Name: toxicity study of zinc oxide nanoparticles in cell culture and in drosophila melanogaster
Uploaded: 2019-09-19T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Toxicity Study of Zinc Oxide Nanoparticles in Cell Culture and in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Studien ble støttet av stipend nummer R706-000-043-490. Studien representerer ikke visningen av stipend sponsoren.

1. fluorescens aktivert celle sortering (FACS) analyse på levde/faste celler
<ol><li>Sonikere ZnO NPs i suspensjon i 15 min.</li>
	<li>Klargjør ZnO NPs ved ulike konsentrasjoner (for eksempel 0, 10, 25, 50 100 og 200 μg/mL) ved bruk av 1 mg/mL ZnO NP-lagerløsning for behandling av kulturperler celler.</li>
	<li>Seed MRC5 menneskelige lunge fibroblaster (1 x 105 celler/brønn) på en 6-brønn kultur tallerken en dag i forveien, og deretter behandle cellene med 2 ml ZnO NPs (i triplicates) for 8 h, 16 h, o...

<ol>
	<li>Kim, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+of+100+nm+zinc+oxide+nanoparticles:+a+report+of+90-day+repeated+oral+administration+in+Sprague+Dawley+rats.">Toxicity of 100 nm zinc oxide nanoparticles: a report of 90-day repeated oral administration in Sprague Dawley rats.</a> International Journal of Nanomedicine. 9 Suppl 2, 109-126 (2014).</li><li>Xie, Y., He, Y., Irwin, P. L., Jin, T., Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibacterial+activity+and+mechanism+of+action+of+zinc+oxide+nanoparticles+against+Campylobacter+jejuni.">Antibacterial activity and mechanism of action of zinc oxide nanoparticles against Campylobacter jejuni.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77, 2325-2331 (2011).</li><li>Colvin, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+environmental+impact+of+engineered+nanomaterials.">The potential environmental impact of engineered nanomaterials.</a> Nature Biotechnology. 21, 1166-1170 (2003).</li><li>De Angelis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+ZnO+and+TiO(2)+nanoparticles:+physicochemical+characterisation+and+toxicological+effects+on+human+colon+carcinoma+cells.">Comparative study of ZnO and TiO(2) nanoparticles: physicochemical characterisation and toxicological effects on human colon carcinoma cells.</a> Nanotoxicology. 7, 1361-1372 (2013).</li><li>Johnson, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+exposure+to+ZnO+nanoparticles+induces+autophagic+immune+cell+death.">Acute exposure to ZnO nanoparticles induces autophagic immune cell death.</a> Nanotoxicology. 9, 737-748 (2015).</li><li>Singh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoGenotoxicology:+the+DNA+damaging+potential+of+engineered+nanomaterials.">NanoGenotoxicology: the DNA damaging potential of engineered nanomaterials.</a> Biomaterials. 30, 3891-3914 (2009).</li><li>Song, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+dissolved+zinc+ion+and+reactive+oxygen+species+in+cytotoxicity+of+ZnO+nanoparticles.">Role of the dissolved zinc ion and reactive oxygen species in cytotoxicity of ZnO nanoparticles.</a> Toxicology Letters. 199, 389-397 (2010).</li><li>Wahab, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZnO+nanoparticles+induced+oxidative+stress+and+apoptosis+in+HepG2+and+MCF-7+cancer+cells+and+their+antibacterial+activity.">ZnO nanoparticles induced oxidative stress and apoptosis in HepG2 and MCF-7 cancer cells and their antibacterial activity.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 117, 267-276 (2014).</li><li>Namvar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+effects+of+biosynthesized+zinc+oxide+nanoparticles+on+murine+cell+lines.">Cytotoxic effects of biosynthesized zinc oxide nanoparticles on murine cell lines.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative. 2015, (2015).</li><li>Wong, S. W., Leung, P. T., Djurisic, A. B., Leung, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicities+of+nano+zinc+oxide+to+five+marine+organisms:+influences+of+aggregate+size+and+ion+solubility.">Toxicities of nano zinc oxide to five marine organisms: influences of aggregate size and ion solubility.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 396, 609-618 (2010).</li><li>Hua, J., Vijver, M. G., Richardson, M. K., Ahmad, F., Peijnenburg, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle-specific+toxic+effects+of+differently+shaped+zinc+oxide+nanoparticles+to+zebrafish+embryos+(Danio+rerio).">Particle-specific toxic effects of differently shaped zinc oxide nanoparticles to zebrafish embryos (Danio rerio).</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 33, 2859-2868 (2014).</li><li>Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+ZnO+nanoparticles+exposure+induces+developmental+toxicity,+oxidative+stress+and+DNA+damage+in+embryo-larval+zebrafish.">Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish.</a> Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).</li><li>Alaraby, M., Annangi, B., Hernandez, A., Creus, A., Marcos, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+study+of+the+harmful+effects+of+ZnO+nanoparticles+using+Drosophila+melanogaster+as+an+in+vivo+model.">A comprehensive study of the harmful effects of ZnO nanoparticles using Drosophila melanogaster as an in vivo model.</a> Journal of Hazardous Materials. 296, 166-174 (2015).</li><li>Rand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophotoxicology:+the+growing+potential+for+Drosophila+in+neurotoxicology.">Drosophotoxicology: the growing potential for Drosophila in neurotoxicology.