Name: toxicity study of zinc oxide nanoparticles in cell culture and in drosophila melanogaster
Uploaded: 2019-09-19T13:30:00
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Die Studie wurde durch die Stipendiennummer R706-000-043-490 unterstützt. Die Studie stellt nicht die Ansicht des Stipendiaten dar.

1. Fluoreszenz aktivierte Zellsortierung (FACS) Analyse von lived/Fixed Cells
<ol><li>Sonicate ZnO NPs in Suspension für 15 min.</li>
	<li>Bereiten Sie ZnO NPs in verschiedenen Konzentrationen (z.B. 0, 10, 25, 50,100 und 200 g/ml) mit 1 mg/ml ZnO NP-Stammlösung zur Behandlung kultivierter Zellen vor.</li>
	<li>Seed MRC5 menschliche Lungen-Fibroblasten (1 x 105 Zellen/gut) auf eine 6-Well-Kulturplatte pro Tag im Voraus, und dann behandeln Sie die Zellen mit 2 ml ZnO NPs (in Triplicates) für 8 h, 16 h und 2...

<ol>
	<li>Kim, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+of+100+nm+zinc+oxide+nanoparticles:+a+report+of+90-day+repeated+oral+administration+in+Sprague+Dawley+rats.">Toxicity of 100 nm zinc oxide nanoparticles: a report of 90-day repeated oral administration in Sprague Dawley rats.</a> International Journal of Nanomedicine. 9 Suppl 2, 109-126 (2014).</li><li>Xie, Y., He, Y., Irwin, P. L., Jin, T., Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibacterial+activity+and+mechanism+of+action+of+zinc+oxide+nanoparticles+against+Campylobacter+jejuni.">Antibacterial activity and mechanism of action of zinc oxide nanoparticles against Campylobacter jejuni.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77, 2325-2331 (2011).</li><li>Colvin, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+environmental+impact+of+engineered+nanomaterials.">The potential environmental impact of engineered nanomaterials.</a> Nature Biotechnology. 21, 1166-1170 (2003).</li><li>De Angelis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+ZnO+and+TiO(2)+nanoparticles:+physicochemical+characterisation+and+toxicological+effects+on+human+colon+carcinoma+cells.">Comparative study of ZnO and TiO(2) nanoparticles: physicochemical characterisation and toxicological effects on human colon carcinoma cells.</a> Nanotoxicology. 7, 1361-1372 (2013).</li><li>Johnson, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+exposure+to+ZnO+nanoparticles+induces+autophagic+immune+cell+death.">Acute exposure to ZnO nanoparticles induces autophagic immune cell death.</a> Nanotoxicology. 9, 737-748 (2015).</li><li>Singh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoGenotoxicology:+the+DNA+damaging+potential+of+engineered+nanomaterials.">NanoGenotoxicology: the DNA damaging potential of engineered nanomaterials.</a> Biomaterials. 30, 3891-3914 (2009).</li><li>Song, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+dissolved+zinc+ion+and+reactive+oxygen+species+in+cytotoxicity+of+ZnO+nanoparticles.">Role of the dissolved zinc ion and reactive oxygen species in cytotoxicity of ZnO nanoparticles.</a> Toxicology Letters. 199, 389-397 (2010).</li><li>Wahab, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZnO+nanoparticles+induced+oxidative+stress+and+apoptosis+in+HepG2+and+MCF-7+cancer+cells+and+their+antibacterial+activity.">ZnO nanoparticles induced oxidative stress and apoptosis in HepG2 and MCF-7 cancer cells and their antibacterial activity.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 117, 267-276 (2014).</li><li>Namvar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+effects+of+biosynthesized+zinc+oxide+nanoparticles+on+murine+cell+lines.">Cytotoxic effects of biosynthesized zinc oxide nanoparticles on murine cell lines.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative. 2015, (2015).</li><li>Wong, S. W., Leung, P. T., Djurisic, A. B., Leung, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicities+of+nano+zinc+oxide+to+five+marine+organisms:+influences+of+aggregate+size+and+ion+solubility.">Toxicities of nano zinc oxide to five marine organisms: influences of aggregate size and ion solubility.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 396, 609-618 (2010).</li><li>Hua, J., Vijver, M. G., Richardson, M. K., Ahmad, F., Peijnenburg, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle-specific+toxic+effects+of+differently+shaped+zinc+oxide+nanoparticles+to+zebrafish+embryos+(Danio+rerio).">Particle-specific toxic effects of differently shaped zinc oxide nanoparticles to zebrafish embryos (Danio rerio).</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 33, 2859-2868 (2014).</li><li>Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+ZnO+nanoparticles+exposure+induces+developmental+toxicity,+oxidative+stress+and+DNA+damage+in+embryo-larval+zebrafish.">Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish.</a> Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).</li><li>Alaraby, M., Annangi, B., Hernandez, A., Creus, A., Marcos, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+study+of+the+harmful+effects+of+ZnO+nanoparticles+using+Drosophila+melanogaster+as+an+in+vivo+model.">A comprehensive study of the harmful effects of ZnO nanoparticles using Drosophila melanogaster as an in vivo model.