Name: toxicity study of zinc oxide nanoparticles in cell culture and in drosophila melanogaster
Uploaded: 2019-09-19T13:30:00
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El estudio fue apoyado por el número de subvención R706-000-043-490. El estudio no representa la opinión del patrocinador de la subvención.

1. Análisis de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) en células vivas/fijas
<ol><li>Sonicate ZnO NP en suspensión durante 15 min.</li>
	<li>Preparar los NP de ZnO en varias concentraciones (por ejemplo, 0, 10, 25, 50,100 y 200 g/ml) utilizando 1 mg/ml de solución de stock ZnO NP para el tratamiento de células cultivadas.</li>
	<li>Semilla MRC5 fibroblastos pulmonares humanos (1 x 105 células/pozo) en una placa de cultivo de 6 pocillos con un día de antelación, y luego tratar las c?...

<ol>
	<li>Kim, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+of+100+nm+zinc+oxide+nanoparticles:+a+report+of+90-day+repeated+oral+administration+in+Sprague+Dawley+rats.">Toxicity of 100 nm zinc oxide nanoparticles: a report of 90-day repeated oral administration in Sprague Dawley rats.</a> International Journal of Nanomedicine. 9 Suppl 2, 109-126 (2014).</li><li>Xie, Y., He, Y., Irwin, P. L., Jin, T., Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibacterial+activity+and+mechanism+of+action+of+zinc+oxide+nanoparticles+against+Campylobacter+jejuni.">Antibacterial activity and mechanism of action of zinc oxide nanoparticles against Campylobacter jejuni.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77, 2325-2331 (2011).</li><li>Colvin, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+environmental+impact+of+engineered+nanomaterials.">The potential environmental impact of engineered nanomaterials.</a> Nature Biotechnology. 21, 1166-1170 (2003).</li><li>De Angelis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+ZnO+and+TiO(2)+nanoparticles:+physicochemical+characterisation+and+toxicological+effects+on+human+colon+carcinoma+cells.">Comparative study of ZnO and TiO(2) nanoparticles: physicochemical characterisation and toxicological effects on human colon carcinoma cells.</a> Nanotoxicology. 7, 1361-1372 (2013).</li><li>Johnson, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+exposure+to+ZnO+nanoparticles+induces+autophagic+immune+cell+death.">Acute exposure to ZnO nanoparticles induces autophagic immune cell death.</a> Nanotoxicology. 9, 737-748 (2015).</li><li>Singh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoGenotoxicology:+the+DNA+damaging+potential+of+engineered+nanomaterials.">NanoGenotoxicology: the DNA damaging potential of engineered nanomaterials.</a> Biomaterials. 30, 3891-3914 (2009).</li><li>Song, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+dissolved+zinc+ion+and+reactive+oxygen+species+in+cytotoxicity+of+ZnO+nanoparticles.">Role of the dissolved zinc ion and reactive oxygen species in cytotoxicity of ZnO nanoparticles.</a> Toxicology Letters. 199, 389-397 (2010).</li><li>Wahab, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZnO+nanoparticles+induced+oxidative+stress+and+apoptosis+in+HepG2+and+MCF-7+cancer+cells+and+their+antibacterial+activity.">ZnO nanoparticles induced oxidative stress and apoptosis in HepG2 and MCF-7 cancer cells and their antibacterial activity.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 117, 267-276 (2014).</li><li>Namvar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+effects+of+biosynthesized+zinc+oxide+nanoparticles+on+murine+cell+lines.">Cytotoxic effects of biosynthesized zinc oxide nanoparticles on murine cell lines.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative. 2015, (2015).</li><li>Wong, S. W., Leung, P. T., Djurisic, A. B., Leung, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicities+of+nano+zinc+oxide+to+five+marine+organisms:+influences+of+aggregate+size+and+ion+solubility.">Toxicities of nano zinc oxide to five marine organisms: influences of aggregate size and ion solubility.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 396, 609-618 (2010).</li><li>Hua, J., Vijver, M. G., Richardson, M. K., Ahmad, F., Peijnenburg, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle-specific+toxic+effects+of+differently+shaped+zinc+oxide+nanoparticles+to+zebrafish+embryos+(Danio+rerio).">Particle-specific toxic effects of differently shaped zinc oxide nanoparticles to zebrafish embryos (Danio rerio).</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 33, 2859-2868 (2014).</li><li>Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+ZnO+nanoparticles+exposure+induces+developmental+toxicity,+oxidative+stress+and+DNA+damage+in+embryo-larval+zebrafish.">Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish.</a> Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).</li><li>Alaraby, M., Annangi, B., Hernandez, A., Creus, A., Marcos, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+study+of+the+harmful+effects+of+ZnO+nanoparticles+using+Drosophila+melanogaster+as+an+in+vivo+model.">A comprehensive study of the harmful effects of ZnO nanoparticles using Drosophila melanogaster as an in vivo model.