</a> Neurotoxicology and Teratology. 32, 74-83 (2010).</li><li>Ong, C., Yung, L. Y., Cai, Y., Bay, B. H., Baeg, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+as+a+model+organism+to+study+nanotoxicity.">Drosophila melanogaster as a model organism to study nanotoxicity.</a> Nanotoxicology. 9, 396-403 (2015).</li><li>Hoffmann, J. A., Reichhart, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+innate+immunity:+an+evolutionary+perspective.">Drosophila innate immunity: an evolutionary perspective.</a> Nature Immunology. 3, 121-126 (2002).</li><li>Hughes, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+as+a+genetic+model+for+studying+pathogenic+human+viruses.">Drosophila as a genetic model for studying pathogenic human viruses.</a> Virology. 423, 1-5 (2012).</li><li>Jennings, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+-+a+versatile+model+in+biology+&amp;+medicine.">Drosophila - a versatile model in biology &amp; medicine.</a> Materials Today. 14, 190-195 (2011).</li><li>Adams, M. D., Sekelsky, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+sequence+to+phenotype:+reverse+genetics+in+Drosophila+melanogaster.">From sequence to phenotype: reverse genetics in Drosophila melanogaster.</a> Nature Reviews Genetics. 3, 189-198 (2002).</li><li>Adams, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+sequence+of+Drosophila+melanogaster.">The genome sequence of Drosophila melanogaster.</a> Science. 287, 2185-2195 (2000).</li><li>Ong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+nanoparticles+disrupt+germline+stem+cell+maintenance+in+the+Drosophila+testis.">Silver nanoparticles disrupt germline stem cell maintenance in the Drosophila testis.</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li><li>Alaraby, M., Demir, E., Hernandez, A., Marcos, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+potential+harmful+effects+of+CdSe+quantum+dots+by+using+Drosophila+melanogaster+as+in+vivo+model.">Assessing potential harmful effects of CdSe quantum dots by using Drosophila melanogaster as in vivo model.</a> Science of the Total Environment. 530-531, 66-75 (2015).</li><li>Barik, B. K., Mishra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+as+a+potential+teratogen:+a+lesson+learnt+from+fruit+fly.">Nanoparticles as a potential teratogen: a lesson learnt from fruit fly.</a> Nanotoxicology. , 1-27 (2018).</li><li>Jovanovic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+a+human+food+additive,+titanium+dioxide+nanoparticles+E171,+on+Drosophila+melanogaster+-+a+20+generation+dietary+exposure+experiment.">The effects of a human food additive, titanium dioxide nanoparticles E171, on Drosophila melanogaster - a 20 generation dietary exposure experiment.</a> Scientific Reports. 8, (2018).</li><li>Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Toxicity+of+Nanoparticles+to+Human+Endothelial+Cells.">The Toxicity of Nanoparticles to Human Endothelial Cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1048, 59-69 (2018).</li><li>Akhtar, M. J., Ahamed, M., Alhadlaq, H. A., Alshamsan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+ROS+scavenging+and+antioxidant+signalling+by+redox+metallic+and+fullerene+nanomaterials:+Potential+implications+in+ROS+associated+degenerative+disorders.">Mechanism of ROS scavenging and antioxidant signalling by redox metallic and fullerene nanomaterials: Potential implications in ROS associated degenerative disorders.</a> Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1861, 802-813 (2017).</li><li>Akter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+on+silver+nanoparticles-induced+cytotoxicity:+Physicochemical+properties+and+perspectives.">A systematic review on silver nanoparticles-induced cytotoxicity: Physicochemical properties and perspectives.</a> Journal of Advanced Research. 9, 1-16 (2018).</li><li>Vecchio, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fruit+fly+in+the+nanoworld:+once+again+Drosophila+contributes+to+environment+and+human+health.">A fruit fly in the nanoworld: once again Drosophila contributes to environment and human health.</a> Nanotoxicology. 9, 135-137 (2015).</li><li>Marino, G., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+apoptotic+phosphatidylserine+exposure.">Mechanisms of apoptotic phosphatidylserine exposure.</a> Cell Research. 23, 1247-1248 (2013).</li><li>Stoddart, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Viability+Assays:+Introduction.">Cell Viability Assays: Introduction.</a> Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols. , (2011).</li><li>Yazdani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concerns+in+the+application+of+fluorescent+probes+DCDHF-DA,+DHR+123+and+DHE+to+measure+reactive+oxygen+species+in+vitro.">Concerns in the application of fluorescent probes DCDHF-DA, DHR 123 and DHE to measure reactive oxygen species in vitro.</a> Toxicology in Vitro. 30, 578-582 (2015).</li><li>Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+kinetics+of+dihydroethidium+fluorescence+with+superoxide+using+xanthine+oxidase+and+hypoxanthine+assay.">Analysis of kinetics of dihydroethidium fluorescence with superoxide using xanthine oxidase and hypoxanthine assay.</a> Annals of Biomedical Engineering. 41, 327-337 (2013).</li><li>Hartig, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+image+analysis+and+manipulation+in+ImageJ.">Basic image analysis and manipulation in ImageJ.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2013).</li></ol>

