Name: toxicity study of zinc oxide nanoparticles in cell culture and in drosophila melanogaster
Uploaded: 2019-09-19T13:30:00
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1. 生細胞/固定細胞に関する蛍光活性化細胞選別(FACS)分析
<ol><li>15分間のサスペンションでZnOのニオネート。</li>
	<li>培養細胞の治療に1mg/mL ZnO NPストック溶液を用いて、様々な濃度(例えば、0、10、25、50,100および200 μg/mL)でZnO NPを調用する。</li>
	<li>種子MRC5ヒト肺線維芽細胞(1 x 105細胞/ウェル)を1日前に6ウェル培養プレート上に、その後、8時間、16時間、24時間のZnO NPの2mL(三重)で細胞...

<ol>
	<li>Kim, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+of+100+nm+zinc+oxide+nanoparticles:+a+report+of+90-day+repeated+oral+administration+in+Sprague+Dawley+rats.">Toxicity of 100 nm zinc oxide nanoparticles: a report of 90-day repeated oral administration in Sprague Dawley rats.</a> International Journal of Nanomedicine. 9 Suppl 2, 109-126 (2014).</li><li>Xie, Y., He, Y., Irwin, P. L., Jin, T., Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibacterial+activity+and+mechanism+of+action+of+zinc+oxide+nanoparticles+against+Campylobacter+jejuni.">Antibacterial activity and mechanism of action of zinc oxide nanoparticles against Campylobacter jejuni.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77, 2325-2331 (2011).</li><li>Colvin, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+environmental+impact+of+engineered+nanomaterials.">The potential environmental impact of engineered nanomaterials.</a> Nature Biotechnology. 21, 1166-1170 (2003).</li><li>De Angelis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+ZnO+and+TiO(2)+nanoparticles:+physicochemical+characterisation+and+toxicological+effects+on+human+colon+carcinoma+cells.">Comparative study of ZnO and TiO(2) nanoparticles: physicochemical characterisation and toxicological effects on human colon carcinoma cells.</a> Nanotoxicology. 7, 1361-1372 (2013).</li><li>Johnson, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+exposure+to+ZnO+nanoparticles+induces+autophagic+immune+cell+death.">Acute exposure to ZnO nanoparticles induces autophagic immune cell death.</a> Nanotoxicology. 9, 737-748 (2015).</li><li>Singh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoGenotoxicology:+the+DNA+damaging+potential+of+engineered+nanomaterials.">NanoGenotoxicology: the DNA damaging potential of engineered nanomaterials.</a> Biomaterials. 30, 3891-3914 (2009).</li><li>Song, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+dissolved+zinc+ion+and+reactive+oxygen+species+in+cytotoxicity+of+ZnO+nanoparticles.">Role of the dissolved zinc ion and reactive oxygen species in cytotoxicity of ZnO nanoparticles.</a> Toxicology Letters. 199, 389-397 (2010).</li><li>Wahab, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZnO+nanoparticles+induced+oxidative+stress+and+apoptosis+in+HepG2+and+MCF-7+cancer+cells+and+their+antibacterial+activity.">ZnO nanoparticles induced oxidative stress and apoptosis in HepG2 and MCF-7 cancer cells and their antibacterial activity.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 117, 267-276 (2014).</li><li>Namvar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+effects+of+biosynthesized+zinc+oxide+nanoparticles+on+murine+cell+lines.">Cytotoxic effects of biosynthesized zinc oxide nanoparticles on murine cell lines.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative. 2015, (2015).</li><li>Wong, S. W., Leung, P. T., Djurisic, A. B., Leung, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicities+of+nano+zinc+oxide+to+five+marine+organisms:+influences+of+aggregate+size+and+ion+solubility.">Toxicities of nano zinc oxide to five marine organisms: influences of aggregate size and ion solubility.