering. Langsegmentdefekter i luftveiene kan overstige hvilke nåværende behandlinger som er i stand til å kurere.Den vevskonstruerte luftrøret gir potensial til å skape et erstatningsorgan for disse forholdene. Denne modellen kan brukes på dyr med transgene og avstamning sporing egenskaper. Vi kan deretter modulere vertsfaktorene som bidrar til graftregenerering.En av de viktigste utfordringene med å produsere stillasene vil være å måle og bestemme at elektrospiningparametrene er de samme hver gang. Så hver gang du produserer et stillas, må du måle tip-to-collector avstand, fuktighet, og temperaturen for å sikre stillas er de samme hver gang. Kritisk til suksessen til denne modellen er raffinement av mikrokirurgiske teknikker og vedlikehold av riktig anestesiplan for å tillate spontan ventilasjon gjennom hele prosedyren.Siden vertstrachea har en intern diameter på rundt en millimeter, er pode og innfødt vevshåndtering og suturplassering viktig og best demonstrert visuelt. Begynn med å oppløse åtte vekt prosent polyetylenterephthalate, eller PET, i hexafluoroisopropanol og oppvarming av den resulterende løsningen til 60 grader Celsius. Mens løsningen varmes opp, oppløs tre vektprosent polyuretan, eller PU, i hexafluoroisopropanol, som kombinerer løsningene når PET-løsningen er avkjølt.Legg i en 60-milliliter sprøyte utstyrt med en 20-gauge stump-tip nål med polymerblandingen. Bruk sprøyten og en høyspent DC strømforsyning satt til positive 14 kilovolts på nålen, en annen høyspent DC strømforsyning satt til minus tre kilovolts, en fem-milliliter per time strømningshastighet, og en 20-centimeter tip-to-substrat avstand til elektrospin polymeren på en en millimeter diameter rustfritt stål stang blir slått på 350 rotasjoner per minutt. Fortsett elektrospining til en 300-mikrometerstillveggtykkelse oppnås.Skyv deretter stillaset av stangen, plasser stillaset under vakuum over natten for å fjerne eventuelle gjenværende løsningsmiddel, og steriliser stillaset med en ultrafiolett lysdose på 350 millijouler per centimeter kvadrert i ca 15 minutter. Under sterile forhold, fjern huden fra baklemmer av en seks til åtte uker gammel, kvinne, C57-Svart /6 mus med fin saks og mikro-Adson tang, og bruk Dumont nummer fem tang og Dumont nummer 5/45 tang for å fjerne fascia og sener. Skill beinene slik at hver av dem kan kuttes i begge ender, og bruk en fem milliliter sprøyte utstyrt med en 25-gauge nål for å skylle benmargen inn i en petriskål som inneholder 30 milliliter RPMI-medium.Når alle beinene er spylt, filtrere benmargen gjennom en 70-mikrometer nylon celle sil inn i en 50-milliliter konisk rør, og overføre røret til en biosikkerhet skap. Tilsett forsiktig den filtrerte mononukleære celleløsningen ned på siden av et 15-milliliter rør som inneholder fem milliliter polysukrose og natriumdiatrizoat uten å blande lagene, og skille plasmaet fra de hvite og røde blodlegemene ved tetthetsgradientseparasjon. På slutten av sentrifugeringen samler du det midterste klare laget bestående av benmargsmononukleære celler, og vask benmargens mononukleære celler i et en-til-en-forhold i PBS ved sentrifugering.Resuspend pellet i fem milliliter PBS for en andre vask, etterfulgt av resuspension i 10 milliliter frisk RPMI medium for telling. Deretter samler cellene med en ekstra sentrifugasjon, og fortynner cellene til en gang 10 til de syv cellene per fem mikroliter med frisk RPMI-konsentrasjon. Før du såer stillaset, kutt polymeren til en fem millimeter lengde etter behov, og våt stillaset med fem mikroliter RPMI-medium i fem minutter.På slutten av inkubasjonen fjerner du det overskytende mediet, og laster stillaslumen med fem mikroliter av benmargen mononukleær celleløsning i 10 minutter. Deretter setter du inn en 21-gauge nål gjennom lumen av stillaset, og plasser pode i en milliliter RPMI medium over natten i en 37-graders Celsius inkubator. Etter induksjon av generell anestesi, bekrefter mangel på respons på tåklemme i mottakerdyret, og bruk salve på dyrets øyne.Klipp håret på operasjonsstedet fra hake til klavicles, og plasser dyret på en kirurgisk pute i en dorsal liggende stilling. Ved hjelp av aseptisk teknikk desinfiserer du operasjonsstedet med et sekvensielt povidon-jod, 70 % etanol, povidon-jodslettingsserie og beveger musen under et dissekerende mikroskop med hodet klokken 12. Bruk fin saks og mikro-Adson tang for å lage en midline snitt fra lene til hyoid bein, og bruke Dumont nummer fem og nummer syv fine tang og en steril bomullspinne for å rense fascia før du setter inn en selvbeholdende Colibri retractor i snittet.Bruk tangen til å åpne stroppen muskler for å utsette skjoldbrusk brusk, cricoid brusk, og luftrør, og rett ut skille luftrøret fra tilbakevendende laryngeal nerver kjører parallelt på hver side av vevet, etterfulgt av omkrets separasjon av luftrøret fra spiserøret. Bruk en 20-gauge nål og kirurgisk markør, flekk den fremre delen av luftrøret. Lag et snitt under den tredje trakeal brusk ringen ved hjelp av et par Vannas-Tubingen våren saks og et par Dumont nummer syv fine tang å resect en tre-ring del av luftrøret.Hold luftrøret med de fine buede tangene, bruk en steril 9-0 nylonsug for å feste den distale enden av luftrøret til brystbenet for å skape en midlertidig trakeostomi, og bruk den 20-gauge nålen og kirurgiske markøren til å flekke den fremre delen av transplantatet. For å implantere transplantatet, bruk en 9-0 steril nylon sutur, Dumont nummer syv fine tang, og en nål holder for å sette inn proksimal-bakre, proksimal-lateral, og proksimal-fremre masker, og slå dyret 180 grader. Når musen er i posisjon, slipp den midlertidige trakeostomien, og lag et lateralt snitt fem millimeter unna den fremre delen av transplantatet for å lette den distale anastomosen.For å fullføre distale anastomose, plasser suturene på en lignende måte som proksimal anastomose, og re-omtrentlig pode posisjon og stropp muskler. Deretter lukker snittet med 9-0 sterile nylon suturer i et løpemønster, og plasser dyret alene i et gjenopprettingsbur plassert på en varmepute med overvåking til full gjenoppretting. To uker etter implantasjon kan noen basale epitelceller observeres ved basalcelle keratin fem og 14 farging i vevskonstruerte trakealtransplantatvevsseksjoner.Basalceller oppdages også på lysarmoverflaten av transplantatet syv dager etter implantasjon. Ved eksplantering og histologisk analyse har graftstenose blitt identifisert som den viktigste medvirkende faktoren i transplantat implanterte mus som viser tegn på respiratorisk nød og stridor. Legg merke til at teleskop av transplantatet og innfødt luftrør er et vanlig funn som følge av kirurgisk teknikk.Farging for F4/80 avslører vertsmakrofager innenfor det stenotiske området av transplantatet i forbindelse med tilstedeværelsen av basal epitelcellene. Unngå manipulering av de tilbakevendende laryngealnervene, og sørg for at de proksimale og distale suturene er på plass for å tillate en lufttett forsegling ved anastomosen. Da denne protokollen omhandler benmargsmononukleære celler avledet fra biosikkerhetsnivå en agentmus, er det viktig å bruke passende personlig verneutstyr for å unngå forurensning.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Autologous Endothelial Progenitor Cell-Seeding Technology and Biocompatibility Testing For Cardiovascular Devices in Large Animal Model

