सिर और गर्दन के कैंसर में Perineural आक्रमण का आकलन करने के लिए Vivo मॉडल में चिक Chorioallantoic झिल्ली

यह प्रोटोकॉल ट्यूमर कोशिकाओं और नसों और कैंसर में तंत्रिका आक्रमण के आणविक मार्गों के अध्ययन के बीच जल्दी बातचीत के वीवो अध्ययन में अनुमति देता है। इस तकनीक के मुख्य फायदे एक ही प्रयोग में पेरिन्यूरल आक्रमण और अन्य कैंसर फेनोटाइप का अध्ययन करने की क्षमता के साथ कम प्रायोगिक समय है। पहली बार इस तकनीक की कोशिश करने से पहले, हम दोनों प्रक्रियाओं के लिए अपनी तकनीक को अनुकूलित करने के लिए वाणिज्यिक गैर-निषेचित अंडे ड्रिलिंग का अभ्यास करने और पृष्ठीय जड़ गैंगलिया की कटाई करने की सलाह देते हैं।

प्रक्रिया का प्रदर्शन मिन लियू, मेरी प्रयोगशाला से एक अनुसंधान सहयोगी होगा । प्रति घंटा रोटेशन के साथ आठ दिनों के लिए निषेचन के बाद पहले दिन पर 38 डिग्री सेल्सियस और 54% आर्द्रता पर एक अंडे ह्यूमिडाइज़िंग इनक्यूबेटर में प्रति प्रायोगिक समूह प्रति छह वाणिज्यिक रोगजनक मुक्त निषेचित अंडे इनक्यूबेटिंग द्वारा शुरू करें। आठ दिन, 70% इथेनॉल के साथ एक इच्छाकृत चूहे की पृष्ठीय त्वचा को साफ करें और रीढ़ को हटाने के लिए कैंची का उपयोग करें।

गर्भाशय ग्रीवा, छाती, और काठ क्षेत्रों को अलग करें और ऊतक के नमूनों को हाइड्रेटेड रखने के लिए पीबीएस के साथ 10 सेंटीमीटर कल्चर डिश में रीढ़ के वर्गों को रखें। नाजुक हड्डी कैंची का उपयोग करना, पृष्ठीय और वेंट्रल पहलुओं में वक्ष और गर्भाशय ग्रीवा कशेरुकी हड्डियों को खोलने के लिए दो पार्श्व हिस्सों में रीढ़ को अलग करने और ताजा PBS के साथ एक साफ 10 सेंटीमीटर पकवान में ऊतक वर्गों जगह है । संदंश का उपयोग करके, पृष्ठीय जड़ गैंगलियन की कल्पना करने के लिए कशेरुकी हड्डियों से रीढ़ की हड्डी को धीरे-धीरे करें।

प्रत्येक गैंगलियन के तहत आयोजित ठीक संदंश की एक जोड़ी के सुझावों को रखने, ऊतक समझ और यह हड्डी गुहा जिसमें यह दर्ज की गई है से खींच । कटाई के तुरंत बाद, प्रत्येक गैंगलियन को 2% पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन या पेन-स्ट्रेप और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम या एफबीएस के साथ पूरक डीएमईएम संस्कृति माध्यम में रखें ताकि तंत्रिका ऊतकों के बैक्टीरियल संदूषण को रोकने में मदद मिल सके। जब सभी गैंगलिया को काटा गया है, तो ऊतकों को एक नई संस्कृति डिश में स्थानांतरित करें जिसमें ताजा डीएमईएम संस्कृति माध्यम 2% पेन-स्ट्रीप प्लस 10% एफबीएस और 1.2 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर लाल फ्लोरोसेंट डाई के सेल कल्चर इनक्यूबेटर में एक घंटे की इनक्यूबेशन के लिए पूरक है।

पृष्ठीय जड़ गैंगलियन भ्रष्टाचार के लिए अंडे तैयार करने के लिए, एक लैमिनार प्रवाह कैबिनेट में प्रकाश को मंद करें और हल्के स्रोत की ओर स्वाभाविक रूप से होने वाली हवा थैली के साथ अंडे को पकड़ें, लड़की व्यवहार्यता और भ्रूणीय चरण की जांच करने के लिए प्रत्येक अंडे को ट्रांसलिमिनेट करें। अंडे की झिल्ली से जुड़े एक अंधेरे चलती पोत के रूप में कोरियोलाएंटोनिक झिल्ली के लिए विकासशील भ्रूण के लगाव की पहचान करें और इस क्षेत्र में हस्तक्षेप से बचने के लिए लगाव को चिह्नित करने के लिए एक पेंसिल का उपयोग करें। एक ऑपरेटिंग विंडो क्षेत्र के रूप में कार्य करने के लिए भ्रूण लगाव से कम से कम दो सेंटीमीटर में एक अच्छी तरह से संवहनी क्षेत्र में 1.5 सेंटीमीटर क्षेत्र ड्रा करें और ऑपरेटिंग विंडो से लगभग एक सेंटीमीटर कम संवहनी क्षेत्र में 0.5 सेंटीमीटर वर्ग आकर्षित करें।

