Name: toxicity study of zinc oxide nanoparticles in cell culture and in drosophila melanogaster
Uploaded: 2019-09-19T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Toxicity Study of Zinc Oxide Nanoparticles in Cell Culture and in Drosophila melanogaster at JoVE.com

המחקר היה נתמך על ידי מספר מענק R706-000-043-490. המחקר אינו מייצג את ההשקפה של נותן החסות המענק.

1. מיון תאים פלואורסצנטית מופעל (FACS) ניתוח על תאים חיים/קבועים
<ol><li>Sonicate ZnO NPs בהשעיה עבור 15 דקות.</li>
	<li>הכנת NPs בריכוזים שונים (g, 0, 10, 25, 50,100 ו 200 μg/mL) באמצעות 1 מ"ג/mL ZnO NP מניות פתרון לטיפול בתאים מתורבתים.</li>
	<li>זרעים MRC5 בריאות האדם (1 x 105 תאים/גם) על צלחת 6-היטב התרבות ביום מראש, ולאחר מכן לטפל ?...

<ol>
	<li>Kim, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+of+100+nm+zinc+oxide+nanoparticles:+a+report+of+90-day+repeated+oral+administration+in+Sprague+Dawley+rats.">Toxicity of 100 nm zinc oxide nanoparticles: a report of 90-day repeated oral administration in Sprague Dawley rats.</a> International Journal of Nanomedicine. 9 Suppl 2, 109-126 (2014).</li><li>Xie, Y., He, Y., Irwin, P. L., Jin, T., Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibacterial+activity+and+mechanism+of+action+of+zinc+oxide+nanoparticles+against+Campylobacter+jejuni.">Antibacterial activity and mechanism of action of zinc oxide nanoparticles against Campylobacter jejuni.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77, 2325-2331 (2011).</li><li>Colvin, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+environmental+impact+of+engineered+nanomaterials.">The potential environmental impact of engineered nanomaterials.</a> Nature Biotechnology. 21, 1166-1170 (2003).</li><li>De Angelis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+ZnO+and+TiO(2)+nanoparticles:+physicochemical+characterisation+and+toxicological+effects+on+human+colon+carcinoma+cells.">Comparative study of ZnO and TiO(2) nanoparticles: physicochemical characterisation and toxicological effects on human colon carcinoma cells.</a> Nanotoxicology. 7, 1361-1372 (2013).</li><li>Johnson, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+exposure+to+ZnO+nanoparticles+induces+autophagic+immune+cell+death.">Acute exposure to ZnO nanoparticles induces autophagic immune cell death.</a> Nanotoxicology. 9, 737-748 (2015).</li><li>Singh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoGenotoxicology:+the+DNA+damaging+potential+of+engineered+nanomaterials.">NanoGenotoxicology: the DNA damaging potential of engineered nanomaterials.</a> Biomaterials. 30, 3891-3914 (2009).</li><li>Song, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+dissolved+zinc+ion+and+reactive+oxygen+species+in+cytotoxicity+of+ZnO+nanoparticles.">Role of the dissolved zinc ion and reactive oxygen species in cytotoxicity of ZnO nanoparticles.</a> Toxicology Letters. 199, 389-397 (2010).</li><li>Wahab, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZnO+nanoparticles+induced+oxidative+stress+and+apoptosis+in+HepG2+and+MCF-7+cancer+cells+and+their+antibacterial+activity.">ZnO nanoparticles induced oxidative stress and apoptosis in HepG2 and MCF-7 cancer cells and their antibacterial activity.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 117, 267-276 (2014).</li><li>Namvar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+effects+of+biosynthesized+zinc+oxide+nanoparticles+on+murine+cell+lines.">Cytotoxic effects of biosynthesized zinc oxide nanoparticles on murine cell lines.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative. 2015, (2015).