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 396, 609-618 (2010).</li><li>Hua, J., Vijver, M. G., Richardson, M. K., Ahmad, F., Peijnenburg, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle-specific+toxic+effects+of+differently+shaped+zinc+oxide+nanoparticles+to+zebrafish+embryos+(Danio+rerio).">Particle-specific toxic effects of differently shaped zinc oxide nanoparticles to zebrafish embryos (Danio rerio).</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 33, 2859-2868 (2014).</li><li>Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+ZnO+nanoparticles+exposure+induces+developmental+toxicity,+oxidative+stress+and+DNA+damage+in+embryo-larval+zebrafish.">Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish.</a> Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).</li><li>Alaraby, M., Annangi, B., Hernandez, A., Creus, A., Marcos, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+study+of+the+harmful+effects+of+ZnO+nanoparticles+using+Drosophila+melanogaster+as+an+in+vivo+model.">A comprehensive study of the harmful effects of ZnO nanoparticles using Drosophila melanogaster as an in vivo model.</a> Journal of Hazardous Materials. 296, 166-174 (2015).</li><li>Rand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophotoxicology:+the+growing+potential+for+Drosophila+in+neurotoxicology.">Drosophotoxicology: the growing potential for Drosophila in neurotoxicology.</a> Neurotoxicology and Teratology. 32, 74-83 (2010).</li><li>Ong, C., Yung, L. Y., Cai, Y., Bay, B. H., Baeg, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+as+a+model+organism+to+study+nanotoxicity.">Drosophila melanogaster as a model organism to study nanotoxicity.</a> Nanotoxicology. 9, 396-403 (2015).</li><li>Hoffmann, J. A., Reichhart, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+innate+immunity:+an+evolutionary+perspective.">Drosophila innate immunity: an evolutionary perspective.</a> Nature Immunology. 3, 121-126 (2002).</li><li>Hughes, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+as+a+genetic+model+for+studying+pathogenic+human+viruses.">Drosophila as a genetic model for studying pathogenic human viruses.</a> Virology. 423, 1-5 (2012).</li><li>Jennings, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+-+a+versatile+model+in+biology+&amp;+medicine.">Drosophila - a versatile model in biology &amp; medicine.</a> Materials Today. 14, 190-195 (2011).</li><li>Adams, M. D., Sekelsky, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+sequence+to+phenotype:+reverse+genetics+in+Drosophila+melanogaster.">From sequence to phenotype: reverse genetics in Drosophila melanogaster.</a> Nature Reviews Genetics. 3, 189-198 (2002).</li><li>Adams, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+sequence+of+Drosophila+melanogaster.">The genome sequence of Drosophila melanogaster.</a> Science. 287, 2185-2195 (2000).</li><li>Ong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+nanoparticles+disrupt+germline+stem+cell+maintenance+in+the+Drosophila+testis.">Silver nanoparticles disrupt germline stem cell maintenance in the Drosophila testis.</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li><li>Alaraby, M., Demir, E., Hernandez, A., Marcos, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+potential+harmful+effects+of+CdSe+quantum+dots+by+using+Drosophila+melanogaster+as+in+vivo+model.">Assessing potential harmful effects of CdSe quantum dots by using Drosophila melanogaster as in vivo model.