Name: seeding and implantation of a biosynthetic tissue-engineered tracheal graft in a mouse model
Uploaded: 2019-04-01T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Seeding and Implantation of a Biosynthetic Tissue-engineered Tracheal Graft in a Mouse Model at JoVE.com

Nós gostaríamos de reconhecer Robert Strouse e a pesquisa de soluções de informações & Divisão de inovações no Hospital de crianças em todo o país por seu apoio em design gráfico. Este trabalho foi apoiado por uma concessão do NIH (NHLBI K08HL138460).

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) no Hospital de crianças em todo o país e institucional Cuidado Animal.
1. fabricação de andaime
<ol><li>Preparar uma solução de precursor de nanofibras de polímero por: 1) dissolução 8 wt % PET em 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol e aquecimento a 60 ° C e a solução dissolvendo 2) 3 wt % PU em 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol à temperatura ambiente.</li>
	<li>Uma vez arrefecido, combine as soluções pa...

<ol>
	<li>Macchiarini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+transplantation+of+a+tissue-engineered+airway.">Clinical transplantation of a tissue-engineered airway.</a> The Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).</li><li>Jungebluth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracheobronchial+transplantation+with+a+stem-cell-seeded+bioartificial+nanocomposite:+A+proof-of-concept+study.">Tracheobronchial transplantation with a stem-cell-seeded bioartificial nanocomposite: A proof-of-concept study.</a> The Lancet. 378 (9808), 1997-2004 (2011).</li><li>Elliott, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-cell-based,+tissue+engineered+tracheal+replacement+in+a+child:+A+2-year+follow-up+study.">Stem-cell-based, tissue engineered tracheal replacement in a child: A 2-year follow-up study.</a> The Lancet. 380 (9846), 994-1000 (2012).</li><li>Chiang, T., Pepper, V., Best, C., Onwuka, E., Breuer, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Translation+of+Tissue+Engineered+Trachea+Grafts.">Clinical Translation of Tissue Engineered Trachea Grafts.</a> Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 125 (11), 873-885 (2016).</li><li>Clark, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cell+seeding+on+neotissue+formation+in+a+tissue+engineered+trachea.">Effect of cell seeding on neotissue formation in a tissue engineered trachea.</a> Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 49-55 (2016).</li><li>Cole, B. B., Smith, R. W., Jenkins, K. M., Graham, B. B., Reynolds, P. R., Reynolds, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracheal+basal+cells:+A+facultative+progenitor+cell+pool.">Tracheal basal cells: A facultative progenitor cell pool.</a> American Journal of Pathology. 177 (1), 362-376 (2010).</li><li>Onwuka, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+myeloid+cell-derived+PDGF-B+in+neotissue+formation+in+a+tissue-engineered+vascular+graft.">The role of myeloid cell-derived PDGF-B in neotissue formation in a tissue-engineered vascular graft.</a> Regenerative Medicine. 12 (3), 249-261 (2017).</li><li>Grimmer, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracheal+reconstruction+using+tissue-engineered+cartilage.">Tracheal reconstruction using tissue-engineered cartilage.</a> Archives of Otolaryngology - Head and Neck Surgery. 130 (10), 1191-1196 (2004).</li><li>Wood, M. W., Murphy, S. V., Feng, X., Wright, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracheal+reconstruction+in+a+canine+model.">Tracheal reconstruction in a canine model.</a> Otolaryngology - Head and Neck Surgery (United States). 150 (3), 428-433 (2014).</li><li>Haag, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+and+angiogenic+properties+of+tissue-engineered+rat+trachea+using+genipin+cross-linked+decellularized+tissue.">Biomechanical and angiogenic properties of tissue-engineered rat trachea using genipin cross-linked decellularized tissue.</a> Biomaterials. 33 (3), 780-789 (2012).</li><li>Best, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+a+tissue-engineered+tracheal+scaffold+for+preclinical+evaluation.">Designing a tissue-engineered tracheal scaffold for preclinical evaluation.</a> International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology. 104, 155-160 (2018).</li></ol>

Desenvolvimento de um modelo de mouse para tracheas de engenharia de tecidos é essencial para compreender os fatores que têm limitado a tradução clínica dos TETGs; ou seja, colapso de enxerto, estenose e epitelização atrasada4. Alguns fatores que contribuem para estas limitações incluem a seleção do material de enxerto, processo de fabricação, projeto de andaime e célula semeadura protocolos. Este modelo permite a avaliação mais rápida desses fatores para compreender os mecanismos...

