Name: toxicity study of zinc oxide nanoparticles in cell culture and in drosophila melanogaster
Uploaded: 2019-09-19T13:30:00
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O estudo foi apoiado pelo número de subvenção R706-000-043-490. O estudo não representa a visão do patrocinador da subvenção.

1. fluorescência ativada Cell Sorting (FACS) análise em células vividas/fixas
<ol><li>SONICATE ZnO NPs em suspensão por 15 min.</li>
	<li>Prepare ZnO NPs em várias concentrações (por exemplo, 0, 10, 25, 50.100 e 200 μg/mL) usando 1 mg/mL ZnO NP solução de ações para o tratamento de células cultivadas.</li>
	<li>Sementes MRC5 fibroblastos pulmonares humanos (1 x 105 células/poço) em uma placa de cultura de 6 poços por dia de antecedência, e depois tratar as células com 2 ml de ZnO NPS (em tr...

<ol>
	<li>Kim, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+of+100+nm+zinc+oxide+nanoparticles:+a+report+of+90-day+repeated+oral+administration+in+Sprague+Dawley+rats.">Toxicity of 100 nm zinc oxide nanoparticles: a report of 90-day repeated oral administration in Sprague Dawley rats.</a> International Journal of Nanomedicine. 9 Suppl 2, 109-126 (2014).</li><li>Xie, Y., He, Y., Irwin, P. L., Jin, T., Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibacterial+activity+and+mechanism+of+action+of+zinc+oxide+nanoparticles+against+Campylobacter+jejuni.">Antibacterial activity and mechanism of action of zinc oxide nanoparticles against Campylobacter jejuni.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77, 2325-2331 (2011).</li><li>Colvin, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+environmental+impact+of+engineered+nanomaterials.">The potential environmental impact of engineered nanomaterials.</a> Nature Biotechnology. 21, 1166-1170 (2003).</li><li>De Angelis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+ZnO+and+TiO(2)+nanoparticles:+physicochemical+characterisation+and+toxicological+effects+on+human+colon+carcinoma+cells.">Comparative study of ZnO and TiO(2) nanoparticles: physicochemical characterisation and toxicological effects on human colon carcinoma cells.</a> Nanotoxicology. 7, 1361-1372 (2013).</li><li>Johnson, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+exposure+to+ZnO+nanoparticles+induces+autophagic+immune+cell+death.">Acute exposure to ZnO nanoparticles induces autophagic immune cell death.</a> Nanotoxicology. 9, 737-748 (2015).</li><li>Singh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoGenotoxicology:+the+DNA+damaging+potential+of+engineered+nanomaterials.">NanoGenotoxicology: the DNA damaging potential of engineered nanomaterials.</a> Biomaterials. 30, 3891-3914 (2009).</li><li>Song, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+dissolved+zinc+ion+and+reactive+oxygen+species+in+cytotoxicity+of+ZnO+nanoparticles.">Role of the dissolved zinc ion and reactive oxygen species in cytotoxicity of ZnO nanoparticles.</a> Toxicology Letters. 199, 389-397 (2010).</li><li>Wahab, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZnO+nanoparticles+induced+oxidative+stress+and+apoptosis+in+HepG2+and+MCF-7+cancer+cells+and+their+antibacterial+activity.">ZnO nanoparticles induced oxidative stress and apoptosis in HepG2 and MCF-7 cancer cells and their antibacterial activity.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 117, 267-276 (2014).</li><li>Namvar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+effects+of+biosynthesized+zinc+oxide+nanoparticles+on+murine+cell+lines.">Cytotoxic effects of biosynthesized zinc oxide nanoparticles on murine cell lines.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative. 2015, (2015).</li><li>Wong, S. W., Leung, P. T., Djurisic, A. B., Leung, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicities+of+nano+zinc+oxide+to+five+marine+organisms:+influences+of+aggregate+size+and+ion+solubility.">Toxicities of nano zinc oxide to five marine organisms: influences of aggregate size and ion solubility.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 396, 609-618 (2010).</li><li>Hua, J., Vijver, M. G., Richardson, M. K., Ahmad, F., Peijnenburg, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle-specific+toxic+effects+of+differently+shaped+zinc+oxide+nanoparticles+to+zebrafish+embryos+(Danio+rerio).">Particle-specific toxic effects of differently shaped zinc oxide nanoparticles to zebrafish embryos (Danio rerio).</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 33, 2859-2868 (2014).