Name: the chick chorioallantoic membrane in vivo model to assess perineural invasion in head and neck cancer
Uploaded: 2019-06-21T13:00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Chick Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Assess Perineural Invasion in Head and Neck Cancer at JoVE.com

इस कार्य को NIH/NIDCR अनुदान DE027551 और DE022567 (NJD) द्वारा समर्थित किया गया था।

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	<li>Schmitd, L. B., Scanlon, C. S., D'Silva, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perineural+Invasion+in+Head+and+Neck+Cancer.">Perineural Invasion in Head and Neck Cancer.</a> Journal of dental research. 97 (7), 742-750 (2018).</li><li>Liebig, C., Ayala, G., Wilks, J. A., Berger, D. H., Albo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perineural+invasion+in+cancer:+a+review+of+the+literature.">Perineural invasion in cancer: a review of the literature.</a> Cancer. 115 (15), 3379-3391 (2009).</li><li>Schmitd, L. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galanin+modulates+the+neural+niche+to+favour+perineural+invasion+in+head+and+neck+cancer.">Galanin modulates the neural niche to favour perineural invasion in head and neck cancer.</a> Nature communications. 6, 6885 (2015).</li><li>Amit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+RET+induces+perineurial+invasion+of+pancreatic+adenocarcinoma.">Upregulation of RET induces perineurial invasion of pancreatic adenocarcinoma.</a> Oncogene. 36 (23), 3232-3239 (2017).</li><li>Huyett, P., Gilbert, M., Liu, L., Ferris, R. L., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Model+for+Perineural+Invasion+in+Head+and+Neck+Squamous+Cell+Carcinoma.">A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (119), (2017).</li><li>Ayala, G. 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(104), (2015).</li><li>Ota, I., Li, X. Y., Hu, Y., Weiss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+a+MT1-MMP+and+MT2-MMP-dependent+basement+membrane+transmigration+program+in+cancer+cells+by+Snail1.">Induction of a MT1-MMP and MT2-MMP-dependent basement membrane transmigration program in cancer cells by Snail1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (48), 20318-20323 (2009).</li><li>Murphy, J. 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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+chorioallantoic+membrane+assay+as+an+in+vivo+model+to+study+the+effect+of+nanoparticle-based+anticancer+drugs+in+ovarian+cancer.">Chick chorioallantoic membrane assay as an in vivo model to study the effect of nanoparticle-based anticancer drugs in ovarian cancer.</a> Scientific reports. 8 (1), 8524 (2018).</li><li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia.">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC research notes. 9, 82 (2016).</li><li>Cavel, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoneurial+macrophages+induce+perineural+invasion+of+pancreatic+cancer+cells+by+secretion+of+GDNF+and+activation+of+RET+tyrosine+kinase+receptor.">Endoneurial macrophages induce perineural invasion of pancreatic cancer cells by secretion of GDNF and activation of RET tyrosine kinase receptor.</a> Cancer research. 72 (22), 5733-5743 (2012).</li><li>Guo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+the+sympathetic+nerve+with+pancreatic+cancer+cells+promotes+perineural+invasion+through+the+activation+of+STAT3+signaling.">Interaction of the sympathetic nerve with pancreatic cancer cells promotes perineural invasion through the activation of STAT3 signaling.</a> Molecular cancer therapeutics. 12 (3), 264-273 (2013).</li><li>Deborde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+In+Vivo+Murine+Sciatic+Nerve+Model+of+Perineural+Invasion.">An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (134), (2018).</li><li>Magnon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Autonomic nerve development contributes to prostate cancer progression. 341 (6142), 1236361 (2013).</li><li>Ribatti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+embryo+chorioallantoic+membrane+as+a+useful+tool+to+study+angiogenesis.">Chick embryo chorioallantoic membrane as a useful tool to study angiogenesis.</a> International review of cell and molecular biology. 270, 181-224 (2008).</li></ol>

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा करते हैं.