</a> Science of the Total Environment. 530-531, 66-75 (2015).</li><li>Barik, B. K., Mishra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+as+a+potential+teratogen:+a+lesson+learnt+from+fruit+fly.">Nanoparticles as a potential teratogen: a lesson learnt from fruit fly.</a> Nanotoxicology. , 1-27 (2018).</li><li>Jovanovic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+a+human+food+additive,+titanium+dioxide+nanoparticles+E171,+on+Drosophila+melanogaster+-+a+20+generation+dietary+exposure+experiment.">The effects of a human food additive, titanium dioxide nanoparticles E171, on Drosophila melanogaster - a 20 generation dietary exposure experiment.</a> Scientific Reports. 8, (2018).</li><li>Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Toxicity+of+Nanoparticles+to+Human+Endothelial+Cells.">The Toxicity of Nanoparticles to Human Endothelial Cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1048, 59-69 (2018).</li><li>Akhtar, M. J., Ahamed, M., Alhadlaq, H. A., Alshamsan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+ROS+scavenging+and+antioxidant+signalling+by+redox+metallic+and+fullerene+nanomaterials:+Potential+implications+in+ROS+associated+degenerative+disorders.">Mechanism of ROS scavenging and antioxidant signalling by redox metallic and fullerene nanomaterials: Potential implications in ROS associated degenerative disorders.</a> Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1861, 802-813 (2017).</li><li>Akter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+on+silver+nanoparticles-induced+cytotoxicity:+Physicochemical+properties+and+perspectives.">A systematic review on silver nanoparticles-induced cytotoxicity: Physicochemical properties and perspectives.</a> Journal of Advanced Research. 9, 1-16 (2018).</li><li>Vecchio, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fruit+fly+in+the+nanoworld:+once+again+Drosophila+contributes+to+environment+and+human+health.">A fruit fly in the nanoworld: once again Drosophila contributes to environment and human health.</a> Nanotoxicology. 9, 135-137 (2015).</li><li>Marino, G., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+apoptotic+phosphatidylserine+exposure.">Mechanisms of apoptotic phosphatidylserine exposure.</a> Cell Research. 23, 1247-1248 (2013).</li><li>Stoddart, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Viability+Assays:+Introduction.">Cell Viability Assays: Introduction.</a> Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols. , (2011).</li><li>Yazdani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concerns+in+the+application+of+fluorescent+probes+DCDHF-DA,+DHR+123+and+DHE+to+measure+reactive+oxygen+species+in+vitro.">Concerns in the application of fluorescent probes DCDHF-DA, DHR 123 and DHE to measure reactive oxygen species in vitro.</a> Toxicology in Vitro. 30, 578-582 (2015).</li><li>Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+kinetics+of+dihydroethidium+fluorescence+with+superoxide+using+xanthine+oxidase+and+hypoxanthine+assay.">Analysis of kinetics of dihydroethidium fluorescence with superoxide using xanthine oxidase and hypoxanthine assay.</a> Annals of Biomedical Engineering. 41, 327-337 (2013).</li><li>Hartig, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+image+analysis+and+manipulation+in+ImageJ.">Basic image analysis and manipulation in ImageJ.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2013).</li></ol>