</li><li>Wong, S. W., Leung, P. T., Djurisic, A. B., Leung, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicities+of+nano+zinc+oxide+to+five+marine+organisms:+influences+of+aggregate+size+and+ion+solubility.">Toxicities of nano zinc oxide to five marine organisms: influences of aggregate size and ion solubility.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 396, 609-618 (2010).</li><li>Hua, J., Vijver, M. G., Richardson, M. K., Ahmad, F., Peijnenburg, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle-specific+toxic+effects+of+differently+shaped+zinc+oxide+nanoparticles+to+zebrafish+embryos+(Danio+rerio).">Particle-specific toxic effects of differently shaped zinc oxide nanoparticles to zebrafish embryos (Danio rerio).</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 33, 2859-2868 (2014).</li><li>Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+ZnO+nanoparticles+exposure+induces+developmental+toxicity,+oxidative+stress+and+DNA+damage+in+embryo-larval+zebrafish.">Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish.</a> Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).</li><li>Alaraby, M., Annangi, B., Hernandez, A., Creus, A., Marcos, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+study+of+the+harmful+effects+of+ZnO+nanoparticles+using+Drosophila+melanogaster+as+an+in+vivo+model.">A comprehensive study of the harmful effects of ZnO nanoparticles using Drosophila melanogaster as an in vivo model.</a> Journal of Hazardous Materials. 296, 166-174 (2015).</li><li>Rand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophotoxicology:+the+growing+potential+for+Drosophila+in+neurotoxicology.">Drosophotoxicology: the growing potential for Drosophila in neurotoxicology.</a> Neurotoxicology and Teratology. 32, 74-83 (2010).</li><li>Ong, C., Yung, L. Y., Cai, Y., Bay, B. H., Baeg, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+as+a+model+organism+to+study+nanotoxicity.">Drosophila melanogaster as a model organism to study nanotoxicity.</a> Nanotoxicology. 9, 396-403 (2015).</li><li>Hoffmann, J. A., Reichhart, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+innate+immunity:+an+evolutionary+perspective.">Drosophila innate immunity: an evolutionary perspective.</a> Nature Immunology. 3, 121-126 (2002).</li><li>Hughes, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+as+a+genetic+model+for+studying+pathogenic+human+viruses.">Drosophila as a genetic model for studying pathogenic human viruses.</a> Virology. 423, 1-5 (2012).</li><li>Jennings, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+-+a+versatile+model+in+biology+&amp;+medicine.">Drosophila - a versatile model in biology &amp; medicine.</a> Materials Today. 14, 190-195 (2011).</li><li>Adams, M. D., Sekelsky, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+sequence+to+phenotype:+reverse+genetics+in+Drosophila+melanogaster.">From sequence to phenotype: reverse genetics in Drosophila melanogaster.</a> Nature Reviews Genetics. 3, 189-198 (2002).</li><li>Adams, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+sequence+of+Drosophila+melanogaster.">The genome sequence of Drosophila melanogaster.</a> Science. 287, 2185-2195 (2000).</li><li>Ong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+nanoparticles+disrupt+germline+stem+cell+maintenance+in+the+Drosophila+testis.">Silver nanoparticles disrupt germline stem cell maintenance in the Drosophila testis.</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li><li>Alaraby, M., Demir, E., Hernandez, A., Marcos, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+potential+harmful+effects+of+CdSe+quantum+dots+by+using+Drosophila+melanogaster+as+in+vivo+model.">Assessing potential harmful effects of CdSe quantum dots by using Drosophila melanogaster as in vivo model.