Defeitos de longo-segmento traqueais podem apresentar como condições congênitas raras como anéis traqueais completas e agenesia traqueal, bem como trauma, malignidade e infecção. Quando superior a 6 cm em adultos ou 30% do comprimento traqueal em crianças, esses defeitos não podem ser tratados pela reconstrução cirúrgica. Tentativas de substituir as vias aéreas com tecidos autólogos, transplantes cadavéricos e construções artificiais tem sido atormentadas por infecção crônica, granulação, falha mecânica e estenose.
Engenharia de tecidos traqueais enxertos (TETGs) potencialmente podem resolver esses problemas, evitando a necessidade de imunossupressão para toda a vida. Na última década, TETGs foram testados em modelos animais e utilizados clinicamente em raros casos de uso compassivo1,2,3. Em estudos clínicos e grandes com animais, recuperação pós-operatória da engenharia de tecidos das vias respiratórias substituição necessárias numerosas intervenções de combate estenose (definida como > 50% de estreitamento luminal) e manter a patência das vias aéreas. Trabalho adicional TETG tem procurado reduzir esta estenose através de avaliar o papel da célula semeadura escolha, vascularização e design de andaime. Escolhas de semeadura de célula e design de andaime vista restaurar a traqueia nativo estrutura/função tem sido focados principalmente em células epiteliais respiratórias e condrócitos semeados em vários andaimes reabsorvíveis, não-absorvíveis e decellularized. Como vascularização provavelmente desempenha um papel importante no desenvolvimento da estenose, outros grupos têm-se centrado na otimização em vitro ou heterotópico modelos para agilizar a revascularização ou neoangiogênese4. No entanto, alcançar sucesso vascularização, mantendo também um mecânico competente e funcional TETG permanece um desafio. Apesar dos avanços recentes, minimizando a estenose permanece um obstáculo crítico-tradução clínica.
Para investigar esta resposta histopatológica TETG implantação na vivo, desenvolvemos um modelo de ovino de substituição traqueal de engenharia de tecidos. O enxerto era composto por um misto de polietileno tereftalato (PET) e andaime de electrospun do poliuretano (PU) inoculado com células mononucleares da medula óssea-derivado (BM-PTM). Nesta pequena coorte, demonstrámos que semeado autólogas BM-MNCs aceleraram a re-epitelização e atrasou a estenose5. Embora a semeadura com autólogo BM-MNCs melhoradas de sobrevivência, o mecanismo celular pelo qual BM-MNCs modulam a formação de neotissue funcional permanece obscuro.
Investigação sobre o desenvolvimento necessário nível celular de um modelo murino de tecido projetado substituição traqueal. Semelhante ao estudo de ovinos, utilizamos um andaime de electrospun PET:PU semeado com BM-MNCs. consistente com o modelo de ovino, estenose TETG desenvolvido ao longo das duas primeiras semanas após a implantação1,2,3 ,5. Isto sugere que o modelo murino recapitulada a patologia observada anteriormente, permitindo-nos ainda mais, interrogar os mecanismos celulares subjacentes estenose das vias aéreas.
Neste relatório, detalhamos nosso protocolo para engenharia de tecidos traqueal substituição no modelo do rato, incluindo a fabricação de andaime, isolamento BM-MNC, enxerto de semeadura e implantação (Figura 1, Figura 2).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:827px;" width="827">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">0.9% Sodium chloride injection</td>
			<td style="width:119px;">APP Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:119px;">NDC 63323-186-10</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">10cc serological pipet</td>
			<td style="width:119px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">357551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">18G 1.5in. Needle</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">305190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">1mL Syringe</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">24-well plate</td>
			<td style="width:119px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">25cc serological pipet</td>
			<td style="width:119px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">356535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">25G 1in. Needle</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">305125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">50cc tube</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">Alcohol prep pads</td>
			<td style="width:119px;">Fisher Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">NDC 69250-661-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">Baytril (enrofloxacin) solution</td>
			<td style="width:119px;">Bayer Healthcare, LLC</td>
			<td style="width:119px;">NDC 0859-2267-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:423px;">Black polyamide monofilament suture, 9-0</td>
			<td style="width:119px;">AROSurgical Instruments Corporation</td>
			<td style="width:119px;">T05A09N10-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">C57BL/6, female</td>
			<td style="width:119px;">Jackson laboratories</td>
			<td style="width:119px;">664</td>
			<td style="width:167px;">6-8 weeks old</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Citrate Buffer pH 6.0 20x concentrate</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Colibri retractors</td>
			<td style="width:119px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">17000-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Cotton tipped applicators</td>
			<td style="width:119px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">23-400-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Cytokeratin 14 Monoclonal Antibody</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">MA5-11599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td style="width:119px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Dumont #5/45 forceps</td>
			<td style="width:119px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Dumont #7 - Fine Forceps</td>
			<td style="width:119px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">11274-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">F4/80 Rat anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:119px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">MCA497R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Ficoll</td>
			<td style="width:119px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">10831-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Fine scissors- Sharp-blunt</td>
			<td style="width:119px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">14028-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Fisherbrand Premium Cover Glasses</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">12-548-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Fluoroshield Mounting Media with DAPI</td>
			<td style="width:119px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab104139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Goat-anti mouse IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Goat-anti Rabbit IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">A-11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Goat-anti Rat IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 647</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">A-21247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">Ibuprofen</td>
			<td style="width:119px;">Precision Dose, Inc</td>
			<td style="width:119px;">NDC 68094-494-59</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:423px;">Iodine prep pads</td>
			<td style="width:119px;">Professional disposables international, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">NDC 10819-3883-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Keratin 5 Polyclonal Antibody, Purified</td>
			<td style="width:119px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">905501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Ketamine hydrochloride injection</td>
			<td style="width:119px;">Hospira Inc.</td>
			<td style="width:119px;">NDC 0409-2053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Micro-Adson forceps</td>
			<td style="width:119px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">11018-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Microscope</td>
			<td style="width:119px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">M80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Non-woven sponges</td>
			<td style="width:119px;">Covidien</td>
			<td style="width:119px;">441401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:423px;">Opthalmic ointment</td>
			<td style="width:119px;">Dechra Veterinary products</td>
			<td style="width:119px;">NDC 17033-211-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">PBS</td>
			<td style="width:119px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">PET/PU (Polyethylene terephthalate &#38; Polyurethane) scaffolds</td>
			<td style="width:119px;">Nanofiber solutions</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom ordered</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Petri dish</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">RPMI 1640 Medium</td>
			<td style="width:119px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">TISH Needle Holder/Forceps</td>
			<td style="width:119px;">Micrins</td>
			<td style="width:119px;">MI1540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Trimmer</td>
			<td style="width:119px;">Wahl</td>
			<td style="width:119px;">9854-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vannas-T&#252;bingen Spring Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15008-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Warm water recirculator</td>
			<td style="width:119px;">Gaymar</td>
			<td style="width:119px;">TP-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">Xylazine sterile solution</td>
			<td style="width:119px;">Akorn animal health</td>
			<td style="width:119px;">NDC 59399-110-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

