このプロトコルを使用してサンプル間の変動を取り除き、mRNAとタンパク質レベルの間のサンプル内不一致に基づく高分子の差動調節に関する洞察を提供することができます。同じサンプルを使用してDNA、RNA、タンパク質を単離することは、変動性を低減し、再現性を向上させ、解釈を容易にする試みです。利点としては、サンプル収集時の時間とリソースの節約、貴重な限られたサンプルの断面分析が挙げられます。
まず、適切な成長条件を持つ1つの10センチメートルプレートに種子1,000個のワーム卵が入っています。摂氏20度で72時間インキュベートします。その後、5ミリリットルのM9バッファーでプレートを洗浄し、1,000個の成虫をチューブに移します。
1,000 gでワームを1分間遠心し、上清を捨て、ペレット化されたワームをM9バッファーの1ミリリットルで1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移します。遠心分離機は再び845gで1分間、上清のほとんどを捨てます。ペレット化されたワームをマイナス80度で4時間以上保管してください。
次に、解凍したペレットから上清を取り除く。冷たいGTCP試薬を1ミリリットル加え、上下にピペットでよく混ぜ、サンプルを氷の上に10分間置きます。次に、200マイクロリットルの冷たいクロロホルムを加えます。
チューブを15秒間激しく振り、室温で3分間放置します。次に、チューブを13、摂氏4度で500gで15分間遠心する。マイクロピペットを使用して、クリアトップ層を新しいRNaseフリーの1.5ミリリットルマイクロ遠心分離管に移します。
白い白い相間層をB2というラベルの付いた新しいチューブに移し、残りのペレットからBとラベル付けされた新しいチューブにピンクの層を移し、両方を氷の上に置きます。3つの層を分けるのは難しいかもしれません。私は有機、またはピンクの層からこの層からDNAを沈殿させるのではなく、それ自身のチューブに曇りの相間層を移し込むのをお勧めします。
RNAを単離するために、まず100%イソプロパノールの500マイクロリットルをチューブAに加えてRNAを沈殿させる。その後、室温でチューブを10分間インキュベートする。インキュベーション後、チューブを13、摂氏4度で500gで10分間遠心分離する。
次に、上清を捨て、75%エタノールの1ミリリットルをチューブAに加え、ペレットを洗浄する。5、摂氏4度で300gのチューブを5分間遠心分離する。上清を捨て、ペレットの空気を5~10分間乾燥させます。
RNAのペレットを再構成するために50マイクロリットルのRNaseフリー水を加え、それを溶解するために55〜60°Cでペレットを10分間インキュベートします。最後に、分光光度計を使用して、260ナノメートルでの単離されたRNAの濃度を測定し、230および280ナノメートルの不純物を同定します。DNAを単離するには、まずチューブBの有機相とチューブB2の白層に300マイクロリットルのエタノールを加えてDNAを沈殿させ、反転によって混合し、チューブを室温で2〜3分間放置します。
次いで、遠心管BとB2を摂氏4度で376gで5分間ペレットDNAにする。チューブBとB2の上澄み物をCとラベル付けされた新しい2ミリリットルチューブに組み合わせ、その後のタンパク質分離のために氷の上に残します。次に、10%エタノールで0.1モルクエン酸ナトリウムを1ミリリットルでチューブB2のDNAペレットを30分間洗浄します。
遠心管B2は摂氏4度で376gで5分間続く。洗浄工程を繰り返し、ペレットを75%エタノールの1.5ミリリットルで再び懸濁し、室温で20分間放置します。次に、遠心管B2を摂氏4度で376gで5分間廃棄し、ペレットを5〜10分間乾燥させます。
8ミリリットルの水酸化ナトリウムの150マイクロリットルにペレットを溶解します。その後、サンプルを摂氏4度で376gで5分間遠心分離する。最後に、マイクロピペットを用いて、DNAを含む上清を新しいチューブに移す。