</a> Science of the Total Environment. 530-531, 66-75 (2015).</li><li>Barik, B. K., Mishra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+as+a+potential+teratogen:+a+lesson+learnt+from+fruit+fly.">Nanoparticles as a potential teratogen: a lesson learnt from fruit fly.</a> Nanotoxicology. , 1-27 (2018).</li><li>Jovanovic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+a+human+food+additive,+titanium+dioxide+nanoparticles+E171,+on+Drosophila+melanogaster+-+a+20+generation+dietary+exposure+experiment.">The effects of a human food additive, titanium dioxide nanoparticles E171, on Drosophila melanogaster - a 20 generation dietary exposure experiment.</a> Scientific Reports. 8, (2018).</li><li>Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Toxicity+of+Nanoparticles+to+Human+Endothelial+Cells.">The Toxicity of Nanoparticles to Human Endothelial Cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1048, 59-69 (2018).</li><li>Akhtar, M. J., Ahamed, M., Alhadlaq, H. A., Alshamsan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+ROS+scavenging+and+antioxidant+signalling+by+redox+metallic+and+fullerene+nanomaterials:+Potential+implications+in+ROS+associated+degenerative+disorders.">Mechanism of ROS scavenging and antioxidant signalling by redox metallic and fullerene nanomaterials: Potential implications in ROS associated degenerative disorders.</a> Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1861, 802-813 (2017).</li><li>Akter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+on+silver+nanoparticles-induced+cytotoxicity:+Physicochemical+properties+and+perspectives.">A systematic review on silver nanoparticles-induced cytotoxicity: Physicochemical properties and perspectives.</a> Journal of Advanced Research. 9, 1-16 (2018).</li><li>Vecchio, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fruit+fly+in+the+nanoworld:+once+again+Drosophila+contributes+to+environment+and+human+health.">A fruit fly in the nanoworld: once again Drosophila contributes to environment and human health.</a> Nanotoxicology. 9, 135-137 (2015).</li><li>Marino, G., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+apoptotic+phosphatidylserine+exposure.">Mechanisms of apoptotic phosphatidylserine exposure.</a> Cell Research. 23, 1247-1248 (2013).</li><li>Stoddart, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Viability+Assays:+Introduction.">Cell Viability Assays: Introduction.</a> Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols. , (2011).</li><li>Yazdani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concerns+in+the+application+of+fluorescent+probes+DCDHF-DA,+DHR+123+and+DHE+to+measure+reactive+oxygen+species+in+vitro.">Concerns in the application of fluorescent probes DCDHF-DA, DHR 123 and DHE to measure reactive oxygen species in vitro.</a> Toxicology in Vitro. 30, 578-582 (2015).</li><li>Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+kinetics+of+dihydroethidium+fluorescence+with+superoxide+using+xanthine+oxidase+and+hypoxanthine+assay.">Analysis of kinetics of dihydroethidium fluorescence with superoxide using xanthine oxidase and hypoxanthine assay.</a> Annals of Biomedical Engineering. 41, 327-337 (2013).</li><li>Hartig, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+image+analysis+and+manipulation+in+ImageJ.">Basic image analysis and manipulation in ImageJ.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2013).</li></ol>