यहाँ प्रस्तुत विवो मॉडल में सीएएम-डीआरजी ट्यूमर कोशिकाओं द्वारा तंत्रिका के शारीरिक आक्रमण से पहले तंत्रिका ट्यूमर बातचीत का प्रदर्शन करके पिछले मॉडलों की कमी को संबोधित करता है। पीएनआई के अधिकांश अध्ययन में ट्यूमर के प्रसार और मोटर समारोह के निषेध पर ध्यान केंद्रित है , और sciatic नसों में ट्यूमर कोशिकाओं के प्रत्यक्ष इंजेक्शन पर निर्भर23,24,25. sciatic तंत्रिका इंजेक्शन पीएनआई के एक विवो मॉडल जहां कैंसर की कोशिकाओं को एक माउस या चूहे sciatic तंत्रिका जहां ट्यूमर बाद में बढ़ता में इंजेक्ट कर रहे हैं. इंजेक्शन मॉडल विनाशकारी ट्यूमर प्रगति और नसों के भीतर ट्यूमर कोशिकाओं से उत्पन्न दर्द को दिखाने के लिए उपयोगी होते हैं। sciatic तंत्रिका मॉडल भी कारकों है कि कैंसर की कोशिकाओं को तंत्रिका में कामयाब होने की अनुमति के अध्ययन के लिए उपयुक्त है, लेकिन पीएनआई के प्रारंभिक चरण का मूल्यांकन करने की क्षमता का अभाव है, क्योंकि यह सीधे तंत्रिका में कोशिकाओं का परिचय, तंत्रिका म्यान को दरकिनार. एक अलग दृष्टिकोण में, शल्य चिकित्सा प्रत्यारोपित orthotopic ट्यूमर grafts प्रोस्टेट कैंसर प्रगति को बढ़ावा देने में adrenergic और कोलीनर्जिक तंत्रिका फाइबर के महत्व की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया गया, इस प्रकार ट्यूमर प्रगति में नसों की एक प्रमुख भूमिका का सुझाव 26. इस मॉडल में मौरीन सहानुभूतिपूर्ण और परानुकंपी तंत्रिकाओं का रासायनिक अपाहिज होता था . parasympathetic फाइबर ट्यूमर के ऊतकों में घुसपैठ, पीएनआई से संबंधित एक प्रक्रिया है, लेकिन मॉडल विशेष रूप से तंत्रिका और ट्यूमर के बीच शारीरिक बातचीत का आकलन करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया गया था. सीएएम-डीआरजी मॉडल पीएनआई के दौरान तंत्रिका और कैंसर के बीच बातचीत की जांच की अनुमति देता है। इसके अलावा, murine मॉडल महंगा है और समय लेने वाली जब सीएएम मॉडल की तुलना में कर रहे हैं. हम पीएनआई के मशीनी अध्ययन के लिए सीएएम-डीआरजी मॉडल का उपयोग करने का सुझाव देते हैं।

सीएएम-डीआरजी दृष्टिकोण के कुछ लाभों में पीएनआई और अन्य फीनोटाइप्स का मूल्यांकन शामिल है, जैसे ट्यूमर विकास, मेटास्टेसिस, और एंजियोजेनेसिस। कम सीएएम पर मानव डीएनए की पहचान और / या जिगर में मानव कैंसर सेल लाइनों10के मेटास्टेसिस का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है , ऊतक अनुभाग और धुंधला, जो छोटे मेटास्टेसिस प्रकट नहीं हो सकता है की तुलना में एक अधिक संवेदनशील प्रयोगात्मक दृष्टिकोण.

सीएएम-डीआरजी विधि की कुछ सीमाएँ हैं, जिनमें संक्षिप्त अवलोकन समय सीमा भी शामिल है. भ्रूण की प्रतिरक्षा प्रणाली दिन 1827द्वारा शारीरिक रूप से सक्रिय है, जब अस्वीकृति और एक भड़काऊ प्रक्रिया हो सकती है, प्रयोगात्मक समय को सीमित करती है। यह भी दूरी पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है जब DRG के करीब ट्यूमर कोशिकाओं grafting; बड़ा DRG-कैंसर दूरी ट्यूमर कोशिकाओं और तंत्रिका के बीच आणविक बातचीत ख़राब हो सकता है, या मॉडल के दोनों घटकों के बीच शारीरिक संपर्क में देरी हो सकती है. इसके अलावा, अगर भ्रूण इस प्रोटोकॉल में निर्धारित से पुराने हैं, भ्रूण आंदोलनों ट्यूमर कोशिकाओं को विस्थापित हो सकता है. इसलिए, यह सेल grafting के लिए दिन 10 के बाद निषेचन के साथ संगत अंडे का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है.

चूंकि प्रतिरक्षा प्रणाली पूरी तरह से दिन से पहले विकसित नहीं है 1827, सीएएम में ट्यूमर microenvironment अक्सर कैंसर के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया इम्यूनोसप्रेस्ड murine मॉडल के समान है. इसलिए, इस मॉडल ट्यूमर प्रगति में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भूमिका का आकलन करने के लिए उपयोगी नहीं है। एक अन्य सीमा चिकन प्रजातियों के लिए अभिकर्मकों की प्रतिबंधित उपलब्धता है, जैसे एंटीबॉडी, साइटोकिन्स और प्राइमर।

सही ढंग से इस प्रोटोकॉल प्रदर्शन अभ्यास की आवश्यकता है; हालांकि, यह एक विशेष कोर सुविधा के लिए आवश्यकता के बिना एक प्रयोगशाला सदस्य द्वारा किया जा सकता है. अंडे के खोल की ड्रिलिंग प्रशिक्षण की आवश्यकता है. किराने पर अभ्यास (गैर निषेचित) अंडे पहली बार के लिए इस मॉडल का प्रयास करने से पहले की सिफारिश की है. उच्च भ्रूण अस्तित्व और मॉडल की सफलता प्राप्त किया जा सकता है अगर कुछ महत्वपूर्ण कदम संक्रमण से बचने के लिए पालन कर रहे हैं: 2% पेन / स्ट्रेप में DRGs के उपयुक्त एंटीबायोटिक प्रोफिलैक्सिस, एक laminar प्रवाह कैबिनेट में काम कर रहे हैं, और अंडे खोल कणों के प्रसार से बचने सीएएम पर. यह भी कुल अंडे ऊष्मायन समय के दौरान स्थिर आर्द्रता रखने के लिए महत्वपूर्ण है। हम प्रति समूह अंडे की संख्या में वृद्धि की सलाह देते हैं जब तक तकनीक में महारत हासिल है. अनुभवहीन प्रयोगशाला कर्मियों के लिए सबसे अक्सर समस्याओं अंडे संदूषण और सेल grafting के लिए गलत तकनीक हैं.