seeding and implantation of a biosynthetic tissue-engineered tracheal graft in a mouse model

Opções de tratamento para defeitos traqueais de segmento longo congênita ou secundária têm sido historicamente limitadas devido a uma incapacidade para substituir o tecido funcional. Engenharia de tecidos é uma grande promessa como uma solução em potencial com a sua capacidade de integrar células e moléculas sinalizadoras em um andaime de 3-dimensional. Trabalho recente com enxertos traqueal de engenharia de tecidos (TETGs) tem visto algum sucesso, mas sua tradução tem sido limitada pela estenose do enxerto, colapso do enxerto e atrasou a epitelização. A fim de investigar os mecanismos de condução destas questões, nós desenvolvemos um modelo do rato para implante de prótese traqueal de engenharia de tecidos. TETGs foram construídos usando electrospun polímeros polietileno tereftalato (PET) e poliuretano (PU) em uma mistura de PET e PU (20:80 peso por cento). Andaimes foram semeadas em seguida usando células mononucleares de medula óssea isoladas da semana de 6-8-velhos camundongos C57BL/6 por centrifugação gradiente. 10 milhões de células por enxerto foram semeados para o lúmen do cadafalso e permitidos para incubar durante a noite antes da implantação entre os terceiros e sétimo traqueais anéis. Estes enxertos foram capazes de recapitular os achados de estenose e atrasado epitelização como demonstrado pela análise histológica e a falta de células epiteliais basais 5 de queratina e queratina 14 na imunofluorescência. Este modelo vai servir como uma ferramenta para a investigação de mecanismos celulares e moleculares envolvidos na remodelação de anfitrião.

A Figura 1 ilustra um esquema de TETG semeadura e implantação. Medula óssea de camundongos C57BL/6 foi colhida e cultivadas em vitro. BM-MNCs foram isoladas por centrifugação densidade e propagadas para o TETG. TETGs semeados foram implantados em um rato de destinatário C57BL/6 syngeneic.
A Figura 2 é uma visão geral sobre o andaime TETG PET:PU processo...

Watch this Scientific Journal Video about Seeding and Implantation of a Biosynthetic Tissue-engineered Tracheal Graft in a Mouse Model at JoVE.com

Seeding and Implantation of a Biosynthetic Tissue-engineered Tracheal Graft in a Mouse Model

Estenose de enxerto representa um obstáculo crítico em substituição de engenharia de tecidos das vias respiratórias. Para investigar os mecanismos celulares subjacentes estenose, utilizamos um modelo murino de substituição traqueal de engenharia de tecidos com células mononucleares de medula semeado (BM-MNC). Aqui, nós detalhe nosso protocolo, incluindo a fabricação de andaime, BM-MNC isolamento, enxerto semeadura e implantação.

A propagação e a implantação de um enxerto traqueal biossintética engenharia de tecido em um modelo do rato

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional ...