על מנת להעריך אם ZnO NP יכול לגרום אפופטוזיס ב MRC5 פיברותקיעות, אנו משתמשים בזרם cy, לנסות להבדיל בין התאים נמק או מוות של תאים האפוטוטיים. בתאים חיים רגילים, פוספולידיסרין (PS) מותאם לשפה הקרום של התא. אם ואפופטוזיס מתרחשת, PS הוא translocated מוקם לתוך העלון של קרום הפלזמה, המאפשר את הכריכה של אנשין V מת?...

ננוטכנולוגיה מתייחסת ליישום של חומרים ננו הנמצאים בשימוש בכל התחומים המדעיים, כולל רפואה, מדעי החומרים, וביוכימיה. לדוגמה, החומרים הידועים לפיזור האולטרה סגול, החישה הכימית ותכונות האנטי-מיקרוביאלית, כמו גם מוליכות חשמלית גבוהה, מנוצלים בייצור מוצרי צריכה שונים כגון אריזות מזון, קוסמטיקה, טקסטיל, גומי, סוללות, זרז לטיפול בגז זנב מכוניות, ויישומים הקשורים בביו-רפואית1,2,3.
עם זאת, היישומים המתפתחת של מוצרים מבוססי ZnO NP, המוביל חשיפה אנושית מוגברת ל-ZnO NPs, העלו חששות על תופעות לוואי פוטנציאליות שלהם על בריאות האדם. מספר מחקרים סלולריים מחוץ לתחום הוכיחו כי הNPs zno יכול לגרום ללחץ חמצוני, מכשירים אוטומטיים הקשורים ציטורעילות, דלקת, ו-גנוגיה4,5,6,7,8 . בעיקר, רעילות של הארגון zno היא נגרמת על ידי פירוק של zno כדי לשחרר zno2 + יונים, כמו גם את הפעילות מחדש של zno, וכתוצאה מכך יוני הסלולר וחוסר איזון מטבולי המקושרים עם לקויי הומאוסטזיס היוניים ו עיכוב של הובלת יונים4,7,9,10. חשוב מאוד, מחקרים הראו כי הדור של מיני חמצן תגובתי (ROS) הוא אחד המנגנונים העיקריים המשמשים הרעילות ZnO הקשורים NPs. מספיק נגד חמצון פעילות לאחר העלבון ROS הוכח להיות אחראי על הגורם הרעילות הציטוזה נזק DNA9. ההשפעות הרעילות של הNPs של זאין יש גם דווחו בדגמי בעלי חיים, כולל מכרסם1, zbrafish11,12, כמו גם את חסרי חוליות drosophila ילה13.
Drosophila ילה משמש מודל מבוסס בעלי חיים חלופיים עבור הקרנת רעילות של ישויות כימיות וננו (nms)14,15. וחשוב מכך, ישנן רמות גבוהות של דמיון גנטי ופיזיולוגי בין בני אדם לדרוסופילה המצדיק את השימוש בדרוסופילה כמודל vivo להערכת תגובות ביולוגיות למזהמים סביבתיים כגון nms 16. יתר על כן, ישנם יתרונות רבים של שימוש Drosophila ילה בשל גודלו הקטן, תוחלת חיים קצרה, האיומים הגנטיים, ותחזוקה קלה וחסכונית. יתר על כן, Drosophila ילה אומצה באופן נרחב לחקר הגנטיקה, מולקולרית והתפתחותית ביולוגיה, מאז הגנום המלא שלה היה מלא רצף לפני שנים בחזרה 2000, ולכן הופך אותו מתאים עבור מגוון של הקרנת תפוקה גבוהה ולהתמודדות עם שאלות ביולוגיות לא פתורות17,18,19,20,21. בשנים האחרונות, מספר מחקרים הקשורים לאימונוטוקסיקולוגיה באמצעות סוגים שונים של NPs בדרוזוהילה דווחו15,22,23,24. הידע הבסיסי הזה שהתקבל ממחקרים שנעשו באמצעות דרוזופילה עזר לספק תובנות נוספות להבנת הננו-טוקסיקולוגיה.
ROS הוא העבריין הידוע עבור הרעלת ציטוזה ורעילות הנגרמת על ידי NPs, בפרט, בסיס מתכת מבוסס NPs25. רוס הם מינים כימיים המכילים חמצן עם תכונות תגובתי גבוהה יותר מאשר חמצן מולקולרי. רדיקלים חופשיים כגון סופראוקסיד רדיקלים (O2-) ואפילו, מולקולות שאינן קיצוניות כגון מי חמצן (H2o2) יכול לשמש ROS. תחת המצב הפיזיולוגי הרגיל, הם נדרשים לשמור על הומאוסטזיס הסלולר26, עם זאת, מוגזם ROS בשל הפקת יתר או דיסרגולציה של מערכת ההגנה נוגד חמצון יכול לגרום ללחץ חמצוני, המוביל נזק לחלבונים, שומנים וחומצה deאוקסיריוונקלאית (DNA)27. למשל, כמו העלייה ברמות של רוס ו גלוטתיון (gsh) הרמה פוחתת במקביל, שיבוש אדנוזין טריפוספט (ATP) סינתזה מתרחש ו לקטט דהידרוגנאז (ldh) רמת מגדילה בינונית, ששיאה במוות התאים27.
כאן, אנו מספקים פרוטוקולים לביצוע ניתוחים סלולריים וגנטיים תוך שימוש בתאי יונקים מתורבתים ודרוזוהילה כדי לקבוע את ההשפעות השליליות הפוטנציאליות של אי-הצורך בNPs. מבט כולל על השיטה המשמשת לחקר רעילות של ZnO NPs מוצג באיור 1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15% Methyl 4-Hydroxybenzoate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cncCK6/TM3, Sb</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>a gift from Dr. Kerppola T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cornmeal, glucose, yeast brewer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyAn ADP with Summit Software</td>
			<td>DAKO</td>
			<td></td>
			<td>https://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydroethidium (Hydroethidine)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D11347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>556547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucolin</td>
			<td>Supermarket</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC5 human lung fibroblast</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#8217;s Drosophila medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21720-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vectashield antifade mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wild- type Canton-S; Sod2N308/CyO</td>
			<td>NIG-FLY</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Oxide Nanoparticles</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>721077</td>
			<td>Refer Sheet 2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