डीआरजी कटाई के लिए भी प्रशिक्षण की आवश्यकता है; इन विट्रो प्रयोगों के लिए DRGs कटाई में अभ्यास8 में विवो मॉडल का प्रयास करने से पहले की सिफारिश की है. इन विट्रो डीआरजी संस्कृति की स्थिति का अनुकूलन और DRG निष्कर्षण की अवधि को कम करने के लिए तकनीक में सुधार करने के लिए एक अवसर है। जब डी आर जी को बल के साथ पकड़ते हैं तो कटाई तकनीक पर विशेष ध्यान देने की आवश्यकता होती है। डीआरजी को सीधे नहीं रखा जाना चाहिए; दबाव इसके नीचे लागू किया जाना चाहिए. हम बेहतर निष्कर्षण के दौरान DRG कल्पना करने के लिए आवर्धक लेंस के उपयोग की सलाह देते हैं.

महत्वपूर्ण बात, जब पहली बार के लिए इस मॉडल प्रदर्शन, सभी शर्तों वांछित सेल लाइन के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. इस मॉडल चूहा DRG और HNC सेल लाइन UM-SCC-1 के लिए अनुकूलित किया गया था. माउस DRG और अन्य कैंसर सेल प्रकार के उपयोग अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है. grafted कोशिकाओं के एक उच्च एकाग्रता के साथ, ट्यूमर मोटा और कठोर हो जाना करते हैं, जो ट्यूमर माप की सुविधा. प्रत्येक समूह के लिए कई अंडे और प्रत्येक अंडे के लिए कोशिकाओं की एक उचित एकाग्रता को ध्यान में रखते हुए, कई लाख कोशिकाओं को प्रत्येक प्रयोग के लिए आवश्यक हो सकता है. योजना को सुविधाजनक बनाने के लिए, कोशिकाओं के दोहरीकरण के समय के ज्ञान को ध्यान में रखा जाना चाहिए। इस प्रोटोकॉल में कुछ महत्वपूर्ण चरणों के लिए, एक समस्या निवारण तालिका प्रदान की जाती है (तालिका1).