</a> Journal of Hazardous Materials. 296, 166-174 (2015).</li><li>Rand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophotoxicology:+the+growing+potential+for+Drosophila+in+neurotoxicology.">Drosophotoxicology: the growing potential for Drosophila in neurotoxicology.</a> Neurotoxicology and Teratology. 32, 74-83 (2010).</li><li>Ong, C., Yung, L. Y., Cai, Y., Bay, B. H., Baeg, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+as+a+model+organism+to+study+nanotoxicity.">Drosophila melanogaster as a model organism to study nanotoxicity.</a> Nanotoxicology. 9, 396-403 (2015).</li><li>Hoffmann, J. A., Reichhart, J. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+sequence+to+phenotype:+reverse+genetics+in+Drosophila+melanogaster.">From sequence to phenotype: reverse genetics in Drosophila melanogaster.</a> Nature Reviews Genetics. 3, 189-198 (2002).</li><li>Adams, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+sequence+of+Drosophila+melanogaster.">The genome sequence of Drosophila melanogaster.</a> Science. 287, 2185-2195 (2000).</li><li>Ong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+nanoparticles+disrupt+germline+stem+cell+maintenance+in+the+Drosophila+testis.">Silver nanoparticles disrupt germline stem cell maintenance in the Drosophila testis.</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li><li>Alaraby, M., Demir, E., Hernandez, A., Marcos, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+potential+harmful+effects+of+CdSe+quantum+dots+by+using+Drosophila+melanogaster+as+in+vivo+model.">Assessing potential harmful effects of CdSe quantum dots by using Drosophila melanogaster as in vivo model.</a> Science of the Total Environment. 530-531, 66-75 (2015).</li><li>Barik, B. K., Mishra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+as+a+potential+teratogen:+a+lesson+learnt+from+fruit+fly.">Nanoparticles as a potential teratogen: a lesson learnt from fruit fly.</a> Nanotoxicology. , 1-27 (2018).</li><li>Jovanovic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+a+human+food+additive,+titanium+dioxide+nanoparticles+E171,+on+Drosophila+melanogaster+-+a+20+generation+dietary+exposure+experiment.">The effects of a human food additive, titanium dioxide nanoparticles E171, on Drosophila melanogaster - a 20 generation dietary exposure experiment.</a> Scientific Reports. 8, (2018).</li><li>Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Toxicity+of+Nanoparticles+to+Human+Endothelial+Cells.">The Toxicity of Nanoparticles to Human Endothelial Cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1048, 59-69 (2018).</li><li>Akhtar, M. J., Ahamed, M., Alhadlaq, H. A., Alshamsan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+ROS+scavenging+and+antioxidant+signalling+by+redox+metallic+and+fullerene+nanomaterials:+Potential+implications+in+ROS+associated+degenerative+disorders.">Mechanism of ROS scavenging and antioxidant signalling by redox metallic and fullerene nanomaterials: Potential implications in ROS associated degenerative disorders.</a> Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1861, 802-813 (2017).</li><li>Akter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+on+silver+nanoparticles-induced+cytotoxicity:+Physicochemical+properties+and+perspectives.">A systematic review on silver nanoparticles-induced cytotoxicity: Physicochemical properties and perspectives.</a> Journal of Advanced Research. 9, 1-16 (2018).</li><li>Vecchio, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fruit+fly+in+the+nanoworld:+once+again+Drosophila+contributes+to+environment+and+human+health.">A fruit fly in the nanoworld: once again Drosophila contributes to environment and human health.</a> Nanotoxicology. 9, 135-137 (2015).</li><li>Marino, G., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+apoptotic+phosphatidylserine+exposure.">Mechanisms of apoptotic phosphatidylserine exposure.</a> Cell Research. 23, 1247-1248 (2013).</li><li>Stoddart, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Viability+Assays:+Introduction.">Cell Viability Assays: Introduction.</a> Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols. , (2011).</li><li>Yazdani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concerns+in+the+application+of+fluorescent+probes+DCDHF-DA,+DHR+123+and+DHE+to+measure+reactive+oxygen+species+in+vitro.">Concerns in the application of fluorescent probes DCDHF-DA, DHR 123 and DHE to measure reactive oxygen species in vitro.</a> Toxicology in Vitro. 30, 578-582 (2015).</li><li>Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+kinetics+of+dihydroethidium+fluorescence+with+superoxide+using+xanthine+oxidase+and+hypoxanthine+assay.">Analysis of kinetics of dihydroethidium fluorescence with superoxide using xanthine oxidase and hypoxanthine assay.</a> Annals of Biomedical Engineering. 41, 327-337 (2013).</li><li>Hartig, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+image+analysis+and+manipulation+in+ImageJ.">Basic image analysis and manipulation in ImageJ.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2013).</li></ol>