As aplicações clínicas da traqueia projetada por tecidos foram limitadas devido à estenose do enxerto e à epitelialização retardada. Um modelo de rato de substituição traqueal ortotópica permite o estudo dos mecanismos celulares que conduzem a regeneração. Defeitos de longo segmento das vias aéreas podem exceder o que as terapias atuais são capazes de curar.A traqueia de tecido oferece o potencial de criar um órgão de substituição para essas condições. Este modelo pode ser aplicado a animais com propriedades transgênicas e de rastreamento de linhagem. Podemos então modular os fatores hospedeiros que contribuem para a regeneração do enxerto.Um dos principais desafios na produção dos andaimes será medir e determinar que os parâmetros de eletropinning são os mesmos de cada vez. Assim, toda vez que você produz um andaime, você precisa medir a distância de ponta a coletor, a umidade e a temperatura para garantir que os andaimes sejam os mesmos de cada vez. Fundamental para o sucesso deste modelo é o refinamento das técnicas microcirúrgicas e a manutenção do plano correto da anestesia para permitir ventilação espontânea durante todo o procedimento.Uma vez que a traqueia hospedeira tem um diâmetro interno de cerca de um milímetro, o manuseio de enxerto e tecido nativo e a colocação da sutura são importantes e melhor demonstrados visualmente. Comece dissolvendo oito por cento de peso de tereftalato de polietileno, ou PET, em hexafluoroisopropanol e aquecendo a solução resultante a 60 graus Celsius. Enquanto a solução está sendo aquecida, dissolva três por cento de poliuretano, ou PU, em hexafluoroisopropanol, combinando as soluções uma vez que a solução PET tenha esfriado.Carregue uma seringa de 60 mililitros equipada com uma agulha de ponta cega de 20 calibres com a mistura de polímero. Use a seringa e uma fonte de alimentação DC de alta tensão definida para 14 kilovolts positivos na agulha, outra fonte de alimentação DC de alta tensão definida para menos três quilovolts, uma taxa de fluxo de cinco milímetros por hora, e uma distância de ponta a substrato de 20 centímetros para eletrospintar o polímero em uma haste de aço inoxidável de um milímetro de diâmetro sendo girada a 350 rotações por minuto. Continue eletropinning até que uma espessura da parede do andaime de 300 micrômetros seja alcançada.Em seguida, deslize o andaime da haste, coloque o andaime sob vácuo durante a noite para remover qualquer solvente residual e esterilize o andaime com uma dosagem de luz ultravioleta de 350 milímetros por centímetro quadrado por cerca de 15 minutos. Sob condições estéreis, remova a pele dos membros traseiros de um rato de seis a oito semanas de idade, fêmea, C57-Black/6 com tesoura fina e fórceps micro-Adson, e use dumont número cinco fórceps e pedóps dumont número 5/45 para remover a fáscia e os tendões. Separe os ossos para permitir que cada um deles seja cortado em ambas as extremidades, e use uma seringa de cinco mililitros equipada com uma agulha de calibre 25 para lavar a medula óssea em uma placa de Petri contendo 30 mililitros de meio RPMI.Quando todos os ossos tiverem sido lavados, filtre a medula óssea através de um coador de células de nylon de 70 micrômetros em um tubo cônico de 50 mililitros, e transfira o tubo para um armário de biossegurança. Adicione suavemente a solução de célula mononuclear filtrada ao lado de um tubo de 15 mililitros contendo cinco mililitros de polisucrose e diatrizoato de sódio sem misturar as camadas, e separe o plasma das células brancas e vermelhas do sangue por separação gradiente de densidade. No final da centrifugação, colete a camada limpa média composta pelas células mononucleares da medula óssea e lave as células mononucleares da medula óssea em uma proporção de um para um na PBS por centrifugação.Resuspend a pelota em cinco mililitros de PBS para uma segunda lavagem, seguido de resuspensão em 10 mililitros de meio RPMI fresco para contagem. Em seguida, colete as células com uma centrifugação adicional, e dilua as células para uma vezes 10 para as sete células por cinco microliters de concentração de RPMI fresco. Antes de semear o andaime, corte o polímero para um comprimento de cinco