toxicity study of zinc oxide nanoparticles in cell culture and in drosophila melanogaster

תחמוצת אבץ חלקיקי (ZnO NPs) יש מגוון רחב של יישומים, אבל מספר דוחות על רעילות ZnO NP-הקשורים גדל במהירות בשנים האחרונות. עם זאת, מחקרים שבהסבר המנגנון הבסיסי לרעילות ZnO NP המושרה הם scanty. קבענו את פרופילי הרעילות של ZnO NPs באמצעות שניהם בתוך מבחנה במודלים ניסיוני vivo. ירידה משמעותית בכדאיות התאים נצפתה ב-ZnO NP-חשופים MRC5 ריאות פיברותקיעות, מראה כי אין NPs להפעיל אפקטים ציטוטוקסיים. באופן דומה, מעניין, המעיים חשופים ל-ZnO NPs הציגו עלייה דרמטית ברמות מינים של חמצן תגובתי (ROS) בזבוב הפירות דרוזוהילה. מחקרים מעמיקים יותר נדרשים כדי ליצור הערכת סיכונים עבור השימוש המוגבר של NPs ZnO על ידי הצרכנים.

התאים שנחשפו NP עובדו עם ערכת הצביעת תא מגיב, ואחריו מיון התא באמצעות הזרמת cy, לנסות. ZnO NP-מטופלים תאים (למטה, הלוח הימני) התערוכה אחוז גבוה יותר של מוקדם (R3)/תאים מאוחר האפוטוטיים (R6) מאשר בתאי שליטה (R5, התחתון, פאנל שמאל). נמק מוות של תאים מסומן על ידי אר 4 (למעלה, הלוח הימני) (<strong...

Watch this Scientific Journal Video about Toxicity Study of Zinc Oxide Nanoparticles in Cell Culture and in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Toxicity Study of Zinc Oxide Nanoparticles in Cell Culture and in Drosophila melanogaster

אנו מתארים פרוטוקול מפורט להערכת פרופילי הרעילות של חלקיקי תחמוצת אבץ (ZnO NPs) בפרט, סוג של מוות התאים בMRC5 ריאות האדם היווצרות ו רוס המבנה של הפרי זבוב Drosophila ילה.

מחקר רעילות של תחמוצת אבץ חלקיקים בתרבות התא ו- Drosophila ילה מלאנוסטר

Zinc oxide nanoparticles (ZnO NPs) have a wide range of applications, but the number of reports on ZnO NP-associated toxicity has grown rapidly in recent ...