</li><li>Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+ZnO+nanoparticles+exposure+induces+developmental+toxicity,+oxidative+stress+and+DNA+damage+in+embryo-larval+zebrafish.">Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish.</a> Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).</li><li>Alaraby, M., Annangi, B., Hernandez, A., Creus, A., Marcos, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+study+of+the+harmful+effects+of+ZnO+nanoparticles+using+Drosophila+melanogaster+as+an+in+vivo+model.">A comprehensive study of the harmful effects of ZnO nanoparticles using Drosophila melanogaster as an in vivo model.</a> Journal of Hazardous Materials. 296, 166-174 (2015).</li><li>Rand, M. 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K., Mishra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+as+a+potential+teratogen:+a+lesson+learnt+from+fruit+fly.">Nanoparticles as a potential teratogen: a lesson learnt from fruit fly.</a> Nanotoxicology. , 1-27 (2018).</li><li>Jovanovic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+a+human+food+additive,+titanium+dioxide+nanoparticles+E171,+on+Drosophila+melanogaster+-+a+20+generation+dietary+exposure+experiment.">The effects of a human food additive, titanium dioxide nanoparticles E171, on Drosophila melanogaster - a 20 generation dietary exposure experiment.</a> Scientific Reports. 8, (2018).</li><li>Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Toxicity+of+Nanoparticles+to+Human+Endothelial+Cells.">The Toxicity of Nanoparticles to Human Endothelial Cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1048, 59-69 (2018).</li><li>Akhtar, M. J., Ahamed, M., Alhadlaq, H. A., Alshamsan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+ROS+scavenging+and+antioxidant+signalling+by+redox+metallic+and+fullerene+nanomaterials:+Potential+implications+in+ROS+associated+degenerative+disorders.">Mechanism of ROS scavenging and antioxidant signalling by redox metallic and fullerene nanomaterials: Potential implications in ROS associated degenerative disorders.</a> Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1861, 802-813 (2017).</li><li>Akter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+on+silver+nanoparticles-induced+cytotoxicity:+Physicochemical+properties+and+perspectives.">A systematic review on silver nanoparticles-induced cytotoxicity: Physicochemical properties and perspectives.</a> Journal of Advanced Research. 9, 1-16 (2018).</li><li>Vecchio, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fruit+fly+in+the+nanoworld:+once+again+Drosophila+contributes+to+environment+and+human+health.">A fruit fly in the nanoworld: once again Drosophila contributes to environment and human health.</a> Nanotoxicology. 9, 135-137 (2015).</li><li>Marino, G., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+apoptotic+phosphatidylserine+exposure.">Mechanisms of apoptotic phosphatidylserine exposure.</a> Cell Research. 23, 1247-1248 (2013).</li><li>Stoddart, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Viability+Assays:+Introduction.">Cell Viability Assays: Introduction.</a> Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols. , (2011).</li><li>Yazdani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concerns+in+the+application+of+fluorescent+probes+DCDHF-DA,+DHR+123+and+DHE+to+measure+reactive+oxygen+species+in+vitro.">Concerns in the application of fluorescent probes DCDHF-DA, DHR 123 and DHE to measure reactive oxygen species in vitro.</a> Toxicology in Vitro. 30, 578-582 (2015).</li><li>Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+kinetics+of+dihydroethidium+fluorescence+with+superoxide+using+xanthine+oxidase+and+hypoxanthine+assay.">Analysis of kinetics of dihydroethidium fluorescence with superoxide using xanthine oxidase and hypoxanthine assay.</a> Annals of Biomedical Engineering. 41, 327-337 (2013).</li><li>Hartig, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+image+analysis+and+manipulation+in+ImageJ.">Basic image analysis and manipulation in ImageJ.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2013).</li></ol>

A fim avaliar se ZnO NP pode induzir o apoptose em fibroblastos MRC5, nós usamos o fluxo citometria para distinguir as pilhas da morte Necrotic ou apoptóticas da pilha. Em células normais ao vivo, a fosfatidilserina (PS) é localizada na membrana celular. Se a apoptose ocorre, o PS é translocalizado para o folheto extracelular da membrana plasmática, permitindo a ligação da anexina V rotulada com fluoresceina (FITC anexina V)29. De um lado, o iodeto vermelho-fluorescente do propidium (PI), ...