milímetros, conforme necessário, e molhe o andaime com cinco microliters de meio RPMI por cinco minutos.Ao final da incubação, remova o meio em excesso e carregue o lúmen do andaime com cinco microliters da solução de célula mononuclear de medula óssea por 10 minutos. Em seguida, insira uma agulha de calibre 21 através do lúmen do andaime, e coloque o enxerto em um mililitro de meio RPMI durante a noite em uma incubadora Celsius de 37 graus. Após a indução da anestesia geral, confirme a falta de resposta ao beliscão do dedo do dedo no animal receptor, e aplique pomada aos olhos do animal.Corte o cabelo no local cirúrgico do queixo às clavículas, e coloque o animal em uma almofada cirúrgica em uma posição dorsal reclinável. Usando técnica asséptica, desinfete o local cirúrgico com um povidone-iodo sequencial, 70% etanol, série de limpeza de povidona-iodo, e mova o rato sob um microscópio dissecando com a cabeça às 12 horas. Use tesouras finas e fórceps micro-Adson para fazer uma incisão midline das clavículas para o osso hioide, e use dumont número cinco e número sete fórceps finos e um cotonete de algodão estéril para limpar a fáscia antes de inserir um retrátil colibri auto-retentor na incisão.Use os fórceps para abrir os músculos da correia para expor a cartilagem tireoide, cartilagem cricoide e traqueia, e separar sem rodeios a traqueia dos nervos laríngeos recorrentes que correm paralelamente em ambos os lados do tecido, seguidos pela separação circunferencial da traqueia do esôfago. Usando uma agulha de calibre 20 e marcador cirúrgico, colora a porção anterior da traqueia. Faça uma incisão abaixo do terceiro anel de cartilagem traqueal usando um par de tesouras de mola Vannas-Tubingen e um par de fórceps finos Dumont número sete para ressecar uma seção de três anéis de traqueia.Segurando a traqueia com as fórceps curvas finas, use uma sutura estéril de nylon 9-0 para fixar a extremidade distal da traqueia ao esterno para criar uma traqueostomia temporária, e use a agulha de calibre 20 e marcador cirúrgico para manchar a porção anterior do enxerto. Para implantar o enxerto, utilize uma sutura de nylon 9-0 estéril, Dumont número sete fórceps finos, e um suporte de agulha para inserir os pontos proximal-posterior, proximal-lateral e proximal-anterior, e girar o animal 180 graus. Quando o rato estiver em posição, solte a traqueostomia temporária e faça uma incisão lateral a cinco milímetros da porção anterior do enxerto para facilitar a anastomose distal.Para completar a anastomose distal, coloque as suturas de forma semelhante à anastomose proximal, e se aproxime da posição do enxerto e dos músculos da correia. Em seguida, feche a incisão com suturas de nylon estéreis 9-0 em um padrão de corrida, e coloque o animal sozinho em uma gaiola de recuperação colocada em uma almofada de aquecimento com monitoramento até a recuperação completa. Duas semanas após a implantação, algumas células epiteliais basais podem ser observadas por queratina de células basais cinco e 14 manchas em seções de tecido de tecido projetados para enxerto traqueal.Células basais também são detectadas na superfície luminal do enxerto aos sete dias após a implantação. Após a explantação e análise histológica, a estenose do enxerto tem sido identificada como o principal fator contribuinte em camundongos implantados com enxerto demonstrando sinais de dificuldade respiratória e estridor. Note-se que o telescoping do enxerto e da traqueia nativa é um achado comum como resultado da técnica cirúrgica.A coloração para F4/80 revela macrófagos hospedeiros dentro da região estenórica do enxerto em conjunto com a presença das células epiteliais basais. Evite a manipulação dos nervos laríngeos recorrentes e certifique-se de que as suturas proximais e distais estejam no lugar para permitir uma vedação hermética na anastomose. Como este protocolo trata de células mononucleares de medula óssea derivadas de camundongos de agente de nível um de biossegurança, é importante usar equipamentos de proteção individual adequados para evitar contaminação.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Criando Two-Dimensional Substratos modelado para Confinamento de proteína e celular