השיטות שלנו מתארות דרך פשוטה וחוזרת ללימוד ננוטוקסיות, כגון בחינת סוגי המוות של תאים ובחינת הייצור של מיני חמצן תגובתי. מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות הוא פורמט קפדני המאפשר לנו ללמוד את תת-התפוקה של תאים ואת הסוגים השונים ההולכים וגדלים של מוות תאי. שיטת מחקר הבדיקה DHE מאפשרת לנו לזהות ולכומת מיני חמצן תגובתי ואחריו ציטומטריית זרימה, הדמיה מיקרוסקופית בתכנים גבוהים, ועל ידי ניתוח פלואורסצנטי מבוסס מזוגות.כדי להתחיל, מניחים צינור Eppendorf המכיל חלקיקי תחמוצת אבץ בתסכום מלאי חלקיקי תחמוצת אבץ לתוך sonicator במשך 15 דקות. הכינו חלקיקי תחמוצת אבץ בריכוזים שונים באמצעות מלאי ננו-חלקיקי תחמוצת אבץ של מיליגרם למיליליטר. ואז, בארון biosafety, זרע MRC5 פיברובלסטים ריאות אנושיות על שלוש צלחות תרבות שש באר בריכוז של אחד פעמים 10 לתאים החמישיים לבא.דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר יום אחד, לטפל בתאים עם שני מיליליטר של חלקיקי תחמוצת אבץ במשך שמונה שעות, 16 שעות, או 24 שעות. בכל נקודת זמן, לאסוף את התאים לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר, וצנטריפוגה ב 300 פעמים g במשך חמש דקות.לשטוף את כדורי התא פעמיים עם מלוחים מאגר פוספט, ולאחר מכן resuspend התאים עם מאגר כריכה 1X. לאחר מכן, להוסיף חמישה microliters של כתם FITC Annexin V בחמישה microliters של כתם DNA פרופידיום יודיד. הדגירה את התאים המוכתמים במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.לפני מיון התאים לפי ציטומטריית זרימה, החלק את הדגימות עם 400 מיקרוליטרים נוספים של מאגר איגוד 1X. טבלה של תרשים עמודות בעוצמה החציונית המתקבלת. עכשיו להשתמש פיפטה להוסיף מיליליטר אחד של חלקיקים בריכוזים שונים לתוך בקבוקונים, ואחריו תשעה מיליליטר של מזון זבוב לעשות ריכוז סופי של 0.1 מיליגרם למיליליטר, 0.25 מיליגרם למיליליטר, או 0.5 מיליגרם לכל חלקיקי תחמוצת אבץ מיליליטר.פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב ביסודיות. אפשר מזון זבוב המכיל חלקיקי תחמוצת אבץ להתקרר לפחות שעתיים עד שלוש שעות לפני השימוש. ואז הרדמה זבובים זכר ונקבה בוגרים בבקבוקון עם פחמן דו חמצני, ולהציג חמישה זבובים זכר וחמש נקבות זבובים לתוך כל בקבוקון במשך חמישה ימים.אפשר להם להזדווג ולהטיל ביצים על פני השטח של האוכל. לאחר הרדמה, הסר את זבובי ההורים ואפשר לביצים לעבור התפתחות נוספת בטמפרטורת החדר, המורכבת מארבעה שלבים התפתחותיים שונים. שלב עוברי, זחל, כף היד ומבוגרים.לאחר 72 עד 120 שעות, ביצים טריות מתפתחות לזחלי instar בשליש המאוחר. באמצעות מדפים, לאסוף את הזחלים מקיר הבקבוקונים לניתוחים. באר של צלחת ניתוח עם מדיום ניתוח או PBS, מניחים את הזחלים לתוך הפתרון.מתחת לסטריאומיקרוסקופ, השתמש בקצה המדפים כדי ליצור חור זעיר, ולשבור את שכבת הקוטיקל של הזחלים. בזהירות לשלוף את הבטן. מניחים את המעיים לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר המכיל מדיום Drosophila של שניידר.הוסיפו מיקרוליטר אחד של הגשושית DHE, והם דוגרים בחושך בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לשטוף את המעיים שלוש פעמים באמצעות מדיום של שניידר כל חמש דקות. הר את המעיים על מגלשות זכוכית, ואספקה עם 10 microliters של מדיום הרכבה antifade המכיל DAPI.