</a> Journal of Hazardous Materials. 296, 166-174 (2015).</li><li>Rand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophotoxicology:+the+growing+potential+for+Drosophila+in+neurotoxicology.">Drosophotoxicology: the growing potential for Drosophila in neurotoxicology.</a> Neurotoxicology and Teratology. 32, 74-83 (2010).</li><li>Ong, C., Yung, L. Y., Cai, Y., Bay, B. H., Baeg, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+as+a+model+organism+to+study+nanotoxicity.">Drosophila melanogaster as a model organism to study nanotoxicity.</a> Nanotoxicology. 9, 396-403 (2015).</li><li>Hoffmann, J. A., Reichhart, J. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+sequence+to+phenotype:+reverse+genetics+in+Drosophila+melanogaster.">From sequence to phenotype: reverse genetics in Drosophila melanogaster.</a> Nature Reviews Genetics. 3, 189-198 (2002).</li><li>Adams, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+sequence+of+Drosophila+melanogaster.">The genome sequence of Drosophila melanogaster.</a> Science. 287, 2185-2195 (2000).</li><li>Ong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+nanoparticles+disrupt+germline+stem+cell+maintenance+in+the+Drosophila+testis.">Silver nanoparticles disrupt germline stem cell maintenance in the Drosophila testis.</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li><li>Alaraby, M., Demir, E., Hernandez, A., Marcos, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+potential+harmful+effects+of+CdSe+quantum+dots+by+using+Drosophila+melanogaster+as+in+vivo+model.">Assessing potential harmful effects of CdSe quantum dots by using Drosophila melanogaster as in vivo model.</a> Science of the Total Environment. 530-531, 66-75 (2015).</li><li>Barik, B. K., Mishra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+as+a+potential+teratogen:+a+lesson+learnt+from+fruit+fly.">Nanoparticles as a potential teratogen: a lesson learnt from fruit fly.</a> Nanotoxicology. , 1-27 (2018).</li><li>Jovanovic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+a+human+food+additive,+titanium+dioxide+nanoparticles+E171,+on+Drosophila+melanogaster+-+a+20+generation+dietary+exposure+experiment.">The effects of a human food additive, titanium dioxide nanoparticles E171, on Drosophila melanogaster - a 20 generation dietary exposure experiment.</a> Scientific Reports. 8, (2018).</li><li>Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Toxicity+of+Nanoparticles+to+Human+Endothelial+Cells.">The Toxicity of Nanoparticles to Human Endothelial Cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1048, 59-69 (2018).</li><li>Akhtar, M. J., Ahamed, M., Alhadlaq, H. A., Alshamsan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+ROS+scavenging+and+antioxidant+signalling+by+redox+metallic+and+fullerene+nanomaterials:+Potential+implications+in+ROS+associated+degenerative+disorders.">Mechanism of ROS scavenging and antioxidant signalling by redox metallic and fullerene nanomaterials: Potential implications in ROS associated degenerative disorders.</a> Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1861, 802-813 (2017).</li><li>Akter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+on+silver+nanoparticles-induced+cytotoxicity:+Physicochemical+properties+and+perspectives.">A systematic review on silver nanoparticles-induced cytotoxicity: Physicochemical properties and perspectives.</a> Journal of Advanced Research. 9, 1-16 (2018).</li><li>Vecchio, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fruit+fly+in+the+nanoworld:+once+again+Drosophila+contributes+to+environment+and+human+health.">A fruit fly in the nanoworld: once again Drosophila contributes to environment and human health.</a> Nanotoxicology. 9, 135-137 (2015).</li><li>Marino, G., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+apoptotic+phosphatidylserine+exposure.">Mechanisms of apoptotic phosphatidylserine exposure.</a> Cell Research. 23, 1247-1248 (2013).</li><li>Stoddart, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Viability+Assays:+Introduction.">Cell Viability Assays: Introduction.</a> Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols. , (2011).</li><li>Yazdani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concerns+in+the+application+of+fluorescent+probes+DCDHF-DA,+DHR+123+and+DHE+to+measure+reactive+oxygen+species+in+vitro.">Concerns in the application of fluorescent probes DCDHF-DA, DHR 123 and DHE to measure reactive oxygen species in vitro.</a> Toxicology in Vitro. 30, 578-582 (2015).</li><li>Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+kinetics+of+dihydroethidium+fluorescence+with+superoxide+using+xanthine+oxidase+and+hypoxanthine+assay.">Analysis of kinetics of dihydroethidium fluorescence with superoxide using xanthine oxidase and hypoxanthine assay.</a> Annals of Biomedical Engineering. 41, 327-337 (2013).</li><li>Hartig, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+image+analysis+and+manipulation+in+ImageJ.">Basic image analysis and manipulation in ImageJ.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2013).</li></ol>