分光光度計を使用して、260ナノメートルで単離されたDNAの濃度を測定し、230および280ナノメートルで不純物を同定する。タンパク質を沈殿させるために、まずチューブCのピンクの上清に100%イソプロパノールの1.5ミリリットルまで加え、数回反転して混ぜ、室温で10分間インキュベートします。次いで、遠心管Cを13で、摂氏4度で500g10分間用いた。
上清を捨て、0.3モルグアニジン塩酸塩を2ミリリットルで95%エタノールで20分間室温で洗浄します。再び5、摂氏4度で300gのチューブを5分間遠心し、以前と同様に洗浄工程を繰り返します。C2とラベル付けされた新しい1.5ミリリットルチューブにタンパク質ペレットを移し、95%エタノール、渦の1.5ミリリットルまで加え、室温で20分間座らせます。
5、摂氏4度で300gのチューブを5分間遠心分離する。上清を捨て、ペレットを室温で10分間乾燥させます。その後、ペレットを5%SDSの300マイクロリットルに50°Cで60分間溶解する。
最後に、13、摂氏17度で500gのチューブを10分間遠心分離する。そして、タンパク質を含む上清を新しいチューブに移す。定量的な逆転写PCRを行う。
まず、単離されたRNAのナノグラムを1ナノグラムにして、逆転写によってcDNAを調製する。cDNAのストックプレートを作るためには、各cDNAサンプルの100マイクロリットルを96ウェルプレートの個々のウェルに加え、水のみの井戸や連続希釈サンプルなどの適切な制御を含み、各遺伝子のプライマー効率を確立します。プライマーの各セットのマスターミックスを作るために、最大7マイクロリットルの水、DNAインターカリングシアン化物染料、および前方および逆プライマーのそれぞれ5つのマイクロモルを加えます。
マスターミックスの7マイクロリットルをRT-qPCRプレートの適切なウェルに追加します。次に、ストックプレートからcDNAを3マイクロリットル加え、使用するプライマーに適したRT-qPCRプロトコルを使用してプレートを実行します。3つのワーム株の4つの独立したサンプルからの単離されたmRNAのRT-qPCR分析は、RNAセクアッセイによって同定された標的を確認するために行われた。
F07C4.12遺伝子はeat-2ワームの両方のアッセイでアップレギュレートされたが、rsks-1ワームにおけるそのアップレギュレーションはRT-qPCRアッセイによって検出されなかった。また、RNAセク検出されたeat-2およびrsks-1ワームにおけるmrp-1の発現変化はRT-qPCRを介して確認された。
SDSページで分離され、クマシーブルーで染色されたワーム中のGTCpとRIPA抽出タンパク質の比較は、GTCp抽出タンパク質に対するより大きなタンパク質のより良い分解能と同様の品質を示した。ウェスタンブロット分析は、ほとんどの場合、同様のタンパク質レベルを示したが、75キロダルトンを超えるタンパク質は、RIPA抽出タンパク質において低いレベルを示した。3つのワーム株の4つの個々のサンプルからの標的mRNAとタンパク質レベルの比較は、タンパク質レベルでより大きな変動性を有するmRNAレベルの低い変動性を示した。
DNA単離の文脈では、収量は有機層またはピンク層から曇りの相間層を回収する習熟度に大きく依存する。ペレットからのタンパク質の可溶化を改善するためには、再溶解バッファーの体積を増加させたり、SDS以外の他の洗剤を添加したりする必要がある。この方法を使用すると、mRNAからタンパク質への翻訳が相対的ではなく、様々な条件下で転写後および翻訳後の調節機構のより深い調査につながる可能性がある場合を正しく特定するのに役立ちます。
このプロトコルは、貴重な時間のコアサンプルを節約するために使用されています。さらに、概日リズム分野で採用するのに役立つプロトコルだと思います。RNAの単離に使用されるGCTP試薬および溶媒は危険であり、注意して使用する必要があります。