फिर वायु थैली क्षेत्र के केंद्र को चिह्नित करें। इसके बाद, चिह्नित वर्ग के भीतर अंडे के छेद को ध्यान से ड्रिल करने के लिए तीन मिलीमीटर व्यास बिट के साथ एक रोटरी उपकरण और नक्काशी ड्रिल का उपयोग करें। खोल के नीचे सफेद बाहरी अंडे के खोल झिल्ली को हटाने के बिना अंडे के खोल को हटाने के लिए कुंद संदंश का उपयोग करें।

ड्रिल का उपयोग सावधानी से एयर सैक क्षेत्र में चिह्नित क्रॉस में एक पिनपॉइंट ड्रिल वेफोरेशन बनाने के लिए करें ताकि खोल को तोड़ने या नुकसान पहुंचाए बिना अंडे में एयरफ्लो की अनुमति दी जा सके और बरकरार बाहरी अंडे के खोल झिल्ली पर स्क्वायर ओपनिंग में एचबीबीएस के 30 माइक्रोलीटर जोड़ें। 30 गेज सुई का उपयोग करके, वर्ग क्षेत्र के भीतर बाहरी झिल्ली में एक तुच्छ छिद्र बनाएं। इसके बाद, हवा की थैली की कल्पना करने के लिए अंडे को प्रकाश स्रोत तक पकड़ें और एक आईड्रॉपर रबर बल्ब पर दबाव लागू करें।

आंखों की बूंद बल्ब को हवा की थैली के भीतर छोटे छिद्र पर रखें और बल्ब पर दबाव छोड़ें जब तक कि ऑपरेटिंग विंडो क्षेत्र के भीतर बाहरी झिल्ली और कोरियोलाएंटोनिक झिल्ली का पृथक्करण इस चरण को दोहराते हुए देखा जाता है जब तक झिल्ली का पूर्ण पृथक्करण प्राप्त नहीं हो जाता है। जब सभी अंडों को एक ही तरीके से संशोधित किया गया है, तो बाहरी अंडे के झिल्ली को तोड़ने के लिए ध्यान न रखते हुए एक अंडे में परिपत्र ऑपरेटिंग विंडो ड्रिल करें और खोल से किसी भी ढीले कणों को हटाने के लिए चिपकने वाले टेप के टुकड़े के चिपचिपा पक्ष का उपयोग न करें। कुंद संदंश का उपयोग करना, ड्रिल क्षेत्र से अंडे के खोल को हटा दें जिसके बाद बाहरी अंडे के खोल झिल्ली ने प्रदूषण को कम करने के लिए अंडे के अंदर छोटे खोल कणों को पेश न करने का ख्याल रखा।

जब अंडे के तेल और बाहरी झिल्ली को प्रदर्शन के रूप में हटा दिया गया है, तो अंडे को पैराफिन मोम झिल्ली के साथ कवर करें और अंडे को बिना रोटेशन के अंडे इनक्यूबेटर में वापस रखें जब तक कि पृष्ठीय जड़ गैंगलिया ग्राफ्टिंग के लिए तैयार न हो जाए। कोरियोलाएंटोइक झिल्ली पर एक पृष्ठीय रूट गैंगलियन की ग्राफ्टिंग के लिए, संस्कृति पकवान में एक गैंगलियन को ध्यान से समझने के लिए ठीक बाँझ संदंश का उपयोग करें और ताजा एचबीबीएस के कंटेनर में ऊतक को धीरे से धोएं। एक अंडे की कोरियोलाएंटोनिक झिल्ली पर गैंगलियन रखें झिल्ली को पंचर न करें और बाँझ पारदर्शी फिल्म ड्रेसिंग के साथ अंडे के सभी उद्घाटन को कवर करें।