Um zu beurteilen, ob ZnO NP Apoptose in MRC5-Fibroblasten induzieren kann, verwenden wir Die durchflusszytometrie, um die Zellen vom nekrotischen oder apoptotischen Zelltod zu unterscheiden. In normalen lebenden Zellen wird Phosphatidylserin (PS) an der Zellmembran lokalisiert. Wenn Apoptose auftritt, wird PS in die extrazelluläre Packungsbeilage der Plasmamembran transziert, so dass die Bindung von Annexin V mit Fluorescein (FITC Annexin V)29gekennzeichnet ist. Andererseits ist das rotfluoreszie...

Nanotechnologie bezieht sich auf die Anwendung nanogroßer Materialien, die in allen wissenschaftlichen Bereichen verwendet werden, einschließlich Medizin, Materialwissenschaft und Biochemie. ZnO NPs, die für ihre ultraviolette Streuung, chemische Sensorik und antimikrobielle Eigenschaften sowie hohe elektrische Leitfähigkeit bekannt sind, werden beispielsweise bei der Herstellung verschiedener Konsumgüter wie Lebensmittelverpackungen, Kosmetika, Textilien, Kautschuke, Batterien, Katalysatoren für die Rückgasbehandlung von Kraftfahrzeugen und biomedizinische Anwendungen1,2,3.
Die aufkeimenden Anwendungen von ZnO NP-basierten Produkten, die zu einer erhöhten Exposition des Menschen gegenüber ZnO-NPs führen, haben jedoch Bedenken hinsichtlich ihrer möglichen nachteiligen Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit aufkommen lassen. Eine Reihe von in vitro zellulären Studien haben gezeigt, dass ZnO NPs oxidativen Stress, autophagiebedingte Zytotoxizität, Entzündung und Genotoxizität4,5,6,7,8 induzieren können . Insbesondere wird angenommen, dass die Toxizität von ZnO NPs durch die Auflösung von Zn zu freien Zn2+-Ionen sowie die Oberflächenreaktivität von ZnO verursacht wird, was zu den zellulären ionischen und metabolischen Ungleichgewichten führt, die mit einer beeinträchtigten ionischen Homöostase und Hemmung des Ionentransports4,7,9,10. Wichtig ist, dass Studien gezeigt haben, dass die Erzeugung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) einer der primären Mechanismen ist, die ZnO NPs-assoziierte Toxizität zugrunde liegen. Unzureichende antioxidative Aktivität nach ROS Beleidigung hat sich als verantwortlich für die Auslösung der Zytotoxizität und DNA-Schäden9. Die toxischen Wirkungen von ZnO NPs wurden auch in Tiermodellen berichtet, einschließlich Nagetier1, Zebrafisch11,12, sowie die wirbellose Drosophila13.
Drosophila dient als etabliertes alternatives Tiermodell für das Toxizitätsscreening chemischer Einheiten und Nanomaterialien (NMs)14,15. Wichtig ist, dass es ein hohes Maß an genetischer und physiologischer Ähnlichkeit zwischen dem Menschen und Drosophila gibt, was die Verwendung von Drosophila als In-vivo-Modell für die Bewertung biologischer Reaktionen auf Umweltschadstoffe wie NMs rechtfertigt. 16. Darüber hinaus gibt es viele Vorteile der Verwendung von Drosophila aufgrund seiner geringen Größe, kurze Lebensdauer, genetische Amenabilität, und einfache und kostengünstige Wartung. Darüber hinaus ist Drosophila weithin für die Erforschung der Genetik, Molekular- und Entwicklungsbiologie angenommen worden, seit sein vollständiges Genom vor Jahren im Jahr 2000 vollständig sequenziert wurde, wodurch es für eine Vielzahl von Hochdurchsatz-Screenings geeignet ist. und zur Behandlung ungelöster biologischer Fragen17,18,19,20,21. In den letzten Jahren, eine Reihe von Studien im Zusammenhang mit Immuntoxizität mit verschiedenen Arten von NPs in Drosophila wurden berichtet15,22,23,24. Dieses grundlegende neue Wissen aus den Studien mit Drosophila hat dazu beigetragen, mehr Einblicke in unser Verständnis der Nanotoxikologie zu geben.
ROS ist ein bekannter Schuldiger für Zytotoxizität und Genotoxizität, verursacht durch NPs, insbesondere metallbasierte NPs25. ROS sind sauerstoffhaltige chemische Spezies mit höheren reaktiven Eigenschaften als molekularer Sauerstoff. Freie Radikale wie Superoxid-Radikal (O2-) und sogar nicht-radikale Moleküle wie Wasserstoffperoxid (H2O2) können als ROS fungieren. Unter normalen physiologischen Bedingungen sind sie verpflichtet, zelluläre Homöostase26zu erhalten, jedoch kann übermäßige ROS aufgrund von Überproduktion oder Dysregulation des antioxidativen Abwehrsystems oxidativen Stress verursachen, was zu Schäden an Proteinen führen, Lipide und Desoxyribonukleinsäure (DNA)27. Zum Beispiel, wenn ROS-Spiegel erhöhen und Glutathion (GSH) Niveau sinkt gleichzeitig, Störung der Adenosintriphosphat (ATP) Synthese findet statt und Lactat-Dehydrogenase (LDH) Niveau steigt im Medium, gipfelnd in Zelltod27.
Hier bieten wir Protokolle für die Durchführung zellulärer und genetischer Analysen mit kultivierten Säugetierzellen und Drosophila, um die potenziellen Nebenwirkungen von ZnO NPs zu bestimmen. Abbildung 1zeigt eine Übersicht über die Methode zur Toxizitätsstudie von ZnO NPs .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15% Methyl 4-Hydroxybenzoate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cncCK6/TM3, Sb</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>a gift from Dr. Kerppola T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cornmeal, glucose, yeast brewer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyAn ADP with Summit Software</td>
			<td>DAKO</td>
			<td></td>
			<td>https://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydroethidium (Hydroethidine)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D11347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>556547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucolin</td>
			<td>Supermarket</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC5 human lung fibroblast</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#8217;s Drosophila medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21720-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vectashield antifade mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wild- type Canton-S; Sod2N308/CyO</td>
			<td>NIG-FLY</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Oxide Nanoparticles</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>721077</td>
			<td>Refer Sheet 2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