Perineural आक्रमण (PNI) कैंसर में एक understudied phenotype है, जो उच्च रोग पुनरावृत्ति और सिर और गर्दन स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (HNC)1के साथ रोगियों में गरीब अस्तित्व के साथ जुड़ा हुआ है. पीएनआई को नसों के भीतर या आस - पास की ट्यूमर कोशिकाओं के रूप में सूक्ष्म रूप से परिभाषित किया गया है2,3. जब पीएनआई का पता चलता है, तो रोगियों को वैकल्पिक गर्दन विच्छेदन और/या विकिरण चिकित्सा4,5 जैसे सहायक चिकित्सा प्राप्त होने की संभावनाहोतीहै। हालांकि, इन उपचारों आक्रामक हैं, और नहीं PNI-विशिष्ट. वास्तव में, पीएनआई को ब्लॉक करने के लिए कोई चिकित्सा नहीं है, मुख्य रूप से क्योंकि तंत्रिका ट्यूमर बातचीत अंतर्निहित तंत्र अभी भी खराब समझ रहे हैं।
विभिन्न आणविक तंत्र तंत्रिका ट्यूमर आकर्षण में फंसाया गया है; ट्यूमर और स्ट्रॉमल कोशिकाएं न्यूरिटोजेनेसिस6,7 को बढ़ावा देने के लिए न्यूरोपेप्टाइड और विकास कारकों को जारी करतीहैं. जब इन विट्रो में एक साथ सुसंस्कृत, HNC कोशिकाओं और पृष्ठीय जड़ Ganglia (DRG) दोनों एक मजबूत प्रतिक्रिया है; ट्यूमर सेल आक्रमण और न्यूरिटोजेनेसिस पर प्रभाव संस्कृति6,8,9में कुछ दिनों के बाद देखा जा सकता है . हालांकि, आक्रमण से पहले ट्यूमर-नेवर बातचीत को recapitulate करने के लिए विवो मॉडल में उपयुक्त की कमी है। यहाँ हम एचएनसी कोशिकाओं और नसों6के बीच प्रारंभिक बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक में विवो पीएनआई मॉडल प्रस्तुत करते हैं . हम एक तंत्रिका घटक शामिल करने के लिए लड़की chorioallantoic झिल्ली (सीएएम) मॉडल अनुकूलित, सीएएम में एक DRG grafting, कैंसर कोशिकाओं के एक कलम के बाद एक innervated ट्यूमर microenvironment नकल करने के लिए.
सीएएम मॉडल का उपयोग तहखाने झिल्ली के माध्यम से कोशिकाओं के आक्रमण का आकलन करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है , कार्सिनोमा और मेलेनोमा10,11,12के प्रारंभिक आक्रामक चरणों की नकल करते हुए . सीएएम में ऊपरी कोरियोनिक उपकला, मध्यवर्ती मेसेन्काइम, और कम एलान्टोइक उपकला शामिल है। कोरियोनिक उपकला संरचनात्मक रूप से मानव उपकला10,13 के समान है जिसमें कोलेजन-IV-रिच बेसमेंट झिल्ली तहखाने झिल्ली को simulates जो अंतर्निहित संयोजी ऊतक से मौखिक उपकला को अलग करती है। के बाद से पहले ट्यूमर grafts 191314में सीएएम में प्रदर्शन किया गया , विधि के कई रूपांतरों एंजियोजेनेसिस15,16,17, ट्यूमर प्रगति के आकलन के लिए अनुमति देने के लिए विकसित किए गए थे , और मेटास्टेसिस18| महत्वपूर्ण बात, सीएएम पर ट्यूमर grafting की तकनीक बहुत कम बदल गया है, लेकिन आवेदन लगातार विकसित कर रहे हैं. बढ़ती जटिलता के परख प्रकाशित किया गया है, दवा स्क्रीनिंग19,हड्डी ऊतक इंजीनियरिंग20,और नैनोकण आधारित कैंसर विरोधी दवाओं21सहित .
हमारी प्रयोगशाला एक सीएएम-डीआरजी मॉडल का उपयोग करती है जिसमें एक स्तनधारी डीआरजी अलग है और ऊपरी सीएएम की सतह पर कलम लगाया जाता है। के बाद DRG सीएएम में शामिल हो जाता है, HNC कोशिकाओं DRG के पास grafted और DRG के साथ बातचीत करने से पहले vivo प्रणाली में पूरी काटा और विश्लेषण की अनुमति दी जाती है. महत्वपूर्ण बात, प्रणाली DRG और ट्यूमर कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट लेबलिंग द्वारा DRG और ट्यूमर दोनों के पूर्व-vivo दृश्य अवलोकन की अनुमति देता है. इस प्रोटोकॉल में 17 दिनों के भीतर निष्पादित जटिलता के विभिन्न स्तरों केसाथ कई चरणों को शामिल किया गया है, अंडे को इनक्यूबेट करने से लेकर सीएएम (चित्र 1) की कटाई तक। ब्याज के विभिन्न प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं को इस मॉडल में परीक्षण किया जा सकता है आणविक रास्ते कैंसर में तंत्रिका आक्रमण के लिए जिम्मेदार स्पष्ट करने के लिए, और भी स्क्रीनिंग दवाओं के लिए सीधे तंत्रिका आक्रमण को लक्षित करने के लिए. एक उम्मीदवार दवा के साथ पूर्व इलाज कोशिकाओं सीएएम पर grafted किया जा सकता है और इलाज नियंत्रण की तुलना में जांच पीएनआई की घटना. वास्तव में, सीएएम मॉडल का उपयोग दवा जांच के लिए इन विट्रो अध्ययनों और कृन्तकों में विवो परीक्षणों में पूर्व-नैदानिक के बीच एक मध्यवर्ती कदम के रूप में किया गयाहै।
प्रयोगात्मक डिजाइन परिकल्पना के साथ अलग अलग होंगे. उदाहरण के लिए, यदि पीएनआई पर एक विशिष्ट प्रोटीन की भूमिका का परीक्षण, प्रयोगात्मक समूह DRG ट्यूमर कोशिकाओं के साथ grafted प्रोटीन overexpressing शामिल होगा, जबकि नियंत्रण समूह खाली वेक्टर के साथ stably transfected कोशिकाओं के साथ DRG शामिल करना चाहिए. कई अलग अलग प्रयोगात्मक डिजाइन विशिष्ट सवालों के पते के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:926px;" width="926">
	<tbody>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:255px;">0.25% Trypsin-EDTA (1x)</td>
			<td style="width:166px;">Gibco</td>
			<td style="width:100px;"># 25200-056</td>
			<td style="width:406px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">ACE light source</td>
			<td>SCHOTT North America, Inc.</td>
			<td style="width:100px;"></td>
			<td>Used to transilluminate the eggs</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:255px;">CellTracker Green CMFDA fluorescent dye</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:100px;"># C7025</td>
			<td style="width:406px;">Reconstitute 50&#181;g in 20&#181;L of DMSO and stock at -20oC. Use 1&#181;L of stock solution/mL of culture medium.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:255px;">CellTracker Red CMTPX fluorescent dye</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:100px;"># C34552</td>
			<td style="width:406px;">Reconstitute 50&#181;g in 40&#181;L of DMSO and stock at -20oC. Use 1&#181;L of stock solution/mL of culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:255px;">Cordless rotary tool</td>
			<td>DREMEL</td>
			<td style="width:100px;"># 866</td>
			<td>Used to drill the egg shell</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:255px;">DMEM (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:100px;"># 11965-092</td>
			<td>Dulbeecco`s Modified Eagle Medium</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:255px;">DMSO</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:100px;"># BP231-100</td>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">Dumont # 5 fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td style="width:100px;"># 11254-20</td>
			<td>Used to harvest DRG</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:255px;">Egg incubator</td>
			<td>GQF&#160; Digital Sportsman</td>
			<td style="width:100px;"># 1502</td>
			<td style="width:406px;">Egg incubator equipped with automatic rotator, digital thermostat, temperature and humidity controls</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Engraving cutter</td>
			<td>DREMEL</td>
			<td style="width:100px;"># 108</td>
			<td>Used to drill the egg shell</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Extra fine Graefe forceps, curved</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td style="width:100px;"># 11151-10</td>
			<td style="width:406px;">Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Extra fine Graefe forceps, straight</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td style="width:100px;"># 11150-10</td>
			<td style="width:406px;">Used to graft DRG onto the CAM on day 8 and to harvest CAM tissue on day 17</td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;width:255px;">Fertilized Lohmann White Leghorn eggs</td>
			<td></td>
			<td style="width:100px;"></td>
			<td style="width:406px;">Fertilized eggs at early fertilization days, preferably on first day post-fertilization. Eggs used in this protocol are from Michigan State University Poultry Farm.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">Filter Forceps</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td style="width:100px;"># XX6200006P</td>
			<td>Blunt forceps used to remove the egg shell</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">Fine surgical straight sharp scissor</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td style="width:100px;">#14060-09</td>
			<td>Used to harvest the CAM tissue on day 17</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:255px;">HBSS (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:100px;"># 14025-092</td>
			<td>Hank`s Balanced Salt Solution</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:255px;">HI FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:100px;"># 10082-147</td>
			<td>Heat-inactivated Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:255px;">Paraffin wax membrane</td>
			<td>Parafilm laboratory film</td>
			<td style="width:100px;"># PM-996</td>
			<td>Used to&#160; temporarily cover the egg openings until DRG grafting on day 8</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:255px;">PBS (1x) pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:100px;"># 10010-023</td>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:255px;">Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td style="width:100px;"># 15140-122</td>
			<td>10,000 Units/mL Penicilin, 10,000 &#181;g/mL Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:36px;width:255px;">PFA (paraformaldehyde solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:100px;"># P6148-1KG</td>
			<td>Dilute in water to make a 4% PFA solution</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:255px;">Sprague Dawley rats (females)</td>
			<td>Charles River laboratories</td>
			<td style="width:100px;">Strain code: 001</td>
			<td>6-7 weeks old (190-210g in weight)</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:255px;">Tegaderm Transparent Film Dressing</td>
			<td>3M</td>
			<td style="width:100px;"># 9505W</td>
			<td>Sterile, 6x7cm, used to cover the egg openings during incubation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the chick chorioallantoic membrane in vivo model to assess perineural invasion in head and neck cancer