ZnO NPがMRC5線維芽細胞にアポトーシスを誘導できるかどうかを評価するために、我々は細胞を壊死またはアポトーシス細胞死から区別するためにフローサイトメトリーを使用する。正常な生細胞では、ホスファチジルセリン(PS)は細胞膜に局在する。アポトーシスが発生した場合、PSは血漿膜の細胞外リーフレットに転移し、Fluoresin(FITCアネキシンV)29で標識されたアネキシンV?...

ナノテクノロジーとは、医学、材料科学、生化学など、あらゆる科学分野で使用されるナノサイズの材料の応用を指します。例えば、紫外線散乱、化学センシング、抗微生物性、高い電気伝導性で知られるZnO NPは、食品包装、化粧品など様々な消費財の製造に活用されています。繊維、ゴム、電池、自動車テールガス処理用触媒、および生物医学関連アプリケーション1、2、3.
しかし、ZnO NPベースの製品の急増は、ZnO NPへの人間の暴露の増加につながる、人間の健康に対する潜在的な悪影響に関する懸念を提起している。インビトロ細胞研究の数は、ZnO NPが酸化ストレス、オートファジー関連細胞毒性、炎症、および無毒性4、5、6、7、8を誘発できることを実証しました.特に、ZnO NPの毒性は、Zn2+イオンを自由に溶解し、ZnOの表面反応性によって引き起こされると仮定され、その結果、細胞イオン性および代謝不均衡が生じ、イオン性恒常性障害およびイオン輸送の阻害4,7,9,10.重要なことに、研究は、活性酸素種(ROS)の生成がZnO NPs関連毒性の基礎となる主要なメカニズムの一つであることを示しています。ROS侮辱後の不十分な抗酸化活性は、細胞毒性およびDNA損傷9を引き起こす原因であることが示されている。ZnO NPの毒性効果は、げっ歯類1、ゼブラフィッシュ11、12、ならびに無脊椎動物のショウジョウバエ13を含む動物モデルでも報告されている。
ショウジョウバエは、化学物質およびナノ材料(NM)14、15の毒性スクリーニングのための確立された代替動物モデルとして機能する。重要なのは、ヒトとショウジョウバエの間には高いレベルの遺伝的類似性があり、NMなどの環境汚染物質に対する生物学的応答を評価するための生体内モデルとしてのショウジョウバエの使用を正当化する。16.さらに、その小さなサイズ、短い寿命、遺伝的なアメニティ、および容易で、費用効果が大きい維持のためにショウジョウバエを使用することの多くの利点がある。さらに、ショウジョウバエは遺伝学、分子、発生生物学の研究に広く採用されており、2000年に完全なゲノムが完全に配列され、様々なハイスループットスクリーニングに適しています。そして、未解決の生物学的問題に取り組むために17,18,19,20,21.近年、ショウジョウバエにおける異なるタイプのNPを用いた免疫毒性に関する多くの研究が15、22、23、24で報告されている。ショウジョウバエを用いた研究から得られたこの基本的な新しい知識は、ナノトキシトロジーの理解に関するより多くの洞察を提供するのに役立ちました。
ROSは、特に、金属ベースのNP25によって引き起こされる細胞毒性および無毒性の既知の原因である。ROSは、分子酸素よりも高い活性特性を有する酸素含有化学種である。スーパーオキシドラジカル(O2-)などのフリーラジカルは、過酸化水素(H2O2)などの非ラジカル分子がROSとして作用しうる。正常な生理学的状態の下では、それらは細胞恒常性26を維持する必要があるが、抗酸化防御システムの過剰産生または不自由による過剰なROSは酸化ストレスを引き起こし、タンパク質への損傷を引き起こす可能性があり、脂質およびデオキシリボ核酸(DNA)27.例えば、ROSレベルが増加し、グルタチオン(GSH)レベルが伴って減少するにつれて、アデノシン三リン酸(ATP)合成の中断が起こり、乳酸脱水素酵素(LDH)レベルが培地中で増加し、細胞死27で終わる。
ここでは、培養哺乳動物細胞とショウジョウバエを用いて細胞解析や遺伝子解析を行い、ZnO NPの潜在的な悪影響を判定するプロトコルを提供する。ZnO NPの毒性試験に用いられる方法の概要を図1に示す。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15% Methyl 4-Hydroxybenzoate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cncCK6/TM3, Sb</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>a gift from Dr. Kerppola T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cornmeal, glucose, yeast brewer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyAn ADP with Summit Software</td>
			<td>DAKO</td>
			<td></td>
			<td>https://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydroethidium (Hydroethidine)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D11347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>556547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucolin</td>
			<td>Supermarket</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC5 human lung fibroblast</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#8217;s Drosophila medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21720-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vectashield antifade mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wild- type Canton-S; Sod2N308/CyO</td>
			<td>NIG-FLY</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Oxide Nanoparticles</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>721077</td>
			<td>Refer Sheet 2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

toxicity study of zinc oxide nanoparticles in cell culture and in drosophila melanogaster