A nanotecnologia refere-se à aplicação de materiais nanodimensionados que são utilizados em todos os campos científicos, incluindo medicina, ciência dos materiais e bioquímica. Por exemplo, ZnO NPs que são conhecidos por sua dispersão ultravioleta, sensoriamento químico, e propriedades antimicrobianas, bem como alta condutividade elétrica, são utilizados na produção de vários produtos de consumo, tais como embalagens de alimentos, cosméticos, têxteis, borrachas, baterias, catalisador para o tratamento de gás de cauda de automóvel, e aplicações biomédicas1,2,3.
No entanto, as aplicações crescentes de produtos baseados em ZnO NP, que levam ao aumento da exposição humana ao ZnO NPs, suscitou preocupações sobre os seus potenciais efeitos adversos na saúde humana. Vários estudos celulares in vitro demonstraram que ZnO NPS pode induzir estresse oxidativo, citotoxicidade relacionada à autofagia, inflamação e genotoxicidade4,5,6,7,8 . Notavelmente, presume-se que a toxicidade de ZnO NPs é causada pela dissolução de Zn para liberar Zn2 + íons, bem como a reatividade superficial de ZnO, resultando em desequilíbrios celulares iônicos e metabólicos que estão ligados com a homeostase iônica prejudicada e um inibição do transporte iônico4,7,9,10. É importante ressaltar que estudos demonstraram que a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) é um dos mecanismos primários subjacentes à toxicidade associada à ZnO NPs. A atividade antioxidativa insuficiente que segue o insulto de ROS foi mostrada para ser responsável para provocar a citotoxicidade e dano do ADN9. Os efeitos tóxicos de ZnO NPS também foram relatados em modelos animais, incluindo roedor1, zebrafish11,12, bem como a Drosophilade invertebrados13.
A Drosophila serve como um modelo animal alternativo bem estabelecido para a triagem de toxicidade de entidades químicas e nanomateriais (NMS)14,15. É importante ressaltar que existem altos níveis de similaridade genética e fisiológica entre o ser humano e a Drosophila que justifica o uso da Drosophila como um modelo in vivo para avaliar respostas biológicas a contaminantes ambientais, como NMS 16. Além disso, existem muitas vantagens de usar a Drosophila devido ao seu tamanho pequeno, tempo curto, Amenability genético, e fácil e custo-benefício de manutenção. Além disso, a Drosophila tem sido amplamente adotada para o estudo da genética, biologia molecular e do desenvolvimento, desde que seu genoma completo foi totalmente seqüenciado anos atrás em 2000, tornando-o adequado para uma variedade de triagem de alta taxa de transferência e para abordar questões biológicas não resolvidas17,18,19,20,21. Nos últimos anos, vários estudos relacionados à imunotoxicidade utilizando diferentes tipos de NPS na Drosophila foram relatados15,22,23,24. Este novo conhecimento fundamental obtido a partir dos estudos que utilizam a Drosophila tem ajudado a fornecer mais insights sobre a nossa compreensão da nanotoxicologia.
ROS é um bem conhecido culpado de citotoxicidade e genotoxicidade causada por NPs, em particular, NPs baseados em metal25. ROS são espécies químicas contendo oxigênio com propriedades reativas mais elevadas do que o oxigênio molecular. Os radicais livres tais como o radical do superóxido (O2-) e mesmo, moléculas não-radicais tais como o peróxido de hidrogênio (H2O2) podem actuar como Ros. condições fisiológicas normais, eles são obrigados a manter a homeostase celular26, no entanto, Ros excessivos devido à superprodução ou desregulação do sistema de defesa antioxidante pode causar estresse oxidativo, levando a danos às proteínas, lipídios e Ácido desoxirribonucleico (DNA)27. Por exemplo, à medida que os níveis de ROS aumentam e o nível de glutationa (GSH) diminui concomitantemente, a ruptura da síntese de trifosfato de adenosina (ATP) ocorre e o nível de lactato desidrogenase (LDH) aumenta no meio, culminando na morte celular27.
Aqui, nós fornecemos protocolos para a realização de análises celulares e genéticas usando células de mamíferos cultivadas e Drosophila para determinar os potenciais efeitos adversos de ZnO NPS. Uma visão geral do método utilizado para o estudo de toxicidade de ZnO NPs é mostrada na Figura 1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15% Methyl 4-Hydroxybenzoate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cncCK6/TM3, Sb</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>a gift from Dr. Kerppola T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cornmeal, glucose, yeast brewer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyAn ADP with Summit Software</td>
			<td>DAKO</td>
			<td></td>
			<td>https://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydroethidium (Hydroethidine)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D11347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>556547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucolin</td>
			<td>Supermarket</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC5 human lung fibroblast</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#8217;s Drosophila medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21720-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vectashield antifade mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wild- type Canton-S; Sod2N308/CyO</td>
			<td>NIG-FLY</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Oxide Nanoparticles</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>721077</td>
			<td>Refer Sheet 2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

toxicity study of zinc oxide nanoparticles in cell culture and in drosophila melanogaster

