Name: seeding and implantation of a biosynthetic tissue-engineered tracheal graft in a mouse model
Uploaded: 2019-04-01T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Seeding and Implantation of a Biosynthetic Tissue-engineered Tracheal Graft in a Mouse Model at JoVE.com

Vi skulle vilja erkänna Robert Strouse och forskning informationslösningar & innovationer division på rikstäckande barnsjukhus för deras stöd i grafisk design. Detta arbete stöds av ett bidrag från NIH (NHLBI K08HL138460).

Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) på rikstäckande Barnsjukhus.
1. byggnadsställning tillverkning
<ol><li>Bered en polymer nanofiber föregångare av: 1) upplösning 8 wt % PET i 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol och värme lösningen till 60 ° C och 2) upplösning 3 wt % PU i 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol vid rumstemperatur.</li>
	<li>När svalnat, kombinera lösningarna för att skapa en slutliga polym...

<ol>
	<li>Macchiarini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+transplantation+of+a+tissue-engineered+airway.">Clinical transplantation of a tissue-engineered airway.</a> The Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).</li><li>Jungebluth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracheobronchial+transplantation+with+a+stem-cell-seeded+bioartificial+nanocomposite:+A+proof-of-concept+study.">Tracheobronchial transplantation with a stem-cell-seeded bioartificial nanocomposite: A proof-of-concept study.</a> The Lancet. 378 (9808), 1997-2004 (2011).</li><li>Elliott, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-cell-based,+tissue+engineered+tracheal+replacement+in+a+child:+A+2-year+follow-up+study.">Stem-cell-based, tissue engineered tracheal replacement in a child: A 2-year follow-up study.</a> The Lancet. 380 (9846), 994-1000 (2012).</li><li>Chiang, T., Pepper, V., Best, C., Onwuka, E., Breuer, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Translation+of+Tissue+Engineered+Trachea+Grafts.">Clinical Translation of Tissue Engineered Trachea Grafts.</a> Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 125 (11), 873-885 (2016).</li><li>Clark, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cell+seeding+on+neotissue+formation+in+a+tissue+engineered+trachea.">Effect of cell seeding on neotissue formation in a tissue engineered trachea.</a> Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 49-55 (2016).</li><li>Cole, B. B., Smith, R. W., Jenkins, K. M., Graham, B. B., Reynolds, P. R., Reynolds, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracheal+basal+cells:+A+facultative+progenitor+cell+pool.">Tracheal basal cells: A facultative progenitor cell pool.</a> American Journal of Pathology. 177 (1), 362-376 (2010).</li><li>Onwuka, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+myeloid+cell-derived+PDGF-B+in+neotissue+formation+in+a+tissue-engineered+vascular+graft.">The role of myeloid cell-derived PDGF-B in neotissue formation in a tissue-engineered vascular graft.</a> Regenerative Medicine. 12 (3), 249-261 (2017).</li><li>Grimmer, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracheal+reconstruction+using+tissue-engineered+cartilage.">Tracheal reconstruction using tissue-engineered cartilage.</a> Archives of Otolaryngology - Head and Neck Surgery. 130 (10), 1191-1196 (2004).</li><li>Wood, M. W., Murphy, S. V., Feng, X., Wright, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracheal+reconstruction+in+a+canine+model.">Tracheal reconstruction in a canine model.</a> Otolaryngology - Head and Neck Surgery (United States). 150 (3), 428-433 (2014).</li><li>Haag, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+and+angiogenic+properties+of+tissue-engineered+rat+trachea+using+genipin+cross-linked+decellularized+tissue.">Biomechanical and angiogenic properties of tissue-engineered rat trachea using genipin cross-linked decellularized tissue.</a> Biomaterials. 33 (3), 780-789 (2012).</li><li>Best, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+a+tissue-engineered+tracheal+scaffold+for+preclinical+evaluation.">Designing a tissue-engineered tracheal scaffold for preclinical evaluation.</a> International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology. 104, 155-160 (2018).</li></ol>

Utveckling av en musmodell för vävnadstekniska tracheas är grundläggande för att förstå de faktorer som har begränsad klinisk översättning av TETGs; nämligen transplantat kollaps, stenos och fördröjd epithelialization4. Några faktorer som bidrar till dessa begränsningar inkluderar urval av transplantat material, tillverkningsprocessen, scaffold design och cell sådd protokoll. Denna modell tillåter snabbare utvärdering av dessa faktorer för att förstå de cellulära och molekyl?...