酸化亜鉛ナノ粒子(ZnO NP)は幅広い用途を持っていますが、ZnO NP関連毒性に関する報告の数は近年急速に増加しています。しかし、ZnO NP誘発毒性の根本的なメカニズムを解明する研究はスキャン可能である。インビトロとインビボ実験モデルの両方を用いてZnO NPの毒性プロファイルを決定した。ZnO NP曝露MRC5肺線維芽細胞では細胞生存率の有意な減少が認され、ZnO NPが細胞傷害作用を発揮することを示した。同様に、興味深いことに、ZnO NPに曝露された腸は、フルーツフライショウジョウバエにおける活性酸素種レベル(ROS)の劇的な増加を示した。消費者によるZnO NPの使用率の増加に対するリスク評価を確立するためには、より詳細な研究が必要である。

NP露光細胞を細胞染色試薬キットで処理し、続いてフローサイトメトリーを用いて細胞選別を行った。ZnO NP処理細胞(下、右パネル)は、対照細胞(R5、下部、左パネル)よりも早期(R3)/後期アポトーシス細胞(R6)の割合が高い。壊死細胞死はR4(上、右パネル)で示される(図2)。ZnO NP処理MRC-5線維芽細胞に関するFITC/アネキシンVアッセイの結果を<strong class=...

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Toxicity Study of Zinc Oxide Nanoparticles in Cell Culture and in Drosophila melanogaster

特に酸化亜鉛ナノ粒子(ZnO NPs)の毒性プロファイルを評価するための詳細なプロトコルについて説明し、ヒトMRC5肺線維芽細胞における細胞死の種類および果実フライドロソフィラにおけるROS形成について説明する。

細胞培養およびショウジョウバエメラノガスターにおける酸化亜鉛ナノ粒子の毒性研究

Zinc oxide nanoparticles (ZnO NPs) have a wide range of applications, but the number of reports on ZnO NP-associated toxicity has grown rapidly in recent ...