Con el fin de evaluar si ZnO NP puede inducir apoptosis en fibroblastos MRC5, utilizamos citometría de flujo para distinguir las células de la muerte de células necróticas o apoptoticas. En las células vivas normales, la fosfatidilserina (PS) se localiza en la membrana celular. Si se produce apoptosis, PS se traslada al prospecto extracelular de la membrana plasmática, lo que permite la unión de Annexin V etiquetado con fluoresceína (FITC Annexin V)29. Por otro lado, el yoduro de propidium...

La nanotecnología se refiere a la aplicación de materiales de tamaño nanométrico que se utilizan en todos los campos científicos, incluyendo la medicina, la ciencia de los materiales y la bioquímica. Por ejemplo, los NP ZnO que son conocidos por su dispersión ultravioleta, detección química y propiedades antimicrobianas, así como alta conductividad eléctrica, se utilizan en la producción de diversos productos de consumo como envases de alimentos, cosméticos, textiles, cauchos, baterías, catalizadores para el tratamiento de gas de cola de automóviles, y aplicaciones biomédicas1,2,3.
Sin embargo, las crecientes aplicaciones de los productos basados en ZnO NP, que conducen a una mayor exposición humana a los NP de ZnO, han suscitado preocupaciones sobre sus posibles efectos adversos sobre la salud humana. Varios estudios celulares in vitro han demostrado que los NP de ZnO pueden inducir estrés oxidativo, citotoxicidad relacionada con la autofagia, inflamación y genotoxicidad4,5,6,7,8 . En particular, se supone que la toxicidad de znO NP es causada por la disolución de Zn para liberar iones Zn2+, así como la reactividad superficial de ZnO, lo que resulta en los desequilibrios iónicos y metabólicos celulares que están relacionados con la homeostasis iónica deteriorada y una inhibición del transporte iónico4,7,9,10. Es importante destacar que los estudios han demostrado que la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) es uno de los principales mecanismos subyacentes a la toxicidad asociada a los NP de ZnO. Se ha demostrado que la insuficiente actividad antioxidante después del insulto ROS es responsable de provocar la citotoxicidad y el daño al ADN9. Los efectos tóxicos de znO NP también se han divulgado en modelos animales, incluyendo roedores1, pez cebra11,12, así como el invertebrado Drosophila13.
Drosophila sirve como un modelo animal alternativo bien establecido para el cribado de toxicidad de entidades químicas y nanomateriales (NMs)14,15. Es importante destacar que existen altos niveles de similitud genética y fisiológica entre el ser humano y Drosophila que justifican el uso de Drosophila como modelo in vivo para evaluar las respuestas biológicas a contaminantes ambientales como los NM 16. Además, hay muchas ventajas de usar Drosophila debido a su pequeño tamaño, corta vida útil, amenabilidad genética y mantenimiento fácil y rentable. Además, Drosophila ha sido ampliamente adoptada para el estudio de la genética, la biología molecular y del desarrollo, desde que su genoma completo fue completamente secuenciado hace años en 2000, por lo que es adecuado para una variedad de cribado de alto rendimiento y para abordar las cuestiones biológicas no resueltas17,18,19,20,21. En los últimos años, se han notificado varios estudios relacionados con la inmunotoxicidad utilizando diferentes tipos de NP en Drosophila 15,22,23,24. Este nuevo conocimiento fundamental obtenido de los estudios con Drosophila ha ayudado a proporcionar más información sobre nuestra comprensión de la nanotoxicología.