For å vurdere om ZnO NP kan indusere apoptose i MRC5 fibroblaster, bruker vi Flow flowcytometri å skille cellene fra nekrotisk eller apoptotisk celle død. I normale levende celler, fosfatidylserin (PS) er lokalisert på cellemembranen. Hvis apoptose oppstår, PS er translocated til ekstracellulære pakningsvedlegget av plasma membranen, slik at bindingen av Annexin V merket med fluorescein (FITC Annexin V)29. På den annen side, er den røde-fluorescerende propidium iodide (PI), en nukleinsyre ...

Nanoteknologi refererer til anvendelse av nanosized materialer som brukes på tvers av alle vitenskapelige felt, inkludert medisin, materialer vitenskap, og biokjemi. For eksempel, ZnO NPs som er kjent for sine ultrafiolett spredning, kjemisk sensing, og anti-mikrobielle egenskaper, samt høy elektrisk ledningsevne, benyttes i produksjonen av ulike forbrukerprodukter som mat emballasje, kosmetikk, tekstil, gummi, batterier, katalysator for bil hale gass behandling, og biomedisinsk-relaterte applikasjoner1,2,3.
Men den spirende anvendelser av ZnO NP-baserte produkter, som fører til økt menneskelig eksponering for ZnO NPs, har reist bekymringer på sine potensielle bivirkninger på menneskers helse. En rekke in vitro Cellular studier har vist at ZnO NPs kan indusere oksidativt stress, autofagi-relatert cytotoksisitet, betennelser, og gentoksisitet4,5,6,7,8 . Spesielt er toksisitet av ZnO NPs antas å være forårsaket av oppløsningen av Zn å frigjøre Zn2 + ioner, samt overflaten reaktivitet av ZnO, noe som resulterer i mobilnettet ioniske og metabolske ubalanser som er knyttet til nedsatt ioniske homeostase og en Hemming av ion transport4,7,9,10. Viktigere, studier har vist at generering av reaktive oksygen arter (ROS) er en av de viktigste mekanismene underliggende ZnO NPs-assosiert toksisitet. Utilstrekkelig anti-oksidativt aktivitet etter ROS fornærmelse har vist å være ansvarlig for fremlokkende av cytotoksisitet og DNA-skade9. Den toksiske effekter av ZnO NPs har også blitt rapportert i dyremodeller, inkludert gnager1, sebrafisk11,12, så vel som virvelløse Drosophila13.
Drosophila fungerer som en veletablert alternativ dyremodell for toksisitet screening av kjemiske enheter og nanomaterialer (NMs)14,15. Det er viktig at det er høye nivåer av genetisk og fysiologisk likhet mellom menneske og Drosophila som rettferdiggjør bruken av Drosophila som en in vivo-modell for å evaluere biologiske reaksjoner på miljøgifter som NMs 16. Videre er det mange fordeler med å bruke Drosophila grunn av sin lille størrelse, kortlevetid, genetisk amenability, og enkelt og kostnadseffektivt vedlikehold. Dess, Drosophila har vært allment vedtatt for studiet av genetikk, molekylær og utviklingsmessige biologi, helt siden dens fulle Genova var fullt sekvensielt år siden tilbake i 2000, derfor gjør den egnet for en rekke høy gjennomstrømming screening og for å takle uløste biologiske spørsmål17,18,19,20,21. I de senere årene har en rekke studier knyttet til immunotoxicity med ulike typer NPs i Drosophila blitt rapportert15,22,23,24. Denne grunnleggende nye kunnskapen innhentet fra studiene ved hjelp av Drosophila har bidratt til å gi mer innsikt i vår forståelse av nanotoxicology.
ROS er en velkjent skyldige for cytotoksisitet og gentoksisitet forårsaket av NPs, spesielt metall-baserte NPs25. ROS er oksygen-inneholdende kjemiske arter med høyere reaktive egenskaper enn molekylær oksygen. Frie radikaler som superoxide radikale (O2-) og til og med, ikke-radikale molekyler som hydrogen peroxide (H2O2) kan fungere som ros. Under normale fysiologiske tilstand, er de pålagt å opprettholde mobilnettet homeostase26, men overdreven ros på grunn av overproduksjon eller feilregulering av antioksidant forsvar systemet kan forårsake oksidativt stress, fører til skade på proteiner, lipider og deoksyribonukleinsyre syre (DNA)27. For eksempel, som ROS nivåer øke og glutation (GSH) nivået avtar samtidig, forstyrrelse av adenosin trifosfat (ATP) syntese finner sted og melkesyre dehydrogenase (LDH) nivået øker i mediet, som kulminerte i celle død27.
Her gir vi protokoller for å utføre cellulære og genetiske analyser ved hjelp av kulturperler pattedyrceller og Drosophila å bestemme de potensielle bivirkningene av ZnO NPs. En oversikt over metoden som brukes for toksisitet studie av ZnO NPs er vist i figur 1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15% Methyl 4-Hydroxybenzoate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cncCK6/TM3, Sb</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>a gift from Dr. Kerppola T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cornmeal, glucose, yeast brewer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyAn ADP with Summit Software</td>
			<td>DAKO</td>
			<td></td>
			<td>https://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydroethidium (Hydroethidine)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D11347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>556547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucolin</td>
			<td>Supermarket</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC5 human lung fibroblast</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#8217;s Drosophila medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21720-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vectashield antifade mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wild- type Canton-S; Sod2N308/CyO</td>
			<td>NIG-FLY</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Oxide Nanoparticles</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>721077</td>
			<td>Refer Sheet 2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

toxicity study of zinc oxide nanoparticles in cell culture and in drosophila melanogaster

Sink oksid nanopartikler (ZnO NPs) har et bredt spekter av applikasjoner, men antall rapporter om ZnO NP-assosiert toksisitet har vokst raskt de siste årene. Men studier som belyse den underliggende mekanismer for ZnO NP-indusert toksisitet er sparsom. Vi bestemte toksisitet profilene til ZnO NPs ved hjelp av både in vitro og in vivo eksperimentelle modeller. En signifikant reduksjon i celle levedyktighet ble observert i ZnO NP-eksponert MRC5 lunge fibroblaster, som viser at ZnO NPs utøver cytotoksisk effekter. Tilsvarende interessant, gut eksponert for ZnO NPs utstilt en dramatisk økning i reaktive oksygen arter nivåer (ROS) i frukten fly Drosophila. Mer dyptgående studier er nødvendig for å etablere en risikovurdering for økt bruk av ZnO NPs av forbrukerne.