As nanopartículas de óxido de zinco (ZnO NPs) têm uma ampla gama de aplicações, mas o número de relatos sobre a toxicidade associada ao ZnO NP cresceu rapidamente nos últimos anos. No entanto, estudos que elucidar os mecanismos subjacentes para a toxicidade induzida por ZnO NP são escassos. Nós determinamos os perfis da toxicidade de ZnO NPs usando modelos in vitro e in vivo experimentais. Uma diminuição significativa na viabilidade celular foi observada em fibroblastos pulmonares MRC5 expostos ao ZnO NP, mostrando que os NPs ZnO exercem efeitos citotóxicos. Da mesma forma, curiosamente, o intestino exposto a ZnO NPs exibiu um aumento dramático nos níveis de espécies reativas de oxigênio (ROS) na mosca da fruta Drosophila. São necessários estudos mais aprofundados para estabelecer uma avaliação de risco para o aumento da utilização de ZnO NPs pelos consumidores.

As pilhas NP-expostas foram processadas com a pilha que mancha o jogo do reagente, seguida pela seleção da pilha usando a citometria do fluxo. As células tratadas com NP ZnO (inferior, painel direito) exibem uma percentagem mais elevada de células apoptóticas precoces (R3)/tardias (R6) do que as células de controlo (R5, inferior, painel esquerdo). A morte celular necrótica é indicada pelo R4 (painel superior, direito) (Figura 2). Os resultados do ensa...

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Toxicity Study of Zinc Oxide Nanoparticles in Cell Culture and in Drosophila melanogaster

Nós descrevemos um protocolo detalhado para avaliar os perfis toxicológicos de nanopartículas do óxido de zinco (ZnO NPs) no detalhe, o tipo de morte da pilha em fibroblastos humanos do pulmão MRC5 e na formação dos ROS na mosca da fruta Drosophila.

Estudo de toxicidade de nanopartículas de óxido de zinco em cultura celular e em Drosophila melanogaster

Zinc oxide nanoparticles (ZnO NPs) have a wide range of applications, but the number of reports on ZnO NP-associated toxicity has grown rapidly in recent ...