toxicity study of zinc oxide nanoparticles in cell culture and in drosophila melanogaster

Zinkoxid-Nanopartikel (ZnO NPs) haben eine breite Palette von Anwendungen, aber die Anzahl der Berichte über ZnO NP-assoziierte Toxizität hat in den letzten Jahren rapide zugenommen. Jedoch, Studien, die die zugrunde liegenden Mechanismen für ZnO NP-induzierte Toxizität aufklären, sind spärlich. Wir ermittelten die Toxizitätsprofile von ZnO NPs anhand von In-vitro- und In-vivo-Experimentalmodellen. Bei ZnO NP-exponierten MRC5-Lungenfibroblasten wurde eine signifikante Abnahme der Zelllebensfähigkeit beobachtet, was zeigt, dass ZnO NPs zytotoxische Wirkungen ausüben. In ähnlicher Weise, interessanterweise, Darm ausgesetzt ZnO NPs zeigte einen dramatischen Anstieg der reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in der Fruchtfliege Drosophila. Es sind eingehendere Studien erforderlich, um eine Risikobewertung für die verstärkte Nutzung von ZnO-NPs durch Verbraucher zu erstellen.

NP-exponierte Zellen wurden mit dem Zellfärbereagenz-Kit verarbeitet, gefolgt von der Zellsortierung mittels Durchflusszytometrie. ZnO NP-behandelte Zellen (unten, rechter Bereich) weisen einen höheren Prozentsatz früher (R3)/später apoptotischer Zellen (R6) auf als Kontrollzellen (R5, unten, links). Der nekrotische Zelltod wird durch R4 (oben, rechts) bezeichnet (Abbildung 2). Die Ergebnisse des FITC/Annexin V Assays auf ZnO NP-behandelten MRC-5-Fibrobla...