NP-eksponerte celler ble behandlet med celle farging reagenssett, etterfulgt av celle sortering ved hjelp av Flow flowcytometri. ZnO NP-behandlede celler (nederst, høyre panel) viser en høyere prosentandel av tidlig (R3)/sen apoptotisk celler (R6) enn kontroll celler (R5, bunn, venstre panel). Nekrotisk celle død er betegnet av R4 (øverst, høyre panel) (figur 2). Resultatene av FITC/Annexin V-analysen for ZnO NP-behandlede MRC-5-fibroblaster er vist i <s...

Watch this Scientific Journal Video about Toxicity Study of Zinc Oxide Nanoparticles in Cell Culture and in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Toxicity Study of Zinc Oxide Nanoparticles in Cell Culture and in Drosophila melanogaster

Vi beskriver en detaljert protokoll for evaluering av toksikologiske profiler av sink oksid nanopartikler (ZnO NPs) spesielt, den type celle død i humant MRC5 lunge fibroblaster og ROS formasjon i frukten fly Drosophila.

Toksisitet studie av sink oksid nanopartikler i Cell kultur og i Drosophila melanogaster

Zinc oxide nanoparticles (ZnO NPs) have a wide range of applications, but the number of reports on ZnO NP-associated toxicity has grown rapidly in recent ...

