Name: toxicity study of zinc oxide nanoparticles in cell culture and in drosophila melanogaster
Uploaded: 2019-09-19T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Toxicity Study of Zinc Oxide Nanoparticles in Cell Culture and in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Исследование было поддержано номером гранта R706-000-043-490. Исследование не отражает мнение спонсора гранта.

1. Флуоресценция Активированная сортировка клеток (FACS) Анализ на жил /фиксированных клеток
<ol><li>Sonicate NO NPs в подвеске на 15 мин.</li>
	<li>Подготовка NO NPs в различных концентрациях (например, 0, 10, 25, 50,100 и 200 мкг/мл) с использованием 1 мг/мл NP-акционерного раствора для лечения культивированных клето...

<ol>
	<li>Kim, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+of+100+nm+zinc+oxide+nanoparticles:+a+report+of+90-day+repeated+oral+administration+in+Sprague+Dawley+rats.">Toxicity of 100 nm zinc oxide nanoparticles: a report of 90-day repeated oral administration in Sprague Dawley rats.</a> International Journal of Nanomedicine. 9 Suppl 2, 109-126 (2014).</li><li>Xie, Y., He, Y., Irwin, P. L., Jin, T., Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibacterial+activity+and+mechanism+of+action+of+zinc+oxide+nanoparticles+against+Campylobacter+jejuni.">Antibacterial activity and mechanism of action of zinc oxide nanoparticles against Campylobacter jejuni.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77, 2325-2331 (2011).</li><li>Colvin, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+environmental+impact+of+engineered+nanomaterials.">The potential environmental impact of engineered nanomaterials.</a> Nature Biotechnology. 21, 1166-1170 (2003).</li><li>De Angelis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+ZnO+and+TiO(2)+nanoparticles:+physicochemical+characterisation+and+toxicological+effects+on+human+colon+carcinoma+cells.">Comparative study of ZnO and TiO(2) nanoparticles: physicochemical characterisation and toxicological effects on human colon carcinoma cells.</a> Nanotoxicology. 7, 1361-1372 (2013).</li><li>Johnson, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+exposure+to+ZnO+nanoparticles+induces+autophagic+immune+cell+death.">Acute exposure to ZnO nanoparticles induces autophagic immune cell death.</a> Nanotoxicology. 9, 737-748 (2015).</li><li>Singh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoGenotoxicology:+the+DNA+damaging+potential+of+engineered+nanomaterials.">NanoGenotoxicology: the DNA damaging potential of engineered nanomaterials.</a> Biomaterials. 30, 3891-3914 (2009).</li><li>Song, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+dissolved+zinc+ion+and+reactive+oxygen+species+in+cytotoxicity+of+ZnO+nanoparticles.">Role of the dissolved zinc ion and reactive oxygen species in cytotoxicity of ZnO nanoparticles.</a> Toxicology Letters. 199, 389-397 (2010).</li><li>Wahab, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZnO+nanoparticles+induced+oxidative+stress+and+apoptosis+in+HepG2+and+MCF-7+cancer+cells+and+their+antibacterial+activity.">ZnO nanoparticles induced oxidative stress and apoptosis in HepG2 and MCF-7 cancer cells and their antibacterial activity.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 117, 267-276 (2014).</li><li>Namvar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+effects+of+biosynthesized+zinc+oxide+nanoparticles+on+murine+cell+lines.">Cytotoxic effects of biosynthesized zinc oxide nanoparticles on murine cell lines.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative. 2015, (2015).</li><li>Wong, S. W., Leung, P. T., Djurisic, A. B., Leung, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicities+of+nano+zinc+oxide+to+five+marine+organisms:+influences+of+aggregate+size+and+ion+solubility.">Toxicities of nano zinc oxide to five marine organisms: influences of aggregate size and ion solubility.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 396, 609-618 (2010).</li><li>Hua, J., Vijver, M. G., Richardson, M. K., Ahmad, F., Peijnenburg, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle-specific+toxic+effects+of+differently+shaped+zinc+oxide+nanoparticles+to+zebrafish+embryos+(Danio+rerio).">Particle-specific toxic effects of differently shaped zinc oxide nanoparticles to zebrafish embryos (Danio rerio).</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 33, 2859-2868 (2014).</li><li>Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+ZnO+nanoparticles+exposure+induces+developmental+toxicity,+oxidative+stress+and+DNA+damage+in+embryo-larval+zebrafish.">Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish.</a> Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).</li><li>Alaraby, M., Annangi, B., Hernandez, A., Creus, A., Marcos, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+study+of+the+harmful+effects+of+ZnO+nanoparticles+using+Drosophila+melanogaster+as+an+in+vivo+model.">A comprehensive study of the harmful effects of ZnO nanoparticles using Drosophila melanogaster as an in vivo model.</a> Journal of Hazardous Materials. 296, 166-174 (2015).</li><li>Rand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophotoxicology:+the+growing+potential+for+Drosophila+in+neurotoxicology.">Drosophotoxicology: the growing potential for Drosophila in neurotoxicology.</a> Neurotoxicology and Teratology. 32, 74-83 (2010).