Nossos métodos delineiam uma maneira simples e repetida de estudar a nanotoxicidade, como examinar os tipos de morte celular e examinar a produção de espécies reativas de oxigênio. A fluorescência ativada de classificação celular é um formato rigoroso que nos permite estudar a subpopulação das células e os diferentes tipos de morte celular. O método de estudo da sonda DHE nos permite detectar e quantificar espécies reativas de oxigênio seguidas de citometria de fluxo, imagens microscópicas de alto conteúdo e por análise de fluorescência baseada em acoplamento.Para começar, coloque um tubo Eppendorf contendo nanopartículas de óxido de zinco em solução de nanopartículas de óxido de zinco em um sonicator por 15 minutos. Prepare as nanopartículas de óxido de zinco em várias concentrações usando um estoque de nanopartículas de óxido de zinco de um miligrama. Então, em um armário de biossegurança, os fibroblastos pulmonares humanos MRC5 em três placas de seis poços de cultura na concentração de uma vez 10 para as quintas células por poço.Incubar as células a 37 graus Celsius. Após um dia, trate as células com dois mililitros de nanopartículas de óxido de zinco por oito horas, 16 horas ou 24 horas. Em cada ponto de tempo, colete as células em um tubo de centrífuga de 15 mililitros e centrífuga a 300 vezes g por cinco minutos.Lave as pelotas celulares duas vezes com soro fisiológico tamponado por fosfato e, em seguida, resuspense as células com tampão de ligação 1X. Em seguida, adicione cinco microliters de mancha FITC Annexin V em cinco microliters de mancha de DNA de iodeto propidium. Incubar as células manchadas por 15 minutos à temperatura ambiente no escuro.Antes de classificar as células por citometria de fluxo, cubra as amostras com um buffer adicional de 400 microliters de 1X. Tabular o gráfico de barras usando a intensidade mediana obtida. Agora use uma pipeta para adicionar um mililitro de nanopartículas em diferentes concentrações em frascos, seguido por nove mililitros de alimentos voadores para fazer uma concentração final de 0,1 miligramas por mililitro, 0,25 miligramas por mililitro, ou 0,5 miligramas por nanopartículas de óxido de zinco mililitro.Pipeta para cima e para baixo para misturar bem. Permita que os alimentos de mosca que contenham nanopartículas de óxido de zinco esfriem por pelo menos duas a três horas antes do uso. Em seguida, anestesiar moscas adultas macho e fêmea em um frasco com dióxido de carbono, e introduzir cinco moscas machos e cinco moscas fêmeas em cada frasco por cinco dias.Permita-lhes acasalar e colocar ovos na superfície do alimento. Após a anestesia, remova as moscas parentais e permita que os ovos se submetam a um novo desenvolvimento à temperatura ambiente, que consiste em quatro estágios diferentes de desenvolvimento. Estágio embrionário, larval, pupal e adulto.Após 72 a 120 horas, ovos recém-colocados se desenvolvem em terceiras larvas instar. Usando fórceps, recolhe as larvas da parede dos frascos para análises. Em um poço de um prato de dissecção com meio de dissecção ou PBS, coloque as larvas na solução.Sob o estereótipo, use a ponta dos fórceps para fazer um pequeno buraco, e abra a camada de cutícula das larvas. Puxe cuidadosamente o intestino. Coloque o intestino em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo o Meio Drosophila de Schneider.Adicione um microliter da sonda DHE e incubar no escuro à temperatura ambiente por 10 minutos. Lave o intestino três vezes usando o Meio de Schneider a cada cinco minutos. Monte o intestino em lâminas de vidro e forneça com 10 microliters de meio de montagem antifado contendo DAPI.Capture imagens sob um microscópio confocal. Para medir a fluorescência, importe as imagens de fluorescência capturadas adquiridas usando microscopia de fluorescência ou microscopia de varredura a laser confocal no software ImageJ. Clique no menu analisar e selecione definir medidas.Selecione a medida de saída, como intensidade integrada de área e valor cinza médio. Selecione uma região sem fluorescência para definir o fundo. Clique na medida.Exporte os dados para a planilha e determine a fluorescência celular total corrigida. Construa um gráfico de barras e realize análises estatísticas. Neste estudo, as células tratadas com nanopartículas de óxido de zinco apresentam uma porcentagem maior de células R6 apoptóticas precoces ou tardias do que as células de controle R5. A morte da célula necrosada foi denotada pelo R4. O intestino extraído da larva de drosophila foi dividido em três domínios discretos de diferentes origens de desenvolvimento.Ou seja, o foregut, midgut e hindgut. As ações da DHE tendem a expirar rapidamente, por isso tenha cuidado com a solução de estoque que você está usando. Alternativamente, você pode experimentar outras sondas, por exemplo, cell Roche, que foi projetada para detectar o ROS intracelular em sinais verdes, e que é mais fotostível do que o DHE.Nosso protocolo fornece um esboço geral para estudar a produção de ROS intracelular, e quantificação do nível ros para estudo de nanotoxicidade. O DMSO é conhecido por ser um solvente melhor para o DHE do que o PBS. No entanto, o DMSO é tóxico.Portanto, gostaria de aconselhar o usuário a restringir todo o processo para estudar até 30 minutos no máximo. Isso porque você pode observar um resultado falso positivo, pois o DMSO pode causar morte celular.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Toxicity Study of Zinc Oxide Nanoparticles in Cell Culture and in Drosophila melanogaster

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

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T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Imunologia e Infecção

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

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Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an ...

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

Infecção bacteriana sistêmica e Imune Defesa Phenotypes em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of ...

Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing

Kupffer isolamento celular para Nanoparticle Toxicity Testing

The large majority of in vitro nanotoxicological studies have used immortalized cell lines for their practicality. However, results from nanoparticle ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Isolamento de neutrófilos e análise para determinar seu papel na linfoma sensibilidade das células a agentes terapêuticos

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Avaliação da eficácia e toxicidade de RNAs Segmentação HIV-1 Produção para uso em Gene ou Quimioterapia

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

Extração de hemócitos de larvas de Drosophila melanogaster para infecção microbiana e análise

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Caracterização das respostas de isotipo de imunoglobulina Timo-dependentes e Timo-independente nos ratos usando ensaio enzima-lig da imunoabsorção

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Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

Estabelecimento de infecção Viral e análise da interação vírus-hospedeiro em Drosophila Melanogaster.

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Colonoid humana monocamadas para estudar interações entre epitélio Intestinal do hospedeiro, comensais e patógenos

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