Våre metoder skisserer en enkel og gjentatt måte å studere nanotoksisitet på, for eksempel å undersøke celledødstypene og undersøke produksjonen av reaktive oksygenarter. Fluorescensaktivert cellesortering er et strengt format som gjør at vi kan studere underpopulasjonen av celler og de voksende forskjellige typer celledød. DHE-sondestudiemetoden gjør det mulig for oss å oppdage og kvantifisere reaktive oksygenarter etterfulgt av strømningscytometri, mikroskopisk bildebehandling med høyt innhold og ved å pare basert fluorescensanalyse.Til å begynne med, legg et Eppendorf-rør som inneholder sinkoksid nanopartikler i sinkoksid nanopartikkel lagerløsning i en sonicator i 15 minutter. Forbered sinkoksid nanopartikler ved ulike konsentrasjoner ved hjelp av en mg per milliliter sinkoksid nanopartikkel lager. Deretter, i et biosikkerhetsskap, frø MRC5 menneskelige lunge fibroblaster på tre seks-brønns kultur plater i konsentrasjonen av en ganger 10 til de femte cellene per brønn.Inkuber cellene ved 37 grader Celsius. Etter en dag, behandle cellene med to milliliter sinkoksid nanopartikler i åtte timer, 16 timer eller 24 timer. På hvert tidspunkt samler cellene inn i et 15-milliliter sentrifugerør, og sentrifuge ved 300 ganger g i fem minutter.Vask cellepellets to ganger med fosfatbufret saltvann, og gjenbruk deretter cellene med 1X bindingsbuffer. Deretter legger du til fem mikroliter fitc annexin V-flekk i fem mikroliter av propidiumjodid DNA-flekk. Inkuber de beisede cellene i 15 minutter ved romtemperatur i mørket.Før du sorterer cellene etter strømningscytometri, må du fylle opp prøvene med ytterligere 400 mikroliter 1X bindingsbuffer. Tabuler stolpediagrammet ved hjelp av medianintensiteten som er oppnådd. Bruk nå en pipette til å legge til en milliliter nanopartikler ved forskjellige konsentrasjoner i hetteglass, etterfulgt av ni milliliter flymat for å lage en endelig konsentrasjon på 0,1 milligram per milliliter, 0,25 milligram per milliliter, eller 0,5 milligram per milliliter sinkoksid nanopartikler.Pipetten opp og ned for å blandes grundig. La flymat som inneholder sinkoksid nanopartikler avkjøles i minst to til tre timer før bruk. Bedøv deretter voksne mannlige og kvinnelige fluer i et hetteglass med karbondioksid, og introdusere fem mannlige fluer og fem kvinnelige fluer i hvert hetteglass i fem dager.La dem parre seg og legge egg på overflaten av maten. Etter bedøvelse fjerner du foreldrefluene og lar eggene gjennomgå videre utvikling ved romtemperatur, som består av fire forskjellige utviklingsstadier. Embryonisk, larval, pupal og voksen stadium.Etter 72 til 120 timer utvikler nylagte egg seg til sen tredje instar larver. Ved hjelp av tang, samle larver fra veggen av hetteglassene for analyser. I en brønn av en disseksjonsrett med disseksjonsmedium eller PBS, legg larvene i løsningen.Under stereomikroskopet bruker du spissen av tangene til å lage et lite hull, og bryter åpne skjellaget av larver. Trekk forsiktig ut tarmen. Legg tarmen i et 1,5 milliliter mikrocentrifugerør som inneholder Schneiders Drosophila Medium.Tilsett en mikroliter av DHE-sonden, og inkuber i mørket ved romtemperatur i 10 minutter. Vask tarmen tre ganger ved hjelp av Schneiders Medium hvert femte minutt. Monter tarmen på glasssklier, og forsyn med 10 mikroliter