</li><li>Ong, C., Yung, L. Y., Cai, Y., Bay, B. H., Baeg, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+as+a+model+organism+to+study+nanotoxicity.">Drosophila melanogaster as a model organism to study nanotoxicity.</a> Nanotoxicology. 9, 396-403 (2015).</li><li>Hoffmann, J. A., Reichhart, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+innate+immunity:+an+evolutionary+perspective.">Drosophila innate immunity: an evolutionary perspective.</a> Nature Immunology. 3, 121-126 (2002).</li><li>Hughes, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+as+a+genetic+model+for+studying+pathogenic+human+viruses.">Drosophila as a genetic model for studying pathogenic human viruses.</a> Virology. 423, 1-5 (2012).</li><li>Jennings, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+-+a+versatile+model+in+biology+&amp;+medicine.">Drosophila - a versatile model in biology &amp; medicine.</a> Materials Today. 14, 190-195 (2011).</li><li>Adams, M. D., Sekelsky, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+sequence+to+phenotype:+reverse+genetics+in+Drosophila+melanogaster.">From sequence to phenotype: reverse genetics in Drosophila melanogaster.</a> Nature Reviews Genetics. 3, 189-198 (2002).</li><li>Adams, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+sequence+of+Drosophila+melanogaster.">The genome sequence of Drosophila melanogaster.</a> Science. 287, 2185-2195 (2000).</li><li>Ong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+nanoparticles+disrupt+germline+stem+cell+maintenance+in+the+Drosophila+testis.">Silver nanoparticles disrupt germline stem cell maintenance in the Drosophila testis.</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li><li>Alaraby, M., Demir, E., Hernandez, A., Marcos, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+potential+harmful+effects+of+CdSe+quantum+dots+by+using+Drosophila+melanogaster+as+in+vivo+model.">Assessing potential harmful effects of CdSe quantum dots by using Drosophila melanogaster as in vivo model.</a> Science of the Total Environment. 530-531, 66-75 (2015).</li><li>Barik, B. K., Mishra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+as+a+potential+teratogen:+a+lesson+learnt+from+fruit+fly.">Nanoparticles as a potential teratogen: a lesson learnt from fruit fly.</a> Nanotoxicology. , 1-27 (2018).</li><li>Jovanovic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+a+human+food+additive,+titanium+dioxide+nanoparticles+E171,+on+Drosophila+melanogaster+-+a+20+generation+dietary+exposure+experiment.">The effects of a human food additive, titanium dioxide nanoparticles E171, on Drosophila melanogaster - a 20 generation dietary exposure experiment.</a> Scientific Reports. 8, (2018).</li><li>Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Toxicity+of+Nanoparticles+to+Human+Endothelial+Cells.">The Toxicity of Nanoparticles to Human Endothelial Cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1048, 59-69 (2018).</li><li>Akhtar, M. J., Ahamed, M., Alhadlaq, H. A., Alshamsan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+ROS+scavenging+and+antioxidant+signalling+by+redox+metallic+and+fullerene+nanomaterials:+Potential+implications+in+ROS+associated+degenerative+disorders.">Mechanism of ROS scavenging and antioxidant signalling by redox metallic and fullerene nanomaterials: Potential implications in ROS associated degenerative disorders.</a> Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1861, 802-813 (2017).</li><li>Akter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+on+silver+nanoparticles-induced+cytotoxicity:+Physicochemical+properties+and+perspectives.">A systematic review on silver nanoparticles-induced cytotoxicity: Physicochemical properties and perspectives.</a> Journal of Advanced Research. 9, 1-16 (2018).</li><li>Vecchio, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fruit+fly+in+the+nanoworld:+once+again+Drosophila+contributes+to+environment+and+human+health.">A fruit fly in the nanoworld: once again Drosophila contributes to environment and human health.</a> Nanotoxicology. 9, 135-137 (2015).</li><li>Marino, G., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+apoptotic+phosphatidylserine+exposure.">Mechanisms of apoptotic phosphatidylserine exposure.</a> Cell Research. 23, 1247-1248 (2013).</li><li>Stoddart, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Viability+Assays:+Introduction.">Cell Viability Assays: Introduction.</a> Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols. , (2011).</li><li>Yazdani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concerns+in+the+application+of+fluorescent+probes+DCDHF-DA,+DHR+123+and+DHE+to+measure+reactive+oxygen+species+in+vitro.">Concerns in the application of fluorescent probes DCDHF-DA, DHR 123 and DHE to measure reactive oxygen species in vitro.</a> Toxicology in Vitro. 30, 578-582 (2015).</li><li>Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+kinetics+of+dihydroethidium+fluorescence+with+superoxide+using+xanthine+oxidase+and+hypoxanthine+assay.">Analysis of kinetics of dihydroethidium fluorescence with superoxide using xanthine oxidase and hypoxanthine assay.</a> Annals of Biomedical Engineering. 41, 327-337 (2013).</li><li>Hartig, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+image+analysis+and+manipulation+in+ImageJ.">Basic image analysis and manipulation in ImageJ.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2013).</li></ol>