Perineural आक्रमण एक phenotype जिसमें कैंसर चारों ओर या नसों पर आक्रमण है. यह सिर और गर्दन स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा और अन्य कैंसर के लिए गरीब नैदानिक परिणाम के साथ जुड़ा हुआ है. यंत्रविज्ञानीय अध्ययनों से पता चला है कि नसों और ट्यूमर कोशिकाओं के बीच आणविक क्रॉसटॉक शारीरिक संपर्क से पहले होता है। वहाँ केवल विवो मॉडल में कुछ perineural आक्रमण का अध्ययन करने के लिए कर रहे हैं, विशेष रूप से जल्दी प्रगति की जांच करने के लिए, शारीरिक तंत्रिका ट्यूमर बातचीत होने से पहले. चिक कोरियोएलेंटोइक झिल्ली मॉडल का उपयोग कैंसर आक्रमण का अध्ययन करने के लिए किया गया है, क्योंकि कोरियोनिक उपकला की तहखाने झिल्ली मानव उपकला ऊतक की नकल करती है। यहाँ हम chi chorioallantoic झिल्ली मॉडल perineural आक्रमण की जांच करने के लिए repurposed, grafting चूहे पृष्ठीय जड़ Ganglia और मानव सिर और गर्दन स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा कोशिकाओं को chorionic उपकला पर. हम प्रदर्शन किया है कि कैसे इस मॉडल कैंसर कोशिकाओं की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए विवो में तंत्रिका ऊतक आक्रमण करने के लिए उपयोगी हो सकता है.

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The Chick Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Assess Perineural Invasion in Head and Neck Cancer

Perineural आक्रमण सिर और गर्दन स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा और अन्य ट्यूमर के लिए एक आक्रामक phenotype है. लड़की chorioallantoic झिल्ली मॉडल एंजियोजेनेसिस, कैंसर आक्रमण, और मेटास्टेसिस का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। यहाँ हम कैसे इस मॉडल vivo में perineural आक्रमण का आकलन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है प्रदर्शन.

सिर और गर्दन के कैंसर में Perineural आक्रमण का आकलन करने के लिए Vivo मॉडल में चिक Chorioallantoic झिल्ली

Perineural invasion is a phenotype in which cancer surrounds or invades the nerves. It is associated with poor clinical outcome for head and neck squamous ...