ROS es un conocido culpable de citotoxicidad y genotoxicidad causada por los NP, en particular, los NP a base de metal25. ROS son especies químicas que contienen oxígeno con propiedades reactivas más altas que el oxígeno molecular. Los radicales libres como el radical superóxido (O2-) e incluso, moléculas no radicales como el peróxido de hidrógeno (H2O2) pueden actuar como ROS. Bajo condición fisiológica normal, se requieren para mantener la homeostasis celular26,sin embargo, ROS excesiva debido a la sobreproducción o desregulación del sistema de defensa antioxidante puede causar estrés oxidativo, lo que conduce a daños a las proteínas, lípidos y ácido desoxirribonucleico (ADN)27. Por ejemplo, a medida que los niveles de ROS aumentan y el nivel de glutatión (GSH) disminuye de forma concomitante, se produce la interrupción de la síntesis de trifosfato de adenosina (ATP) y el nivel de lactato deshidrogenasa (LDH) aumenta en el medio, culminando en la muerte celular27.
Aquí, proporcionamos protocolos para realizar análisis celulares y genéticos utilizando células de mamíferos cultivadas y Drosophila para determinar los posibles efectos adversos de los NP de ZnO. En la Figura 1se muestra una descripción general del método utilizado para el estudio de toxicidad de los NP de ZnO.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15% Methyl 4-Hydroxybenzoate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cncCK6/TM3, Sb</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>a gift from Dr. Kerppola T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cornmeal, glucose, yeast brewer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyAn ADP with Summit Software</td>
			<td>DAKO</td>
			<td></td>
			<td>https://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydroethidium (Hydroethidine)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D11347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>556547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucolin</td>
			<td>Supermarket</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC5 human lung fibroblast</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#8217;s Drosophila medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21720-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vectashield antifade mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wild- type Canton-S; Sod2N308/CyO</td>
			<td>NIG-FLY</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Oxide Nanoparticles</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>721077</td>
			<td>Refer Sheet 2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

toxicity study of zinc oxide nanoparticles in cell culture and in drosophila melanogaster

Las nanopartículas de óxido de zinc (ZnO NP) tienen una amplia gama de aplicaciones, pero el número de informes sobre la toxicidad asociada a ZnO NP ha crecido rápidamente en los últimos años. Sin embargo, los estudios que aclaran los mecanismos subyacentes para la toxicidad inducida por ZnO NP son escasos. Determinamos los perfiles de toxicidad de los NP de ZnO utilizando modelos experimentales in vitro e in vivo. Se observó una disminución significativa en la viabilidad celular en los fibroblastos pulmonares MRC5 expuestos a ZnO NP, lo que muestra que los NP de ZnO ejercen efectos citotóxicos. Del mismo modo, curiosamente, el intestino expuesto a los NP de ZnO exhibió un aumento dramático en los niveles reactivos de las especies de oxígeno (ROS) en la mosca de la fruta Drosophila. Se requieren estudios más detallados para establecer una evaluación del riesgo para el aumento del uso de LOS NP de ZnO por parte de los consumidores.