Для того, чтобы оценить, если NO NP может вызвать апоптоз в фибробластах MRC5, мы используем цитометрию потока, чтобы отличить клетки от некротической или апоптотической смерти клеток. В нормальных живых клетках фосфатидилсерин (PS) локализован в клеточной мембране. При возникновении апопто...

Нанотехнология относится к применению наноразмерных материалов, которые используются во всех научных областях, включая медицину, материаловедение и биохимию. Например, NO NPs, которые известны своими ультрафиолетовыми рассеяниями, химическим зондированием и антимикробными свойствами, а также высокой электрической проводимостью, используются в производстве различных потребительских товаров, таких как пищевая упаковка, косметика, текстиль, каучуки, аккумуляторы, катализатор для обработки автомобильным хвостом газа, и биомедицинскихприложений,связанных с 1,2,3.
Вместе с тем растущее применение продуктов на основе НП «Нена», что приводит к увеличению воздействия на людей НП Зно, вызывает обеспокоенность по поводу их потенциального неблагоприятного воздействия на здоровье человека. Ряд исследований в пробирке показали, что Нп., зно-О НП, могут вызывать окислительный стресс, аутофагию, цитотоксичность, воспаление и генотоксичность4,5,6,7,8 . Примечательно, что токсичность NO NPs, как предполагается, вызвана растворением ионов n, чтобы освободить ионы n2, а также поверхностной реактивностью «nO», что приводит к клеточной ионной и метаболическим дисбалансам, которые связаны с нарушением ионного гомеостаза и ингибирование ионного транспорта4,7,9,10. Важно отметить, что исследования показали, что генерация реактивных видов кислорода (ROS) является одним из основных механизмов, лежащих в основе NO NPs-ассоциированной токсичности. Недостаточная антиоксидативная активность после оскорбления ROS была доказана, чтобы нести ответственность за вырастая цитотоксичность и повреждение ДНК9. Токсическое воздействие NO NPs также были зарегистрированы в животных моделях, в том числе грызунов1, зебрафиш11,12, а также беспозвоночных Drosophila13.
Дрозофила служит в качестве устоявшейся альтернативной модели животных для скрининга токсичности химических веществ и наноматериалов (НМ)14,15. Важно отметить, что существует высокий уровень генетического и физиологического сходства между человеком и дрозофилой, что оправдывает использование дрозофилы в качестве модели in vivo для оценки биологических реакций на экологические загрязнители, такие как НМ 16. Кроме того, Есть много преимуществ использования Drosophila из-за его небольшой размер, короткий срок службы, генетические удобства, и легкои и экономически эффективное обслуживание. Кроме того, Drosophila была широко принята для изучения генетики, молекулярной и биологии развития, с тех пор его полный геном был полностью секвенирован лет назад в 2000 году, что делает его пригодным для различных высокой пропускной скрининг и для решения нерешенных биологических вопросов17,18,19,20,21. В последние годы, ряд исследований, связанных с иммунотоксичностью с использованием различных типов NPs в Drosophila были зарегистрированы15,22,23,24. Это фундаментальное новое знание, полученное в ходе исследований с использованием дрозофилы, помогло дать больше информации о нашем понимании нанотоксикологии.
ROS является известным виновником цитотоксичности и генотоксичности, вызванных НП, в частности, на основе металла NPs25. ROS являются кислородосодержащими химическими видами с более высокими реактивными свойствами, чем молекулярный кислород. Свободные радикалы, такие как супероксид радикальных (O2-) и даже, нерадикальные молекулы, такие как перекись водорода (H2O2) может выступать в качестве ROS. При нормальном физиологическом состоянии, они необходимы для поддержания клеточного гомеостаза26, однако, чрезмерное ROS из-за перепроизводства или дисрегуляции антиоксидантной системы защиты может вызвать окислительный стресс, что приводит к повреждению белков, липиды и дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК)27. Например, по мере повышения уровня ROS и снижения уровня глутатиона (ГСГ) одновременно происходит нарушение синтеза аденозинтрифосфата (АТФ), а уровень лактата дегидрогеназы (ЛПГ) повышается в среде, что приводит к гибели клеток27.
Здесь мы предоставляем протоколы для выполнения клеточного и генетического анализа с использованием культивированных клеток млекопитающих и дрозофилы для определения потенциальных побочных эффектов NO NPs. Обзор метода, используемого для исследования токсичности NPs, показан на рисунке 1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15% Methyl 4-Hydroxybenzoate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cncCK6/TM3, Sb</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>a gift from Dr. Kerppola T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cornmeal, glucose, yeast brewer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyAn ADP with Summit Software</td>
			<td>DAKO</td>
			<td></td>
			<td>https://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydroethidium (Hydroethidine)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D11347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>556547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucolin</td>
			<td>Supermarket</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC5 human lung fibroblast</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#8217;s Drosophila medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21720-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vectashield antifade mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wild- type Canton-S; Sod2N308/CyO</td>
			<td>NIG-FLY</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Oxide Nanoparticles</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>721077</td>
			<td>Refer Sheet 2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

toxicity study of zinc oxide nanoparticles in cell culture and in drosophila melanogaster

Наночастицы оксида цинка (NO NPs) имеют широкий спектр применений, но количество сообщений о токсичности, связанной с NP-ассоциированной деятельностью, в последние годы быстро растет. Тем не менее, исследования, которые разъясняют основные механизмы для NO NP-индуцированной токсичности скудны. Мы определили профили токсичности NP с использованием как in vitro, так и in vivo экспериментальных моделей. Значительное снижение жизнеспособности клеток наблюдалось в фибробластах легких MRC5, показывающих, что НП Зно оказывают цитотоксическое действие. Аналогичным образом, интересно, кишечник подвергается NO NPs выставлены резкое увеличение уровня реактивных видов кислорода (ROS) в плодовой мухи Drosophila. Необходимы более углубленные исследования для проведения оценки рисков для более широкого использования NP-нпо в н.п. потребителями.