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Bioengenharia

Autologous Endothelial Progenitor Cell-Seeding Technology and Biocompatibility Testing For Cardiovascular Devices in Large Animal Model

Autólogas progenitoras endoteliais Cell Technology Semear e Teste de biocompatibilidade para dispositivos Cardiovascular em Modelo Animal Grande

Implantable cardiovascular devices are manufactured from artificial materials (e.g. titanium (Ti), expanded polytetrafluoroethylene), which pose the risk ...

Protocol for Relative Hydrodynamic Assessment of Tri-leaflet Polymer Valves

Protocolo Relativo Avaliação hidrodinâmica de Tri-folheto polímero Válvulas

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of ...

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

Técnica Cirúrgica para a Implantação de engenharia de tecidos enxertos vasculares e Subsequente<em&gt; In Vivo</em&gt; Monitoring

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large ...

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

Geração e Alongamento das embarcações da engenharia de tecidos em um modelo de rato

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Produção, Caracterização e usos potenciais de uma mucosa esofágica Modelo 3D Human Tissue-engenharia

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

A Tissue Combinada 3D Engineered<em&gt; In Vitro</em&gt; /<em&gt; In Silico</em&gt; Modelo de tumor de pulmão para prever a eficácia da droga em fundos específicos de mutação

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

aplicações de<em&gt; In Vivo</em&gt; Teste Funcional do Rato tibial anterior para a Avaliação da engenharia de tecidos Repair Músculo Esquelético

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Engenharia de Tecido Tridimensional de Redes de Astrócitos Alinhadas para Recapitular Mecanismos de Desenvolvimento e Facilitar a Regeneração do Sistema Nervoso

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Fabricação de poços de Agarose personalizado para a propagação de células e tecido anel Self-assembly usando moldes 3D-impresso

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...