Lång-segmentet luftrör defekter kan presentera sällsynta medfödda förutsättningar såsom fullständig trakeal ringar och luftrör agenesi, liksom trauma, malignitet och infektion. När mer än 6 cm hos vuxna eller 30% av luftrör längd hos barn, kan inte dessa brister behandlas med kirurgisk rekonstruktion. Försök att ersätta luftvägarna med autolog vävnad, avlidna transplantationer och artificiella konstruktioner har plågats av kronisk infektion, granulering, mekaniska fel och stenos.
Vävnadstekniska luftrör transplantat (TETGs) kan potentiellt adressera dessa problem samtidigt undvika behovet av livslångt immunsuppression. Under det senaste decenniet, har TETGs testats i djurmodeller och utnyttjas kliniskt i sällsynta fall av s.k. compassionate use1,2,3. I både kliniska och stora djurstudier, postoperativ återhämtning från vävnadstekniska luftvägarna ersättning krävs många interventioner för att bekämpa stenos (definierad som > 50% luminala förträngning) och underhålla luftvägarna patency. Ytterligare TETG arbete har försökt minska detta stenos genom utvärdera roll cell sådd val, vaskularisering och scaffold design. Cell sådd val och scaffold design syftar till att återställa infödda luftstrupen struktur och funktion har främst varit inriktad på andningsorganen epitelceller och kondrocyter dirigeras till olika resorberbara, icke-resorberbara och cell-lösa ställningar. Som vaskularisering sannolikt spelar en viktig roll i utvecklingen av stenos, har andra grupper fokuserat på optimera i vitro eller heterotopic modeller att påskynda revaskularisering eller neoangiogenesis4. Trots fortfarande att uppnå framgångsrika vaskularisering samtidigt som du också har en mekaniskt behöriga och funktionella TETG en utmaning. Trots senaste framsteg förblir minimera stenos ett avgörande hinder för kliniska översättning.
För att undersöka detta histopatologiska svar på TETG implantation i vivo, utvecklat vi en får modell av vävnadstekniska luftrör ersättare. Graften bestod av en blandad av polyetentereftalat (PET) och polyuretan (PU) electrospun byggnadsställning seedade med benmärg-derived mononukleära celler (BM-multinationella företag). I denna lilla kohort visat vi att seedade autolog BM-multinationella accelererade återepitelisation och fördröjd stenos5. Även om sådd med autolog BM-multinationella företag förbättrad överlevnad, oklar den cellulära mekanism som BM-multinationella modulera bildandet av funktionella neotissue.
Utredning på cellulär nivå krävs utveckling av en murin modell av vävnad konstruerad luftrör ersättare. Liknar får studien, utnyttjade vi en PET:PU electrospun byggnadsställning ympats med BM-multinationella företag. överensstämmelse med får modellen, TETG stenos utvecklats under loppet av de första två veckorna efter implantation1,2,3 ,5. Detta föreslog att murina modellen återgetts patologin observerats tidigare, gör det möjligt för oss att ytterligare förhöra de cellulära mekanismerna bakom luftvägarna stenos.
I detta betänkande detalj vi våra protokoll för vävnadstekniska luftrör ersättare i musmodell inklusive byggnadsställning tillverkning, BM-MNC isolering, graften sådd och implantation (figur 1, figur 2).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:827px;" width="827">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">0.9% Sodium chloride injection</td>
			<td style="width:119px;">APP Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:119px;">NDC 63323-186-10</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">10cc serological pipet</td>
			<td style="width:119px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">357551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">18G 1.5in. Needle</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">305190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">1mL Syringe</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">24-well plate</td>
			<td style="width:119px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">25cc serological pipet</td>
			<td style="width:119px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">356535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">25G 1in. Needle</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">305125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">50cc tube</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">Alcohol prep pads</td>
			<td style="width:119px;">Fisher Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">NDC 69250-661-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">Baytril (enrofloxacin) solution</td>
			<td style="width:119px;">Bayer Healthcare, LLC</td>
			<td style="width:119px;">NDC 0859-2267-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:423px;">Black polyamide monofilament suture, 9-0</td>
			<td style="width:119px;">AROSurgical Instruments Corporation</td>
			<td style="width:119px;">T05A09N10-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">C57BL/6, female</td>
			<td style="width:119px;">Jackson laboratories</td>
			<td style="width:119px;">664</td>
			<td style="width:167px;">6-8 weeks old</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Citrate Buffer pH 6.0 20x concentrate</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Colibri retractors</td>
			<td style="width:119px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">17000-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Cotton tipped applicators</td>
			<td style="width:119px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">23-400-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Cytokeratin 14 Monoclonal Antibody</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">MA5-11599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td style="width:119px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Dumont #5/45 forceps</td>
			<td style="width:119px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Dumont #7 - Fine Forceps</td>
			<td style="width:119px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">11274-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">F4/80 Rat anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:119px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">MCA497R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Ficoll</td>
			<td style="width:119px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">10831-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Fine scissors- Sharp-blunt</td>
			<td style="width:119px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">14028-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Fisherbrand Premium Cover Glasses</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">12-548-5M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Fluoroshield Mounting Media with DAPI</td>
			<td style="width:119px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab104139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Goat-anti mouse IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Goat-anti Rabbit IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 594</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">A-11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Goat-anti Rat IgG Secondary Antibody Alexa Fluor 647</td>
			<td style="width:119px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">A-21247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">Ibuprofen</td>
			<td style="width:119px;">Precision Dose, Inc</td>
			<td style="width:119px;">NDC 68094-494-59</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:423px;">Iodine prep pads</td>
			<td style="width:119px;">Professional disposables international, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">NDC 10819-3883-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Keratin 5 Polyclonal Antibody, Purified</td>
			<td style="width:119px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">905501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Ketamine hydrochloride injection</td>
			<td style="width:119px;">Hospira Inc.</td>
			<td style="width:119px;">NDC 0409-2053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Micro-Adson forceps</td>
			<td style="width:119px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">11018-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Microscope</td>
			<td style="width:119px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">M80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Non-woven sponges</td>
			<td style="width:119px;">Covidien</td>
			<td style="width:119px;">441401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:423px;">Opthalmic ointment</td>
			<td style="width:119px;">Dechra Veterinary products</td>
			<td style="width:119px;">NDC 17033-211-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">PBS</td>
			<td style="width:119px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">PET/PU (Polyethylene terephthalate &#38; Polyurethane) scaffolds</td>
			<td style="width:119px;">Nanofiber solutions</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom ordered</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Petri dish</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">RPMI 1640 Medium</td>
			<td style="width:119px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">TISH Needle Holder/Forceps</td>
			<td style="width:119px;">Micrins</td>
			<td style="width:119px;">MI1540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Trimmer</td>
			<td style="width:119px;">Wahl</td>
			<td style="width:119px;">9854-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vannas-T&#252;bingen Spring Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15008-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:423px;">Warm water recirculator</td>
			<td style="width:119px;">Gaymar</td>
			<td style="width:119px;">TP-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:423px;">Xylazine sterile solution</td>
			<td style="width:119px;">Akorn animal health</td>
			<td style="width:119px;">NDC 59399-110-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