Las células expuestas a NP se procesaron con el kit de reactivos de tinción de células, seguido de la clasificación de celdas mediante citometría de flujo. Las células tratadas con ZnO NP (panel inferior y derecho) exhiben un porcentaje más alto de células apoptoticas tempranas (R3)/tardías (R6) que las celdas de control (R5, inferior, panel izquierdo). La muerte de la célula necrótica se denota por R4 (panel superior, derecho)(Figura 2). Los resul...

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Toxicity Study of Zinc Oxide Nanoparticles in Cell Culture and in Drosophila melanogaster

Describimos un protocolo detallado para evaluar los perfiles toxicológicos de nanopartículas de óxido de zinc (ZnO NP) en particular, el tipo de muerte celular en fibroblastos pulmonares MRC5 humanos y la formación de ROS en la mosca de la fruta Drosophila.

Estudio de toxicidad de nanopartículas de óxido de zinc en el cultivo celular y en Drosophila melanogaster

Zinc oxide nanoparticles (ZnO NPs) have a wide range of applications, but the number of reports on ZnO NP-associated toxicity has grown rapidly in recent ...

Nuestros métodos describen una forma simple y repetida para estudiar la nanotoxicidad, como examinar los tipos de muerte celular y examinar la producción de especies reactivas de oxígeno. La clasificación celular activada por fluorescencia es un formato estricto que nos permite estudiar la subpoblación de células y los crecientes tipos de muerte celular. El método de estudio de la sonda DHE nos permite detectar y cuantificar especies reactivas de oxígeno seguidas de citometría de flujo, imágenes microscópicas de alto contenido y análisis de fluorescencia a base de acoplación.Para comenzar, coloque un tubo Eppendorf que contenga nanopartículas de óxido de zinc en la solución de material de nanopartículas de óxido de zinc en un sonicador durante 15 minutos. Preparar nanopartículas de óxido de zinc a diversas concentraciones utilizando un stock de nanopartículas de óxido de zinc de un miligramo por mililitro. Luego, en un gabinete de bioseguridad, la semilla de fibroblastos pulmonares humanos MRC5 sembra tres placas de cultivo de seis pozos a la concentración de una por 10 a las quintas células por pozo.Incubar las células a 37 grados centígrados. Después de un día, tratar las células con dos mililitros de nanopartículas de óxido de zinc durante ocho horas, 16 horas o 24 horas. En cada punto de tiempo, recoja las células en un tubo centrífuga de 15 mililitros y centrifugar a 300 veces g durante cinco minutos.Lave los gránulos celulares dos veces con solución salina tamponada con fosfato, y luego resuspender las células con tampón de unión 1X. A continuación, añada cinco microlitros de la mancha FITC Annexin V en cinco microlitros de tinción de ADN de yoduro propidium. Incubar las células manchadas durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.Antes de ordenar las celdas por citometría de flujo, recubra las muestras con 400 microlitros adicionales de búfer de unión 1X. Tabule el gráfico de barras utilizando la intensidad mediana obtenida. Ahora utilice una pipeta para añadir un mililitro de nanopartículas a diferentes concentraciones en viales, seguido de nueve mililitros de alimentos para mosca para hacer una concentración final de 0,1 miligramos por mililitro, 0,25 miligramos por mililitro, o 0,5 miligramos por mililitro de nanopartículas de óxido de zinc.Pipetear hacia arriba y hacia abajo para mezclar bien. Deje que los alimentos mosca que contengan nanopartículas de óxido de zinc se enfríen durante al menos dos o tres horas antes de su uso. Luego anestesia las moscas adultas macho y femenina en un vial con dióxido de carbono, e introduce cinco moscas macho y cinco hembras en cada vial durante cinco días.Deje que se aparean y pongan huevos en la superficie de los alimentos. Después de la anestesia, retire las moscas parentales y permita que los huevos se sometan a un desarrollo adicional a temperatura ambiente, que consta de cuatro etapas de desarrollo diferentes. Etapa embrionaria, larvaria, pupal y adulta.Después de 72 a 120 horas, los huevos recién puestos se convierten en larvas de tercera estrella tardías. Usando fórceps, recoger las larvas de la pared de los viales para análisis. En un pozo