जब सभी अंडों को ग्राफ्ट किया गया हो, तो उन्हें बिना रोटेशन के दो दिनों के लिए ह्यूमिडिफाइंग अंडा इनक्यूबेटर में वापस कर दें। इनक्यूबेशन के अंत में, अंडे को लैमिनार प्रवाह कैबिनेट में स्थानांतरित करें और पारदर्शी फिल्म ड्रेसिंग खोलने के लिए कैंची और संदंश का उपयोग करें। इसके बाद, गंगलिया और कोशिकाओं के बीच एक समान दूरी रखते हुए प्रत्येक पृष्ठीय जड़ गैंगलियन से प्रत्येक अंडे की कोरियोलाएंटोनिक झिल्ली पर एचबीबीएस के पांच माइक्रोलीटर में 0.5 से 1 मिलियन फ्लोरोसेंटली लेबल ट्यूमर कोशिकाओं को जोड़ें।

फिर अंडों को नई फिल्म ड्रेसिंग से ढक कर अंडे को बिना रोटेशन के सात दिन के लिए अंडे इनक्यूबेटर में वापस कर दें। इनक्यूबेशन के अंत में, अंडे को प्रयोगशाला बेंच शीर्ष पर रखें। प्रत्येक अंडे की फिल्म ड्रेसिंग को छिद्रित करने के लिए एक सिरिंज का उपयोग करें और कटाई प्रक्रिया को सुविधाजनक बनाने के लिए ऊतक को थोड़ा कठोर करने के लिए प्रत्येक कोरियोलाएंटोनिक झिल्ली पर 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के लगभग 300 माइक्रोलीटर लागू करें।

कैंची का उपयोग करके, अंडे के ऊपरी आधे हिस्से को कोरियोलाएंटोइक झिल्ली से जुड़े के साथ हटा दें। खोल के आकार को कम करने के लिए व्यास में लगभग तीन सेंटीमीटर के लिए कम करने के लिए chorioallantoic झिल्ली के हिस्से को ध्यान में रखते हुए जहां पृष्ठीय जड़ गैंगलियन और ट्यूमर कोशिकाओं को खोल टुकड़े के केंद्र के भीतर कलम किया गया । फिर ठीक संदंश के साथ कोरियोलाएंटोनिक झिल्ली को समझें और अंडे के कोयले से ऊतक को छह-अच्छी तरह से प्लेट के एक कुएं में स्थानांतरित करने के लिए अलग कर दें जिसमें 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के दो मिलीलीटर शामिल हैं जो अच्छी तरह से पृष्ठीय रूट गैंगलियन और ट्यूमर सेल साइड अप करते हैं।

कोरियोलाएंटोनिक झिल्ली में पृष्ठीय जड़ गैंगलिया का एकीकरण महत्वपूर्ण है क्योंकि कोरियोलाएंटोइक झिल्ली प्रयोग के दौरान पृष्ठीय जड़ गैंगलियन ऊतक को पोषण प्रदान करती है। सूक्ष्म रूप से, पृष्ठीय जड़ गैंगलियन को कोरियोलाएंटोइक झिल्ली के संयोजी ऊतक के भीतर देखा जाता है और रक्त वाहिकाओं को अक्सर पृष्ठीय जड़ गैंगलियन ऊतक के अंदर देखा जाता है जो यह सुझाव देता है कि कोरियोलाएंटोइक झिल्ली रक्त आपूर्ति ग्राफ्ट किए गए ऊतकों का पोषण कर रही है। प्रत्यारोपित ट्यूमर की पहचान हेमेटॉक्सीलिन और ियोसिन स्टेनिंग द्वारा कोरियोलाएंटोनिक झिल्ली पर भी की जाती है।

कितना आक्रमण मौजूद है पर निर्भर करता है, ट्यूमर कई ट्यूमर कनेक्टिव ऊतक पर हमला द्वीपों के लिए कोई के साथ मौजूद हो सकता है । इस प्रतिनिधि प्रयोग में, मर्ज फ्लोरेसेंस विश्लेषण के साथ इमेजिंग ने ट्यूमर को नियंत्रित करने की तुलना में गैलिन रिसेप्टर 2 को व्यक्त करने पर ट्यूमर कोशिकाओं के साथ ग्राफ्ट किए गए कोरियोलाएंटोइक झिल्ली में पृष्ठीय जड़ गैंगलियन के आक्रमण में वृद्धि का खुलासा किया। परिणीति आक्रमण के वीवो मॉडल में यह उपयोगी और लागत प्रभावी सीमित संसाधनों वाली प्रयोगशालाओं द्वारा भी दोहराई जा सकती है।