NP-экспонированные клетки были обработаны с набором реагентов окрашиваемого клетки, последовано за сортировкой клетки используя цитометрию потока. Нек-обработанные клетки (нижняя, правая панель) демонстрируют более высокий процент ранних (R3)/ поздних апоптотических к...

Watch this Scientific Journal Video about Toxicity Study of Zinc Oxide Nanoparticles in Cell Culture and in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Toxicity Study of Zinc Oxide Nanoparticles in Cell Culture and in Drosophila melanogaster

Мы описываем подробный протокол для оценки токсикологических профилей наночастиц оксида цинка (NO NPs), в частности, тип клеточной смерти в человеческих фибробластах легких MRC5 и образование ROS в плодовой мухе Drosophila.

Исследование токсичности наночастиц оксида цинка в клеточной культуре и в Drosophila melanogaster

Zinc oxide nanoparticles (ZnO NPs) have a wide range of applications, but the number of reports on ZnO NP-associated toxicity has grown rapidly in recent ...

Наши методы наметить простой и повторяющийся способ изучения нанотоксичности, таких как изучение типов гибели клеток и изучение производства реактивных видов кислорода. Флуоресценция активированной сортировки клеток является строгим форматом, который позволяет нам изучать субпопуляцию клеток и растущие различные типы клеточной смерти. Метод исследования зонда DHE позволяет нам обнаруживать и количественно давать количественную оценку реактивным видам кислорода с последующим цитометрией потока, микроскопической высококонтентной визуализацией и парным анализом флуоресценции.Для начала поместите трубку Эппендорфа, содержащую наночастицы оксида цинка, в раствор наночастиц оксида цинка в звуковой в течение 15 минут. Подготовка наночастиц оксида цинка в различных концентрациях с использованием одного миллиграмма на миллилитр наночастицы оксида цинка фонда. Затем, в кабинете биобезопасности, семена MRC5 человека легкого фибробластов на три шесть хорошо культуры пластин при концентрации один раз от 10 до пятой клетки на колодец.Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию. После одного дня, лечить клетки с двумя миллилитров наночастиц оксида цинка в течение восьми часов, 16 часов или 24 часов. В каждый момент времени собирайте клетки в 15-миллилитровую центрифугу и центрифугу по 300 раз г в течение пяти минут.Вымойте клеточные гранулы дважды фосфатно-буферным солевым раствором, а затем повторно поместите клетки с 1X связывающим буфером. Далее добавьте пять микролитров пятна FITC Annexin V в пять микролитров пятна ДНК пропидия йодида. Инкубировать окрашенные клетки в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте.Перед сортировкой клеток по цитометрии потока, пополнить образцы с дополнительными 400 микролитров 1X связывающего буфера. Табулировать диаграмму бара, используя полученную медианную интенсивность. Теперь используйте пипетку, чтобы добавить один миллилитр наночастиц в различных концентрациях во флаконы, а затем девять миллилитров мухи пищи, чтобы сделать окончательную концентрацию 0,1 миллиграмма на миллилитр, 0,25 миллиграмма на миллилитр, или 0,5 миллиграмма на миллилитр наночастиц оксида цинка.Pipette вверх и вниз, чтобы тщательно перемешать. Разрешить летать пищи, содержащей наночастицы оксида цинка для охлаждения, по крайней мере два-три часа до использования. Затем обезболивать взрослых самцов и самок мух во флаконе с углекислым газом, и ввести пять самцов мух и пять самок мух в каждый флакон в течение пяти дней.