לכידת תמונות תחת מיקרוסקופ קונפוקל. כדי למדוד פלואורסצנטיות, ייבא את תמונות הפלואורסצנטיות שנתפסו שנרכשו באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית או מיקרוסקופיית סריקת לייזר קונפוקלים לתוכנה ImageJ. לחצו על תפריט הניתוח ובחרו להגדיר מידות.בחר את מדד הפלט, כגון עוצמה משולבת באזור וערך אפור ממוצע. בחר אזור ללא פלואורסצנטיות כדי להגדיר את הרקע. לחץ על מדידה.יצא את הנתונים לתוך הגיליון האלקטרוני וקבע את הפלואורסצנטיות הכוללת של התאים. בנה תרשים עמודות ובצע ניתוח סטטיסטי. במחקר זה, תאים שטופלו בתחמוצת אבץ ננו-חלקיקים מפגינים אחוז גבוה יותר של תאי R3 מוקדמים או R6 אפופטיים מאוחרים מאשר תאי בקרה R5. מוות תאי נמק היה מסומן על ידי R4. המעיים שחולצו מזחל דרוסופילה חולקו לשלושה תחומים דיסקרטיים ממוצא התפתחותי שונה.כלומר, ההמשך, מידגוט וההינדגוט. מניית DHE נוטה לפוג די מהר, אז היזהר מפתרון המניות שאתה משתמש בו. לחלופין, אתה יכול לנסות בדיקות אחרות, למשל תא רוש, אשר נועד לזהות את ROS תאיים באותות ירוקים, וזה יותר photostable מאשר DHE.הפרוטוקול שלנו מספק מתווה כללי לחקר ייצור ROS תאי, וכימות של רמת ROS למחקר nanotoxicity. DMSO ידוע כממס טוב יותר עבור DHE מאשר PBS. עם זאת, DMSO רעיל.לכן, ברצוני לייעץ למשתמש להגביל את כל התהליך ללימודים ל-30 דקות לכל היותר. הסיבה לכך היא שאתה יכול להתבונן תוצאה חיובית כוזבת כמו DMSO עלול לגרום למוות של תאים.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Toxicity Study of Zinc Oxide Nanoparticles in Cell Culture and in Drosophila melanogaster

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

התמרה retroviral של T-cell קולטנים עכבר מתאי T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an ...

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

זיהום חיידקים מערכתי וחיסון ביטחון פנוטיפים ב<em&gt; דרוזופילה melanogaster</em

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of ...

Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing

בידוד תא Kupffer לNanoparticle בדיקת רעילות

The large majority of in vitro nanotoxicological studies have used immortalized cell lines for their practicality. However, results from nanoparticle ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

בידוד נויטרופילים וניתוח כדי לקבוע את תפקידם רגישות תאים לימפומה לסוכנים טיפוליים

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

הערכת היעילות והרעילות של RNAs מיקוד ייצור HIV-1 לשימוש ב ג&#39;ין או טיפול תרופתי

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

החילוץ של Hemocytes של הזחלים דרוזופילה melanogaster זיהום מיקרוביאלי וניתוח

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

אפיון של אימונוגלובולינים התימוס תלוית ועצמאי התימוס תגובות Isotype בעכברים באמצעות אנזים-מקושרים Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

הקמתה של זיהום נגיפי וניתוח של התערבות מארח-וירוס דרוזופילה Melanogaster

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Monolayers Colonoid האדם ללמוד אינטראקציות בין גורמי מחלה, Commensals אפיתל המעי מארח

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...