我々の方法は、細胞死の種類を調べ、活性酸素種の産生を調べるなど、ナノ毒性を研究するための簡単で繰り返しの方法を概説する。蛍光活性化細胞の並べ替えは、細胞のサブ人口と成長する異なる種類の細胞死を研究することを可能にする厳格な形式です。DHEプローブの研究方法により、活性酸素種を検出して定量化し、続いてフローサイトメトリー、微視的高含有イメージング、および結合ベースの蛍光分析を行うことができます。まず、酸化亜鉛ナノ粒子を含むエペンドルフチューブを酸化亜鉛ナノ粒子ストック溶液に15分間ソニケーターに入れます。1ミリリットル当たり1ミリグラムの酸化亜鉛ナノ粒子ストックを用いて、様々な濃度で酸化亜鉛ナノ粒子を調製する。次いで、バイオセーフティキャビネットにおいて、ヒト肺線維芽細胞を3つの6ウェル培養プレートに播種し、1回10〜5番目の細胞を1回の濃度で及ぶ。37°Cで細胞をインキュベートします。1日後、2ミリリットルの酸化亜鉛ナノ粒子で細胞を8時間、16時間、または24時間処理します。各時点で、細胞を15ミリリットルの遠心管に集め、遠心分離機を300回gで5分間回収する。リン酸緩衝生理食塩水で細胞ペレットを2回洗浄し、1X結合バッファーで細胞を再中断します。次に、5マイクロリットルのFITCアネキシンV染色を5マイクロリットルのヨウ化プロピジウムDNA染色に加える。暗い温度で15分間、染色した細胞をインキュベートします。フローサイトメトリーで細胞を選別する前に、サンプルを追加の400マイクロリットルの1X結合バッファーで上に上げてください。取得した中央値強度を使用して、棒グラフを集計します。ピペットを使用してバイアルに異なる濃度で1ミリリットルのナノ粒子を追加し、続いて9ミリリットルのフライフードを使用して、1ミリリットル当たり0.1ミリグラム、ミリリットル当たり0.25ミリグラム、または1ミリリットルの酸化亜鉛ナノ粒子あたり0.5ミリグラムの最終濃度を作ります。ピペットを上下にして完全に混ぜます。酸化亜鉛ナノ粒子を含むフライ食品を、使用前に少なくとも2〜3時間冷却することを許可する。その後、二酸化炭素を含むバイアルで成体の雄と雌のハエを麻酔し、5日間、5匹のオスハエと5匹の雌のハエを各バイアルに導入します。彼らが交尾し、食べ物の表面に卵を産むことを許可します。麻酔後、親のハエを取り除き、卵が4つの異なる発達段階で構成される室温でさらなる発達を受けることを可能にする。胚性、幼虫、子犬、および成人期。72〜120時間後、産きたての卵は3番目後半のインスター幼虫に発達する。鉗子を使用して、分析のためにバイアルの壁から幼虫を収集します。解剖媒体またはPBSを含む解剖皿の井戸に、幼虫を溶液に入れる。実体顕微鏡では、鉗子の先端を使って小さな穴を開け、幼虫のキューティクル層を開きます。慎重に腸を引き出します。シュナイダーのショウジョウバエ培地を含む1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに腸を入れる。DHEプローブを1マイクロリットル加え、室温で暗闇の中で10分間インキュベートします。5分ごとにシュナイダーのミディアムを使用して腸を3回洗います。ガラススライドに腸を取り付け、DAPIを含むアンチフェード実装媒体の10マイクロリットルを供給します。共焦点顕微鏡で画像をキャプチャします。蛍光を測定するには、蛍光顕微鏡または共焦点レーザー走査顕微鏡を使用して取得した蛍光画像をImageJソフトウェアにインポートします。分析メニューをクリックし、測定の設定を選択します。面積積分強度、平均グレー値などの出力メジャーを選択します。背景を設定するには蛍光のない領域を選択します。メジャーをクリックします。データをスプレッドシートにエクスポートし、補正された全細胞蛍光を決定します。棒グラフを作成し、統計分析を実行します。本研究では、酸化亜鉛ナノ粒子処理細胞は、コントロール細胞R5よりも初期のR3または後期アポトーシスR6細胞の割合が高いことを示す。壊死細胞死はR4によって示された。ショウジョウバの幼虫から抽出された腸は、異なる発達起源の3つの離散ドメインに分けられた。すなわち、前腸、中腸、後腸。DHE在庫は、かなり早く期限切れになる傾向があるので、使用しているストックソリューションに注意してください。あるいは、緑色の信号で細胞内ROSを検出するように設計された細胞ロシュなどの他のプローブを試すことができます。我々のプロトコルは、細胞内ROS産生を研究するための一般的な概要を提供し、ナノ毒性研究のためのROSレベルの定量化を提供する。DMSOは、PBSよりもDHEに対して優れた溶媒であることが知られている。しかし、DMSOは有毒です。したがって、私は、最大30分に学習するための全体のプロセスを制限するためにユーザーに助言したいと思います。DMSO が細胞死を引き起こす可能性があるため、偽陽性の結果を観察する可能性があるためです。.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Toxicity Study of Zinc Oxide Nanoparticles in Cell Culture and in Drosophila melanogaster

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

マウスT細胞におけるT細胞受容体のレトロウイルス導入

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an ...

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

全身細菌感染や免疫防御表現型<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of ...

Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing

ナノ粒子の毒性試験のためのクッパー細胞の単離

The large majority of in vitro nanotoxicological studies have used immortalized cell lines for their practicality. However, results from nanoparticle ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

治療薬にリンパ腫細胞の感度での役割を決定するために、好中球の単離と解析

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

遺伝子または薬物療法で使用するためのHIV-1産生を標的RNAの有効性および毒性の評価

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

細菌感染や解析のためのキイロショウジョウバエ幼虫血球の抽出

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

酵素抗体法を用いたマウスにおける胸腺依存性および胸腺非依存性免疫グロブリン アイソタイプ反応の評価

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

ウイルス感染とキイロショウジョウバエのホスト ウイルスの相互作用の解析

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

病原体、共生生物、およびホストの腸上皮間の相互作用を研究する人間 Colonoid 単分子膜

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...