Дайте им спариваться и откладывать яйца на поверхности пищи. После анестезии удалите родительских мух и позвольте яйцам пройти дальнейшее развитие при комнатной температуре, которая состоит из четырех различных стадий развития. Эмбриональная, личинка, куколка и взрослая стадия.После 72 до 120 часов, свежеотложенные яйца превращаются в поздние третьи личинки instar. Используя типсы, соберите личинки со стенки флаконов для анализа. В колодец рассечения блюдо с вскрытием среды или PBS, поместите личинки в раствор.Под стереомикроскопом используйте кончик типса, чтобы сделать крошечное отверстие, и откройте слой кутикулы личинок. Осторожно вытащите кишечник. Поместите кишечник в 1,5-миллилитровую микроцентрифугную трубку, содержащую drosophila Medium Шнайдера.Добавьте один микролитер зонда DHE и инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение 10 минут. Вымойте кишечник три раза с помощью Среднего Шнайдера каждые пять минут. Намонтайте кишечник на стеклянные горки и поставь 10 микролитров антифадной крепления среды, содержащей DAPI.Захват изображений под конфокальные микроскопы. Для измерения флуоресценции импортируют захваченные изображения флуоресценции, полученные с помощью флуоресцентной микроскопии или конфокального лазерного сканирования микроскопии в программное обеспечение ImageJ. Нажмите на меню анализа и выберите набор измерений.Выберите меру вывода, такую как интенсивность интегрированной области и среднее серое значение. Выберите область без флуоресценции, чтобы установить фон. Нажмите меру.Экспорт данных в электронную таблицу и определение исправленной общей флуоресценции клеток. Создать диаграмму баров и выполнить статистический анализ. В этом исследовании, оксид цинка наночастицы обработанные клетки демонстрируют более высокий процент ранних R3 или поздних апоптотических R6 клеток, чем контрольные клетки R5. Смерть некротических клеток была обозначена R4. Кишечник, извлеченный из личинки дрозофилы, был разделен на три дискретные области различного развития.А именно, foregut, midgut, и hindgut. DHE акции, как правило, истекает довольно быстро, так что будьте осторожны с фондовым решением вы используете. Кроме того, вы можете попробовать другие зонды, например, ячейку Roche, которая предназначена для обнаружения внутриклеточного ROS в зеленых сигналах, и это более фотосвидетель, чем DHE.Наш протокол содержит общий план для изучения внутриклеточного производства ROS и количественной оценки уровня ROS для исследования нанотоксичности. DMSO, как известно, лучше растворителя для DHE, чем PBS. Тем не менее, DMSO является токсичным.Поэтому я хотел бы посоветовать пользователю ограничить весь процесс обучения максимум 30 минутами. Это потому, что вы можете наблюдать ложноположивной результат, как DMSO может привести к гибели клеток.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Toxicity Study of Zinc Oxide Nanoparticles in Cell Culture and in Drosophila melanogaster