यह प्रोटोकॉल ट्यूमर कोशिकाओं और नसों और कैंसर में तंत्रिका आक्रमण के आणविक मार्गों के अध्ययन के बीच जल्दी बातचीत के वीवो अध्ययन में अनुमति देता है। इस तकनीक के मुख्य फायदे एक ही प्रयोग में पेरिन्यूरल आक्रमण और अन्य कैंसर फेनोटाइप का अध्ययन करने की क्षमता के साथ कम प्रायोगिक समय है। पहली बार इस तकनीक की कोशिश करने से पहले, हम दोनों प्रक्रियाओं के लिए अपनी तकनीक को अनुकूलित करने के लिए वाणिज्यिक गैर-निषेचित अंडे ड्रिलिंग का अभ्यास करने और पृष्ठीय जड़ गैंगलिया की कटाई करने की सलाह देते हैं।प्रक्रिया का प्रदर्शन मिन लियू, मेरी प्रयोगशाला से एक अनुसंधान सहयोगी होगा । प्रति घंटा रोटेशन के साथ आठ दिनों के लिए निषेचन के बाद पहले दिन पर 38 डिग्री सेल्सियस और 54% आर्द्रता पर एक अंडे ह्यूमिडाइज़िंग इनक्यूबेटर में प्रति प्रायोगिक समूह प्रति छह वाणिज्यिक रोगजनक मुक्त निषेचित अंडे इनक्यूबेटिंग द्वारा शुरू करें। आठ दिन, 70% इथेनॉल के साथ एक इच्छाकृत चूहे की पृष्ठीय त्वचा को साफ करें और रीढ़ को हटाने के लिए कैंची का उपयोग करें।गर्भाशय ग्रीवा, छाती, और काठ क्षेत्रों को अलग करें और ऊतक के नमूनों को हाइड्रेटेड रखने के लिए पीबीएस के साथ 10 सेंटीमीटर कल्चर डिश में रीढ़ के वर्गों को रखें। नाजुक हड्डी कैंची का उपयोग करना, पृष्ठीय और वेंट्रल पहलुओं में वक्ष और गर्भाशय ग्रीवा कशेरुकी हड्डियों को खोलने के लिए दो पार्श्व हिस्सों में रीढ़ को अलग करने और ताजा PBS के साथ एक साफ 10 सेंटीमीटर पकवान में ऊतक वर्गों जगह है । संदंश का उपयोग करके, पृष्ठीय जड़ गैंगलियन की कल्पना करने के लिए कशेरुकी हड्डियों से रीढ़ की हड्डी को धीरे-धीरे करें।प्रत्येक गैंगलियन के तहत आयोजित ठीक संदंश की एक जोड़ी के सुझावों को रखने, ऊतक समझ और यह हड्डी गुहा जिसमें यह दर्ज की गई है से खींच । कटाई के तुरंत बाद, प्रत्येक गैंगलियन को 2% पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन या पेन-स्ट्रेप और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम या एफबीएस के साथ पूरक डीएमईएम संस्कृति माध्यम में रखें ताकि तंत्रिका ऊतकों के बैक्टीरियल संदूषण को रोकने में मदद मिल सके। जब सभी गैंगलिया को काटा गया है, तो ऊतकों को एक नई संस्कृति डिश में स्थानांतरित करें जिसमें ताजा डीएमईएम संस्कृति माध्यम 2% पेन-स्ट्रीप प्लस 10% एफबीएस और 1.2 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर लाल फ्लोरोसेंट डाई के सेल कल्चर इनक्यूबेटर में एक घंटे की इनक्यूबेशन के लिए पूरक है।पृष्ठीय जड़ गैंगलियन भ्रष्टाचार के लिए अंडे तैयार करने के लिए, एक लैमिनार प्रवाह कैबिनेट में प्रकाश को मंद करें और हल्के स्रोत की ओर स्वाभाविक रूप से होने वाली हवा थैली के साथ अंडे को पकड़ें, लड़की व्यवहार्यता और भ्रूणीय चरण की जांच करने के लिए प्रत्येक अंडे को ट्रांसलिमिनेट करें। अंडे की झिल्ली से जुड़े एक अंधेरे चलती पोत के रूप में कोरियोलाएंटोनिक झिल्ली के लिए विकासशील भ्रूण के लगाव की पहचान करें और इस क्षेत्र में हस्तक्षेप से बचने के लिए लगाव को चिह्नित करने के लिए एक पेंसिल का उपयोग करें। एक ऑपरेटिंग विंडो क्षेत्र के रूप में कार्य करने के लिए भ्रूण लगाव से कम से कम दो सेंटीमीटर में एक अच्छी तरह से संवहनी क्षेत्र में 1.5 सेंटीमीटर क्षेत्र ड्रा करें और ऑपरेटिंग विंडो से लगभग एक सेंटीमीटर कम संवहनी क्षेत्र में 0.5 सेंटीमीटर वर्ग आकर्षित करें।फिर वायु थैली क्षेत्र के केंद्र को चिह्नित करें। इसके बाद, चिह्नित वर्ग के भीतर अंडे के छेद को ध्यान से ड्रिल करने के लिए तीन मिलीमीटर व्यास बिट के साथ एक रोटरी उपकरण और नक्काशी ड्रिल का उपयोग करें। खोल के नीचे सफेद बाहरी अंडे के खोल झिल्ली को हटाने के बिना अंडे के खोल को हटाने के लिए कुंद संदंश का उपयोग करें।ड्रिल का उपयोग सावधानी से एयर सैक क्षेत्र में चिह्नित क्रॉस में एक पिनपॉइंट ड्रिल वेफोरेशन बनाने के लिए करें ताकि खोल को तोड़ने या नुकसान पहुंचाए बिना अंडे में एयरफ्लो की अनुमति दी जा सके और बरकरार बाहरी अंडे के खोल झिल्ली पर स्क्वायर ओपनिंग में एचबीबीएस के 30 माइक्रोलीटर जोड़ें। 30 गेज सुई का उपयोग करके, वर्ग क्षेत्र के भीतर बाहरी झिल्ली में एक तुच्छ छिद्र बनाएं। इसके बाद, हवा की थैली की कल्पना करने के लिए अंडे को प्रकाश स्रोत तक पकड़ें और एक आईड्रॉपर रबर बल्ब पर दबाव लागू करें।