seeding and implantation of a biosynthetic tissue-engineered tracheal graft in a mouse model

Behandlingsalternativ för medfödd eller sekundära långa segment luftrör defekter har historiskt sett varit begränsad på grund av en oförmåga att ersätta funktionell vävnad. Vävnadsteknik rymmer mycket lovande som en möjlig lösning med dess förmåga att integrera celler och signalmolekyler i en 3-dimensionell byggnadsställning. Senaste arbete med vävnadstekniska luftrör transplantat (TETGs) har sett viss framgång men deras översättning har begränsats av transplantat stenos, transplantat kollaps och försenad epithelialization. För att undersöka de mekanismer som driver dessa frågor, har vi utvecklat en musmodell för vävnadstekniska luftrör transplantat implantation. TETGs konstruerades med electrospun polymerer av polyetentereftalat (PET) och polyuretan (PU) i en blandning av PET och PU (20:80 procent vikt). Byggnadsställningar seedade sedan använda benmärg mononukleära celler isolerade från 6-8 vecka-gamla C57BL/6 möss genom lutning centrifugering. Tio miljoner celler per transplantat var seedade på lumen av ställningen och tillåtet att Inkubera över natten innan implantation mellan de tredje och sjunde trakeal ringarna. Dessa transplantat skulle kunna sammanfatta resultaten av stenos och försenad epithelialization framgår av histologisk analys och brist på Keratin 5 och Keratin 14 basala epitelceller på immunofluorescens. Denna modell kommer att fungera som ett verktyg för att undersöka cellulära och molekylära mekanismer som är involverade i mottagande remodeling.

Figur 1 visar en Schematisk bild av TETG sådd och implantation. Benmärgen skördades från C57BL/6 möss och odlade i vitro. BM-multinationella företag var isolerade med densitet centrifugering och seedade på TETG. Seedade TETGs var implanteras i en syngena C57BL/6 mottagare mus.
Figur 2 finns en översikt över PET:PU TETG ställningen tillverkningsprocess...

Watch this Scientific Journal Video about Seeding and Implantation of a Biosynthetic Tissue-engineered Tracheal Graft in a Mouse Model at JoVE.com

Seeding and Implantation of a Biosynthetic Tissue-engineered Tracheal Graft in a Mouse Model

Transplantat stenos utgör ett avgörande hinder vävnadstekniska luftvägarna ersättare. För att undersöka cellulära mekanismerna bakom stenos, använder vi en murin modell av vävnadstekniska luftrör ersättning med seedade benmärgen mononukleära celler (BM-MNC). Här, detalj vi våra protokoll, inklusive byggnadsställning tillverkning, BM-MNC isolering, graften sådd, och implantation.

Sådd och Implantation av en biosyntetiska vävnadstekniska trakeal transplantat i en musmodell

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional ...