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Toxicity Study of Zinc Oxide Nanoparticles in Cell Culture and in Drosophila melanogaster

Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll zur Bewertung der toxikologischen Profile von Zinkoxid-Nanopartikeln (ZnO NPs), insbesondere der Art des Zelltodes in menschlichen MRC5-Lungenfibroblasten und der ROS-Bildung in der Fruchtfliege Drosophila.

Toxizitätsstudie von Zinkoxid-Nanopartikeln in der Zellkultur und bei Drosophila melanogaster

Zinc oxide nanoparticles (ZnO NPs) have a wide range of applications, but the number of reports on ZnO NP-associated toxicity has grown rapidly in recent ...

Unsere Methoden skizzieren eine einfache und wiederholte Methode zur Untersuchung der Nanotoxizität, wie z. B. die Untersuchung der Arten des Zelltodes und die Untersuchung der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies. Fluoreszenz aktivierte Zellsortierung ist ein strenges Format, das es uns ermöglicht, die Subpopulation von Zellen und die wachsenden verschiedenen Arten von Zelltod zu studieren. Die DHE-Sondenstudie ermöglicht es uns, reaktive Sauerstoffspezies zu erkennen und zu quantifizieren, gefolgt von Durchflusszytometrie, mikroskopischer Hochauflösender Bildgebung und koppelbasierter Fluoreszenzanalyse.Zunächst sollte eine Eppendorf-Röhre mit Zinkoxid-Nanopartikeln in Zinkoxid-Nanopartikel-Stammlösung 15 Minuten lang in einen Beschallungsmittelor gegeben werden. Bereiten Sie Zinkoxid-Nanopartikel in verschiedenen Konzentrationen mit einem Milligramm pro Milliliter Zinkoxid-Nanopartikelbestand vor. Dann, in einem Biosicherheitsschrank, Samen MRC5 menschliche Lunge Fibroblasten auf drei Sechs-Well-Kulturplatten in der Konzentration von einem mal 10 bis die fünften Zellen pro Brunnen.Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius. Nach einem Tag die Zellen acht Stunden, 16 Stunden oder 24 Stunden lang mit zwei Millilitern Zinkoxid-Nanopartikeln behandeln. Zu jedem Zeitpunkt die Zellen in einem 15-Milliliter-Zentrifugenrohr und Zentrifuge bei 300 mal g für fünf Minuten sammeln.Waschen Sie die Zellpellets zweimal mit phosphatgepufferter Saline, und setzen Sie die Zellen dann mit 1X Bindungspuffer wieder auf. Als nächstes fügen Sie fünf Mikroliter FITC Annexin V Fleck in fünf Mikroliter Propidium Iodid DNA-Färbung. Bebrüte die gebeizten Zellen 15 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln.Vor der Sortierung der Zellen durch Durchflusszytometrie, laden Sie die Proben mit einem zusätzlichen 400 Mikroliter 1X Bindungspuffer auf. Tabuulieren Sie das Balkendiagramm mit der erhaltenen Medianintensität. Verwenden Sie nun eine Pipette, um einen Milliliter Nanopartikel in verschiedenen Konzentrationen in Fläschchen hinzuzufügen, gefolgt von neun Millilitern Fliegenfutter, um eine Endkonzentration von 0,1 Milligramm pro Milliliter, 0,25 Milligramm pro Milliliter oder 0,5 Milligramm pro Milliliter Zinkoxid-Nanopartikel zu erreichen.Pipette nach oben und unten, um gründlich zu mischen. Fliegennahrung, die Zinkoxid-Nanopartikel enthält, vor Gebrauch mindestens zwei bis drei Stunden abkühlen lassen. Dann anästhesieren erwachsene männliche und weibliche Fliegen in einer Durchstechflasche mit Kohlendioxid, und führen Fünf männliche Fliegen und fünf weibliche Fliegen in jede Durchstechflasche für fünf Tage.Lassen Sie sie sich paaren und legen Sie Eier auf der Oberfläche des Lebensmittels. Nach der Anästhesisierung die Elternfliegen entfernen und die Eier bei Raumtemperatur weiterentwickeln lassen, die aus vier verschiedenen Entwicklungsstadien besteht. Embryonal, Larven, Pupal und Erwachsenenstadium.Nach 72 bis 120 Stunden entwickeln sich frisch gelegte Eier zu späten dritten Insternlarven. Mit Zangen, sammeln Sie die Larven von der Wand der Fläschchen für Analysen. In einem Brunnen einer Sezierschale mit Dissektionsmedium oder PBS die Larven in die Lösung geben.Verwenden Sie unter dem Stereomikroskop die Spitze der Zange, um ein winziges Loch zu bilden, und brechen Sie die Nagelhautschicht der Larven auf. Ziehen Sie vorsichtig den Darm heraus. Legen Sie den Darm