antifademonteringsmedium som inneholder DAPI.Ta bilder under et konfokalt mikroskop. For å måle fluorescens, importer de fangede fluorescensbildene som er oppnådd ved hjelp av fluorescensmikroskopi eller konfokal laserskanningsmikroskopi til ImageJ-programvaren. Klikk på analyser-menyen, og velg angi målinger.Velg utdatamålet, for eksempel områdeintegrert intensitet og gjennomsnittlig gråverdi. Velg et område uten fluorescens for å angi bakgrunnen. Klikk på mål.Eksporter dataene til regnearket, og bestem den korrigerte totale cellefluorescensen. Lag et stolpediagram, og utfør statistisk analyse. I denne studien viser sinkoksid nanopartikkelbehandlede celler en høyere prosentandel av tidlige R3 eller sene apoptotiske R6-celler enn kontrollceller R5. Nekrotisk celledød ble betegnet av R4. Tarmen hentet fra drosophila larven ble delt inn i tre diskrete domener av forskjellig utviklingsopprinnelse.Nemlig foregut, midgut, og hindgut. DHE lager har en tendens til å utløpe ganske raskt, så vær forsiktig med lagerløsningen du bruker. Alternativt kan du prøve andre sonder, for eksempel celle Roche, som er designet for å oppdage intracellulær ROS i grønne signaler, og det er mer fotoabel enn DHE.Vår protokoll gir en generell oversikt for å studere intracellulær ROS-produksjon, og kvantifisering av ROS-nivå for nanotoksisitetsstudie. DMSO er kjent for å være et bedre løsningsmiddel for DHE enn PBS. DMSO er imidlertid giftig.Derfor vil jeg råde brukeren til å begrense hele prosessen for å studere til 30 minutter maksimum. Dette er fordi du kan observere et falskt positivt resultat som DMSO kan forårsake celledød.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Toxicity Study of Zinc Oxide Nanoparticles in Cell Culture and in Drosophila melanogaster

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an ...

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

Systemisk bakteriell infeksjon og immunforsvar fenotyper i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of ...

Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing

Kupffer Cell Isolasjon for Nanopartikkel Toxicity Testing

The large majority of in vitro nanotoxicological studies have used immortalized cell lines for their practicality. However, results from nanoparticle ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Nøytrofile Isolering og analyse for å fastslå deres rolle i lymfom Cell Følsomhet for Terapeutiske midler

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Evaluering av effekt og toksisitet av RNA Targeting HIV-1 Produksjon for bruk i Gene eller Medikamentell behandling

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

Utvinning av Hemocytes fra Drosophila melanogaster larver for mikrobielle infeksjoner og analyse

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Karakteristikk av Thymus avhengig og uavhengig av Thymus immunglobulin Isotype svar i mus med enzym knyttet Immunosorbent analysen

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

Etablering av Viral infeksjon og analyse av Host-Virus samhandling i Drosophila Melanogaster

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Menneskelig Colonoid Monolayers å studere interaksjonen mellom patogener, Commensals og vert Intestinal epitel

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...