Implantable cardiovascular devices are manufactured from artificial materials (e.g. titanium (Ti), expanded polytetrafluoroethylene), which pose the risk ...

Protocol for Relative Hydrodynamic Assessment of Tri-leaflet Polymer Valves

Protokoll for Relativ Hydrodynamisk Vurdering av Tri-brosjyre Polymer Ventiler

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of ...

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

Kirurgisk teknikk for Implantasjon av Tissue Engineered vaskulære implantater og Følgende<em&gt; I Vivo</em&gt; Overvåking

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large ...

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

Generasjon og Negl Tissue-konstruert Fartøy i en musemodell

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Produksjon, karakterisering og potensielle bruk av en 3D Tissue-konstruert Menneskelig Esophageal slimhinnene Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

En Kombinert 3D Tissue Konstruert<em&gt; In Vitro</em&gt; /<em&gt; I Silico</em&gt; Lung Tumor modell for å forutsi Drug Effective i Spesifikke mutasjons bakgrunner

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

anvendelser av<em&gt; I Vivo</em&gt; Functional Testing av Rat tibialis anterior for Vurderer Tissue Konstruert Skeletal Muscle Reparasjon

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Tredimensjonale vev utvikling justert astrocytter nettverk å Recapitulate utviklingsmessige mekanismer og tilrettelegge nervesystemet gjenfødelse

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Fabrikasjon av egendefinerte Agarose for celle såing og vev Ring selvstendig montering med 3D-trykt muggsopp

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...