in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr mit Schneiders Drosophila Medium.Fügen Sie einen Mikroliter der DHE-Sonde hinzu und in der Dunkelheit bei Raumtemperatur für 10 Minuten inkubieren. Waschen Sie den Darm dreimal mit Schneiders Medium alle fünf Minuten. Montieren Sie den Darm auf Glasschlitten und liefern Sie mit 10 Mikroliter Antifade-Montagemedium, das DAPI enthält.Erfassen Sie Bilder unter einem konfokalen Mikroskop. Um die Fluoreszenz zu messen, importieren Sie die erfassten Fluoreszenzbilder, die mit Fluoreszenzmikroskopie oder konfokaler Laserscanmikroskopie aufgenommen wurden, in die ImageJ-Software. Klicken Sie auf das Analysemenü, und wählen Sie die festgelegten Messungen aus.Wählen Sie die Ausgabekennzahl aus, z. B. die integrierte Flächenintensität und den mittleren Grauwert. Wählen Sie einen Bereich ohne Fluoreszenz aus, um den Hintergrund festzulegen. Klicken Sie auf Maß.Exportieren Sie die Daten in die Kalkulationstabelle, und bestimmen Sie die korrigierte Gesamtzellfluoreszenz. Erstellen Sie ein Balkendiagramm, und führen Sie statistische Analysen durch. In dieser Studie weisen Zinkoxid-Nanopartikel-behandelte Zellen einen höheren Anteil an frühen R3- oder späten apoptotischen R6-Zellen auf als Kontrollzellen R5. Nekrotische Zelltod wurde mit R4 bezeichnet. Der aus der Drosophila-Larve gewonnene Darm wurde in drei diskrete Domänen unterschiedlicher Entwicklungsherkunft unterteilt.Nämlich das Vorgut, das Midgut und das Hintergut. DHE-Aktie neigt dazu, ziemlich schnell zu verfallen, so seien Sie vorsichtig mit der Aktienlösung, die Sie verwenden. Alternativ können Sie auch andere Sonden ausprobieren, z. B. die Zelle Roche, die entwickelt wurde, um den intrazellulären ROS in grünen Signalen zu erkennen, und das ist fotoierbarer als die DHE.Unser Protokoll bietet einen allgemeinen Überblick über die Untersuchung der intrazellulären ROS-Produktion und die Quantifizierung des ROS-Levels für Nanotoxizitätsstudien. DMSO ist dafür bekannt, ein besseres Lösungsmittel für DHE als das PBS zu sein. DMSO ist jedoch giftig.Daher möchte ich dem Benutzer raten, den gesamten Prozess für das Studium auf maximal 30 Minuten zu beschränken. Dies liegt daran, dass Sie ein falsch positives Ergebnis beobachten können, da DMSO den Zelltod verursachen kann.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Toxicity Study of Zinc Oxide Nanoparticles in Cell Culture and in Drosophila melanogaster

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Retrovirale Transduktion von T-Zell-Rezeptoren in Maus-T-Zellen

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an ...

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

Systemische bakterielle Infektion und Immunabwehr Phänotypen in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of ...

Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing

Kupffer Zelle Isolierung für die Toxizität von Nanopartikeln Testing

The large majority of in vitro nanotoxicological studies have used immortalized cell lines for their practicality. However, results from nanoparticle ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophilen-Isolierung und Analyse zur Bestimmung ihrer Rolle in der Lymphom-Zellempfindlichkeit therapeutische Mittel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Bewertung der Wirksamkeit und Toxizität von RNAs Targeting HIV-1-Produktion für den Einsatz in Gene oder Arzneimitteltherapie

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

Extraktion von Hemocytes aus Drosophila Melanogaster Larven für mikrobielle Infektionen und Analyse

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Charakterisierung der Thymus-abhängig und Thymus-unabhängige Immunglobulin Isotype Antworten bei Mäusen mit Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

Gründung der Virusinfektion und Analyse von Host-Virus-Wechselwirkung in Drosophila Melanogaster

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Menschliche Colonoid Monolagen Wechselwirkungen zwischen Erreger, Kommensalen und Host Darmepithel zu studieren

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...