de un plato de disección con medio de disección o PBS, coloque las larvas en la solución.Debajo del estereomicroscopio, usa la punta de los fórceps para hacer un pequeño agujero, y abre la capa de cutícula de las larvas. Saca con cuidado el intestino. Coloque el intestino en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contenga Drosophila Medium de Schneider.Agregue un microlitro de la sonda DHE e incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 10 minutos. Lávese el intestino tres veces usando Schneider's Medium cada cinco minutos. Monte el intestino en portaobjetos de vidrio y suministre 10 microlitros de medio de montaje antifada que contenga DAPI.Captura imágenes bajo un microscopio confocal. Para medir la fluorescencia, importe las imágenes de fluorescencia capturadas adquiridas mediante microscopía de fluorescencia o microscopía de escaneo láser confocal en el software ImageJ. Haga clic en el menú Analizar y seleccione Establecer medidas.Seleccione la medida de salida, como la intensidad integrada del área y el valor gris medio. Seleccione una región sin fluorescencia para establecer el fondo. Haga clic en medir.Exporte los datos a la hoja de cálculo y determine la fluorescencia total de celdas corregida. Construya un gráfico de barras y realice análisis estadísticos. En este estudio, las células tratadas con nanopartículas de óxido de zinc exhiben un mayor porcentaje de células R3 tempranas o Apoptóticas tardías R6 que las células de control R5. La muerte de células necróticas fue denotada por R4. El intestino extraído de la larva de drosophila se dividió en tres dominios discretos de diferente origen del desarrollo.A saber, el foregut, midgut, y hindgut. Las acciones de DHE tienden a expirar bastante rápido, así que tenga cuidado con la solución de stock que está utilizando. Alternativamente, usted podría probar otras sondas, por ejemplo la célula Roche, que está diseñada para detectar el ROS intracelular en las señales verdes, y que es más fotostable que el DHE.Nuestro protocolo proporciona un esquema general para el estudio de la producción de ROS intracelular, y la cuantificación del nivel de ROS para el estudio de nanotoxicidad. DMSO es conocido por ser un mejor disolvente para DHE que el PBS. Sin embargo, DMSO es tóxico.Por lo tanto, me gustaría aconsejar al usuario que restrinja todo el proceso para estudiar a un máximo de 30 minutos. Esto se debe a que usted puede observar un resultado falso positivo ya que DMSO puede causar la muerte celular.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Toxicity Study of Zinc Oxide Nanoparticles in Cell Culture and in Drosophila melanogaster

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Transducción retroviral de receptores de células T en ratones las células T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Investigación

Inmunología e Infección

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

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Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an ...

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

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La infección bacteriana sistémica y Defensa Inmune fenotipos en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of ...

Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing

Kupffer aislamiento de células de nanopartículas de Pruebas de Toxicidad

The large majority of in vitro nanotoxicological studies have used immortalized cell lines for their practicality. However, results from nanoparticle ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Aislamiento de neutrófilos y análisis para determinar su papel en el linfoma de células sensibles a los agentes terapéuticos

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Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

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Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

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Caracterización de las respuestas de isotipo de inmunoglobulina dependiente del timo y timo-independiente en ratones usando el análisis enzima-ligado del inmunosorbente

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

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