Kliniska tillämpningar av vävnad-engineered luftstrupe har begränsats på grund av att ympmaterial stenos och fördröjd epithelialization. En mus modell av orthotopic trakeal ersätter tillåter studiet av de cellulära mekanismer som kör regenerering. Långsegmentade defekter i luftvägarna kan överstiga vad nuvarande terapier kan bota.Den vävnadskonstruerade luftstrupen erbjuder potential att skapa ett ersättningsorgan för dessa tillstånd. Denna modell kan tillämpas på djur med transgena och härstamningsspårningsegenskaper. Vi kan sedan modulera de värdfaktorer som bidrar till transplantat förnyelse.En av de viktigaste utmaningarna i produktionen av byggnadsställningar kommer att vara att mäta och fastställa att elektrospinningsparametrarna är desamma varje gång. Så varje gång du producerar en byggnadsställning, måste du mäta tip-to-collector avstånd, luftfuktigheten, och temperaturen för att säkerställa att byggnadsställningar är desamma varje gång. Kritisk till framgång för denna modell är förfining av de mikrokirurgiska tekniker och underhåll av rätt plan av anestesi att tillåta spontan ventilation under hela förfarandet.Eftersom värd luftstrupen har en inre diameter på runt en millimeter, är transplantat och inhemska vävnad hantering och sutur placering viktiga och bäst visats visuellt. Börja med att lösa upp åtta vikt procent polyetentereftalat, eller PET, i hexafluoroisopropanol och uppvärmning av den resulterande lösningen till 60 grader Celsius. Medan lösningen värms upp, lös tre vikt procent polyuretan, eller PU, i hexafluoroisopropanol, kombinera lösningarna när PET-lösningen har svalnat.Ladda en 60-milliliter spruta utrustad med en 20-gauge trubbigt spets nål med polymerblandningen. Använd sprutan och en högspänningsströmsströmsaggregat inställd på positiva 14 kilovolt på nålen, en annan högspänningsströmsströmsaggregat inställd på minus tre kilovolt, en flödeshastighet på fem milliliter per timme och ett 20 centimeter långt längdavstånd till elektrospin till polymeren på en stång i diameter av rostfritt stål som vrids vid 350 rotationer per minut. Fortsätt elektrospinning tills en 300-mikrometers byggnadsställningsväggtjocklek uppnås.Skjut sedan ställningen av stången, placera ställningen under vakuum över natten för att avlägsna eventuellt restlösningsmedel och sterilisera ställningen med en ultraviolett ljusdosering på 350 millijoule per centimeter i kvadrat i ca 15 minuter. Under sterila förhållanden, ta bort huden från bakbenen av en sex till åtta veckor gammal, kvinnlig, C57-Svart/6 mus med fin sax och mikro-Adson-forceps, och använd Dumont nummer fem tlyktor och Dumont nummer 5/45-forceps för att ta bort fascian och senorna. Separera benen så att var och en av dem kan skäras på båda ändar, och använd en fem-milliliter spruta utrustad med en 25-gauge nål för att spola benmärgen i en petriskål som innehåller 30 milliliter RPMI medium.När alla ben har spolats, filtrera benmärgen genom en 70-mikrometer nylon cell sil i en 50-milliliter koniska röret, och överföra röret till en biosäkerhet skåp. Tillsätt försiktigt den filtrerade mononukleära celllösningen längs sidan av ett 15-milliliter rör som innehåller fem milliliter polysucrose och natriumdiatrizoate utan att blanda skikten, och separera plasman från de vita och röda blodkropparna genom densitetsgradientseparation. I slutet av centrifugeringen, samla det mellersta klart skikt bestående av benmärg mononukleära celler, och tvätta benmärgen mononukleära celler på en en-till-ett förhållandet i PBS genom centrifugeringen.Resuspend pelleten i fem milliliter PBS för en andra tvätt, följt av resuspension i 10 milliliter färskt RPMI medium för räkning. Samla sedan cellerna med en ytterligare centrifugation och späd cellerna till en gånger 10 till de sju cellerna per fem mikroliter av färsk RPMI-koncentration. Innan sådd ställningen, skär polymeren till en fem-millimeters längd vid behov, och våt ställningen med fem mikroliter RPMI