आंखों की बूंद बल्ब को हवा की थैली के भीतर छोटे छिद्र पर रखें और बल्ब पर दबाव छोड़ें जब तक कि ऑपरेटिंग विंडो क्षेत्र के भीतर बाहरी झिल्ली और कोरियोलाएंटोनिक झिल्ली का पृथक्करण इस चरण को दोहराते हुए देखा जाता है जब तक झिल्ली का पूर्ण पृथक्करण प्राप्त नहीं हो जाता है। जब सभी अंडों को एक ही तरीके से संशोधित किया गया है, तो बाहरी अंडे के झिल्ली को तोड़ने के लिए ध्यान न रखते हुए एक अंडे में परिपत्र ऑपरेटिंग विंडो ड्रिल करें और खोल से किसी भी ढीले कणों को हटाने के लिए चिपकने वाले टेप के टुकड़े के चिपचिपा पक्ष का उपयोग न करें। कुंद संदंश का उपयोग करना, ड्रिल क्षेत्र से अंडे के खोल को हटा दें जिसके बाद बाहरी अंडे के खोल झिल्ली ने प्रदूषण को कम करने के लिए अंडे के अंदर छोटे खोल कणों को पेश न करने का ख्याल रखा।जब अंडे के तेल और बाहरी झिल्ली को प्रदर्शन के रूप में हटा दिया गया है, तो अंडे को पैराफिन मोम झिल्ली के साथ कवर करें और अंडे को बिना रोटेशन के अंडे इनक्यूबेटर में वापस रखें जब तक कि पृष्ठीय जड़ गैंगलिया ग्राफ्टिंग के लिए तैयार न हो जाए। कोरियोलाएंटोइक झिल्ली पर एक पृष्ठीय रूट गैंगलियन की ग्राफ्टिंग के लिए, संस्कृति पकवान में एक गैंगलियन को ध्यान से समझने के लिए ठीक बाँझ संदंश का उपयोग करें और ताजा एचबीबीएस के कंटेनर में ऊतक को धीरे से धोएं। एक अंडे की कोरियोलाएंटोनिक झिल्ली पर गैंगलियन रखें झिल्ली को पंचर न करें और बाँझ पारदर्शी फिल्म ड्रेसिंग के साथ अंडे के सभी उद्घाटन को कवर करें।जब सभी अंडों को ग्राफ्ट किया गया हो, तो उन्हें बिना रोटेशन के दो दिनों के लिए ह्यूमिडिफाइंग अंडा इनक्यूबेटर में वापस कर दें। इनक्यूबेशन के अंत में, अंडे को लैमिनार प्रवाह कैबिनेट में स्थानांतरित करें और पारदर्शी फिल्म ड्रेसिंग खोलने के लिए कैंची और संदंश का उपयोग करें। इसके बाद, गंगलिया और कोशिकाओं के बीच एक समान दूरी रखते हुए प्रत्येक पृष्ठीय जड़ गैंगलियन से प्रत्येक अंडे की कोरियोलाएंटोनिक झिल्ली पर एचबीबीएस के पांच माइक्रोलीटर में 0.5 से 1 मिलियन फ्लोरोसेंटली लेबल ट्यूमर कोशिकाओं को जोड़ें।फिर अंडों को नई फिल्म ड्रेसिंग से ढक कर अंडे को बिना रोटेशन के सात दिन के लिए अंडे इनक्यूबेटर में वापस कर दें। इनक्यूबेशन के अंत में, अंडे को प्रयोगशाला बेंच शीर्ष पर रखें। प्रत्येक अंडे की फिल्म ड्रेसिंग को छिद्रित करने के लिए एक सिरिंज का उपयोग करें और कटाई प्रक्रिया को सुविधाजनक बनाने के लिए ऊतक को थोड़ा कठोर करने के लिए प्रत्येक कोरियोलाएंटोनिक झिल्ली पर 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के लगभग 300 माइक्रोलीटर लागू करें।कैंची का उपयोग करके, अंडे के ऊपरी आधे हिस्से को कोरियोलाएंटोइक झिल्ली से जुड़े के साथ हटा दें। खोल के आकार को कम करने के लिए व्यास में लगभग तीन सेंटीमीटर के लिए कम करने के लिए chorioallantoic झिल्ली के हिस्से को ध्यान में रखते हुए जहां पृष्ठीय जड़ गैंगलियन और ट्यूमर कोशिकाओं को खोल टुकड़े के केंद्र के भीतर कलम किया गया । फिर ठीक संदंश के साथ कोरियोलाएंटोनिक झिल्ली को समझें और अंडे के कोयले से ऊतक को छह-अच्छी तरह से प्लेट के एक कुएं में स्थानांतरित करने के लिए अलग कर दें जिसमें 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के दो मिलीलीटर शामिल हैं जो अच्छी तरह से पृष्ठीय रूट गैंगलियन और ट्यूमर सेल साइड अप करते हैं।कोरियोलाएंटोनिक झिल्ली में पृष्ठीय जड़ गैंगलिया का एकीकरण महत्वपूर्ण है क्योंकि कोरियोलाएंटोइक झिल्ली प्रयोग के दौरान पृष्ठीय जड़ गैंगलियन ऊतक को पोषण प्रदान करती है। सूक्ष्म रूप से, पृष्ठीय जड़ गैंगलियन को कोरियोलाएंटोइक झिल्ली के संयोजी ऊतक के भीतर देखा जाता है और रक्त वाहिकाओं को अक्सर पृष्ठीय जड़ गैंगलियन ऊतक के अंदर देखा जाता है जो यह सुझाव देता है कि कोरियोलाएंटोइक झिल्ली रक्त आपूर्ति ग्राफ्ट किए गए ऊतकों का पोषण कर रही है। प्रत्यारोपित ट्यूमर की पहचान हेमेटॉक्सीलिन और ियोसिन स्टेनिंग द्वारा कोरियोलाएंटोनिक झिल्ली पर भी की जाती है।कितना आक्रमण मौजूद है पर निर्भर करता है, ट्यूमर कई ट्यूमर कनेक्टिव ऊतक पर हमला द्वीपों के लिए कोई के साथ मौजूद हो सकता है । इस प्रतिनिधि प्रयोग में, मर्ज फ्लोरेसेंस विश्लेषण के साथ इमेजिंग ने ट्यूमर को नियंत्रित करने की तुलना में गैलिन रिसेप्टर 2 को व्यक्त करने पर ट्यूमर कोशिकाओं के साथ ग्राफ्ट किए गए कोरियोलाएंटोइक झिल्ली में पृष्ठीय जड़ गैंगलियन के आक्रमण में वृद्धि का खुलासा किया। परिणीति आक्रमण के वीवो मॉडल में यह उपयोगी और लागत प्रभावी सीमित संसाधनों वाली प्रयोगशालाओं द्वारा भी दोहराई जा सकती है।