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Ретровирусные трансдукция Т-клеточных рецепторов в мышь Т-клеток

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Роман Всего тканей количественного анализа уровень оксида азота в<em&gt; Дрозофилы</em&gt; Нейровоспалительных отклика

Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an ...

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

Системная бактериальная инфекция и иммунная Фенотипы обороны в<em&gt; Дрозофилы</em

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of ...

Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing

Купфер Выделение клеток для наночастиц токсичности тестирования

The large majority of in vitro nanotoxicological studies have used immortalized cell lines for their practicality. However, results from nanoparticle ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Нейтрофильная Выделение и анализ для определения их роли в клеточной лимфомы чувствительность к терапевтических агентов

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Оценка эффективности и токсичности РНК Ориентация ВИЧ-1 Производство для использования в генной или терапии наркотиками

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

Извлечение Hemocytes из личинки Drosophila melanogaster микробной инфекции и анализа

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Характеристика тимус зависимых и тимус независимые иммуноглобулина изотипа ответов в мышей, используя энзим соединенный Assay иммуносорбента

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

Создание вирусной инфекции и анализа взаимодействия хост вирус в Drosophila Melanogaster

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Человеческого Colonoid монослои для изучения взаимодействия между патогенов, Комменсалами и принимающих кишечного эпителия

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...