medium i fem minuter.Vid slutet av inkubationen, ta bort överskottsmediet, och ladda ställningens ställningarlumen med fem mikroliter av benmärgs mononukleärcellslösningen i 10 minuter. Sätt sedan in en 21-gauge nål genom lumen av ställningen, och placera transplantatet i en milliliter av RPMI medium över natten i en 37-graders Celsius inkubator. Efter induktion av generell anestesi, bekräfta en brist på svar på tå nypa i mottagardjuret, och applicera salva på djurets ögon.Klipp håret på operationsområdet från haka till nyckelben, och placera djuret på en kirurgisk pad i en dorsal recumbent position. Med hjälp av aseptisk teknik, desinficera den kirurgiska platsen med en sekventiell povidone-jod, 70%etanol, povidone-jod torka serien, och flytta musen under en dissekera mikroskop med huvudet vid 12-tiden. Använd fina saxar och mikro-Adson-forceps för att göra ett mittlinjeanstyg från nyckelbenen till hyoidbenet, och använd Dumont nummer fem och nummer sju fina tlyktor och en steril bomullspinne för att rengöra fascian innan du sätter in en självbehållande Colibri-upprullningsdon i snittet.Använd tången för att öppna remmusklerna för att exponera sköldkörtelbrosk, cricoid brosk och luftstrupe, och rakt på sak separera luftstrupen från de återkommande laryngeal nerverna som löper parallellt på vardera sidan av vävnaden, följt av circumferential separation av luftstrupen från matstrupen. Med hjälp av en 20-gauge nål och kirurgisk markör, färga den främre delen av luftstrupen. Gör ett snitt under den tredje luftstrupen brosk ringen med hjälp av ett par Vannas-Tubingen våren sax och ett par Dumont nummer sju fina tlyktor att resect en tre-ring avsnitt av luftstrupen.Hålla luftstrupen med de fina böjda tlyktor, använd en steril 9-0 nylon sutur för att säkra den distala änden av luftstrupen till bröstbenet för att skapa en tillfällig trakeostomi, och använda 20-gauge nål och kirurgiska markör för att färga den främre delen av transplantatet. För att implantera transplantatet, använd en 9-0 steril nylon sutur, Dumont nummer sju fina tövär, och en nål hållare för att infoga proximala-bakre, proximala-laterala, och proximala-främre stygn, och vrid djuret 180 grader. När musen är i position, släpp den tillfälliga trakeostomi, och göra en lateral snitt fem millimeter bort från den främre delen av transplantatet för att underlätta den distala anastomos.För att slutföra den distala anastomos, placera suturer på ett liknande sätt som den proximala anastomos, och åter approximera ympningsposition och remmuskler. Stäng sedan snittet med 9-0 sterila nylonsuturer i ett löpmönster, och placera djuret ensamt i en återhämtningsbur som placeras på en värmedyna med övervakning tills full återhämtning. Två veckor efter implantation, några basala epitelceller kan observeras av basala cell keratin fem och 14 färgning i vävnad-engineered trakeal graft vävnad sektioner.Basala celler detekteras också på transplanttens luminala yta vid sju dagar efter implantation. Vid explantation och histologisk analys har transplantatstenos identifierats som den viktigaste bidragande faktorn för transplantat-implanterade möss som uppvisar tecken på luftvägarna nöd och stridor. Observera att teleskopering av transplantatet och infödda luftstrupen är ett vanligt fynd som ett resultat av den kirurgiska tekniken.Färgning för F4/80 avslöjar värd makrofager inom regionen stenotic av ympkvisten i samband med förekomsten av de basala epitelceller. Undvik manipulering av de återkommande larynxnerverna, och se till att de proximala och distala suturerna är på plats för att tillåta en lufttät tätning vid anastomosen. Eftersom detta protokoll behandlar benmärg mononukleära celler som härrör från biosäkerhet nivå ett agent möss, är det viktigt att bära lämplig personlig skyddsutrustning för att undvika kontaminering.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Att skapa två-dimensionell Mönstrad substrat för Protein och Cell inneslutning