Research

JoVE Journal

Medicine

The Chick Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Assess Perineural Invasion in Head and Neck Cancer

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

मौखिक स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा के एक Orthotopic माउस मॉडल में ट्यूमर सेल आक्रमण की मल्टी फोटॉन इमेजिंग

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane CAM Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

<em&gt; ओवो में</emHepatocellular कार्सिनोमा के एक कुशल Xenograft मॉडल के रूप में&gt; चिकी chorioallantoic झिल्ली (सीएएम) परख

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and ...

Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis

चिकन में एक मानव मल्टीपल मायलोमा xenograft मॉडल की स्थापना ट्यूमर के विकास, आक्रमण और angiogenesis अध्ययन करने के लिए

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the ...

Chick Heart Invasion Assay for Testing the Invasiveness of Cancer Cells and the Activity of Potentially Anti-invasive Compounds

परीक्षण के लिए चिकी हार्ट आक्रमण परख कैंसर कोशिकाओं के invasiveness और संभावित विरोधी आक्रामक यौगिकों की गतिविधि

The goal of the chick heart assay is to offer a relevant organ culture method to study tumor invasion in three dimensions. The assay can distinguish ...

A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting

कैंसर कोशिका उपगोल परख एक 3 डी सेटिंग में आक्रमण का आकलन करने के लिए

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential.  Most traditional assays, however, do not examine these ...

In Vivo Morphometric Analysis of Human Cranial Nerves Using Magnetic Resonance Imaging in Meni&#232;re's Disease Ears and Normal Hearing Ears

In Vivo Morphometric Analysis of Human Cranial Nerves Using Magnetic Resonance Imaging in MeniÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¨re's Disease Ears and Normal Hearing Ears

Vivo में मानव कपाल नसों के Morphometric विश्लेषण Menière's रोग कान और सामांय सुनने के कान में चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग का उपयोग

Analysis of neural structures in Meni&#232;re's Disease (MD) is of importance, since a loss of such structures has previously been proposed for this ...

Surgical Labyrinthectomy of the Rat to Study the Vestibular System

Vestibular प्रणाली का अध्ययन करने के लिए चूहे की सर्जिकल Labyrinthectomy

To study the vestibular system or the vestibular compensation process, a number of methods have been developed to cause vestibular damage, including ...

Porcine As a Training Module for Head and Neck Microvascular Reconstruction

सिर और गर्दन Microvascular पुनर्निर्माण के लिए एक प्रशिक्षण मॉड्यूल के रूप में सुअर का

Live models that resemble surgical conditions of humans are needed for training free-flap harvesting and anastomosis. Animal models for training purposes ...

Learning Modern Laryngeal Surgery in a Dissection Laboratory

एक विच्छेदन प्रयोगशाला में आधुनिक Laryngeal सर्जरी सीखना

Surgery for laryngeal malignancies requires millimetric accuracy from the different endoscopic and open techniques available. Practice of this surgery is ...

Preparation of Decellularized Kidney Scaffolds in Rats

चूहों में डिसेलुलराइज्ड किडनी मचान की तैयारी

Tissue engineering is a cutting-edge discipline in biomedicine. Cell culture techniques can be applied for regeneration of functional tissues and organs ...