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Autologous Endothelial Progenitor Cell-Seeding Technology and Biocompatibility Testing For Cardiovascular Devices in Large Animal Model

Autolog Endothelial stamceller-sådd Teknik och biokompatibilitet testning för Hjärt-enheter i stora djurmodell

Implantable cardiovascular devices are manufactured from artificial materials (e.g. titanium (Ti), expanded polytetrafluoroethylene), which pose the risk ...

Protocol for Relative Hydrodynamic Assessment of Tri-leaflet Polymer Valves

Protokoll för relativ Hydrodynamisk Bedömning av Tri-broschyr Polymer Ventiler

Limitations of currently available prosthetic valves, xenografts, and homografts have prompted a recent resurgence of developments in the area of ...

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

Kirurgisk teknik för implantation av vävnadstekniska kärlimplantat och efterföljande<em&gt; In Vivo</em&gt; Övervakning

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large ...

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

Generation och Nagelvävnadstekniska Fartyg i en musmodell

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

Produktion, karakterisering och potentiella användningsområdena för en 3D vävnadstekniska Human Esophageal Mucosal Modell

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

En kombinerad 3D vävnadstekniska<em&gt; In Vitro</em&gt; /<em&gt; In silico</em&gt; Lungtumör modell för att förutsäga läkemedelseffektivitet i specifika Mutations bakgrunder

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

tillämpningar av<em&gt; In Vivo</em&gt; Provning av Rat tibialis anterior för utvärdering vävnadstekniska skelettmuskulatur Repair

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Tredimensionella vävnadstekniska justerad Astrocyten nätverk att Recapitulate utvecklingsmässiga mekanismer och underlätta nervsystemet regenerering

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Tillverkning av anpassade agaros brunnar för Cell sådd och vävnad Ring självmontering med 3D-tryckt formar

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...