Name: toxicity study of zinc oxide nanoparticles in cell culture and in drosophila melanogaster
Uploaded: 2019-09-19T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Toxicity Study of Zinc Oxide Nanoparticles in Cell Culture and in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Studien stöddes av bidrags numret R706-000-043-490. Studien representerar inte bidrags sponsorns uppfattning.

1. Fluorescence aktiverad cell sortering (FACS) analys av levde/fasta celler
<ol><li>Sonicate ZnO NPs i fjädring för 15 min.</li>
	<li>Förbered ZnO NPs vid olika koncentrationer (t. ex. 0, 10, 25, 50 100 och 200 μg/mL) med 1 mg/mL ZnO NP stamlösning för behandling av odlade celler.</li>
	<li>Utsäde MRC5 Human lung fibroblaster (1 x 105 celler/brunn) på en 6-brunn kultur tallrik en dag i förväg, och sedan behandla cellerna med 2 ml ZNO NPS (i tre exemplar) för 8 h, 16 h, och 24 h.</li>
	<li>Vid var...

<ol>
	<li>Kim, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+of+100+nm+zinc+oxide+nanoparticles:+a+report+of+90-day+repeated+oral+administration+in+Sprague+Dawley+rats.">Toxicity of 100 nm zinc oxide nanoparticles: a report of 90-day repeated oral administration in Sprague Dawley rats.</a> International Journal of Nanomedicine. 9 Suppl 2, 109-126 (2014).</li><li>Xie, Y., He, Y., Irwin, P. L., Jin, T., Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibacterial+activity+and+mechanism+of+action+of+zinc+oxide+nanoparticles+against+Campylobacter+jejuni.">Antibacterial activity and mechanism of action of zinc oxide nanoparticles against Campylobacter jejuni.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77, 2325-2331 (2011).</li><li>Colvin, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+environmental+impact+of+engineered+nanomaterials.">The potential environmental impact of engineered nanomaterials.</a> Nature Biotechnology. 21, 1166-1170 (2003).</li><li>De Angelis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+ZnO+and+TiO(2)+nanoparticles:+physicochemical+characterisation+and+toxicological+effects+on+human+colon+carcinoma+cells.">Comparative study of ZnO and TiO(2) nanoparticles: physicochemical characterisation and toxicological effects on human colon carcinoma cells.</a> Nanotoxicology. 7, 1361-1372 (2013).</li><li>Johnson, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+exposure+to+ZnO+nanoparticles+induces+autophagic+immune+cell+death.">Acute exposure to ZnO nanoparticles induces autophagic immune cell death.</a> Nanotoxicology. 9, 737-748 (2015).</li><li>Singh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoGenotoxicology:+the+DNA+damaging+potential+of+engineered+nanomaterials.">NanoGenotoxicology: the DNA damaging potential of engineered nanomaterials.</a> Biomaterials. 30, 3891-3914 (2009).</li><li>Song, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+dissolved+zinc+ion+and+reactive+oxygen+species+in+cytotoxicity+of+ZnO+nanoparticles.">Role of the dissolved zinc ion and reactive oxygen species in cytotoxicity of ZnO nanoparticles.</a> Toxicology Letters. 199, 389-397 (2010).</li><li>Wahab, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZnO+nanoparticles+induced+oxidative+stress+and+apoptosis+in+HepG2+and+MCF-7+cancer+cells+and+their+antibacterial+activity.">ZnO nanoparticles induced oxidative stress and apoptosis in HepG2 and MCF-7 cancer cells and their antibacterial activity.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 117, 267-276 (2014).</li><li>Namvar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+effects+of+biosynthesized+zinc+oxide+nanoparticles+on+murine+cell+lines.">Cytotoxic effects of biosynthesized zinc oxide nanoparticles on murine cell lines.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative. 2015, (2015).</li><li>Wong, S. W., Leung, P. T., Djurisic, A. B., Leung, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicities+of+nano+zinc+oxide+to+five+marine+organisms:+influences+of+aggregate+size+and+ion+solubility.">Toxicities of nano zinc oxide to five marine organisms: influences of aggregate size and ion solubility.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 396, 609-618 (2010).</li><li>Hua, J., Vijver, M. G., Richardson, M. K., Ahmad, F., Peijnenburg, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle-specific+toxic+effects+of+differently+shaped+zinc+oxide+nanoparticles+to+zebrafish+embryos+(Danio+rerio).">Particle-specific toxic effects of differently shaped zinc oxide nanoparticles to zebrafish embryos (Danio rerio).</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 33, 2859-2868 (2014).</li><li>Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+ZnO+nanoparticles+exposure+induces+developmental+toxicity,+oxidative+stress+and+DNA+damage+in+embryo-larval+zebrafish.">Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish.</a> Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).</li><li>Alaraby, M., Annangi, B., Hernandez, A., Creus, A., Marcos, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+study+of+the+harmful+effects+of+ZnO+nanoparticles+using+Drosophila+melanogaster+as+an+in+vivo+model.">A comprehensive study of the harmful effects of ZnO nanoparticles using Drosophila melanogaster as an in vivo model.</a> Journal of Hazardous Materials. 296, 166-174 (2015).</li><li>Rand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophotoxicology:+the+growing+potential+for+Drosophila+in+neurotoxicology.">Drosophotoxicology: the growing potential for Drosophila in neurotoxicology.</a> Neurotoxicology and Teratology. 32, 74-83 (2010).</li><li>Ong, C., Yung, L. Y., Cai, Y., Bay, B. H., Baeg, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+as+a+model+organism+to+study+nanotoxicity.">Drosophila melanogaster as a model organism to study nanotoxicity.</a> Nanotoxicology. 9, 396-403 (2015).</li><li>Hoffmann, J. A., Reichhart, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+innate+immunity:+an+evolutionary+perspective.">Drosophila innate immunity: an evolutionary perspective.</a> Nature Immunology. 3, 121-126 (2002).</li><li>Hughes, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+as+a+genetic+model+for+studying+pathogenic+human+viruses.">Drosophila as a genetic model for studying pathogenic human viruses.</a> Virology. 423, 1-5 (2012).</li><li>Jennings, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+-+a+versatile+model+in+biology+&amp;+medicine.">Drosophila - a versatile model in biology &amp; medicine.</a> Materials Today. 14, 190-195 (2011).</li><li>Adams, M. D., Sekelsky, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+sequence+to+phenotype:+reverse+genetics+in+Drosophila+melanogaster.">From sequence to phenotype: reverse genetics in Drosophila melanogaster.</a> Nature Reviews Genetics. 3, 189-198 (2002).</li><li>Adams, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+sequence+of+Drosophila+melanogaster.">The genome sequence of Drosophila melanogaster.</a> Science. 287, 2185-2195 (2000).</li><li>Ong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+nanoparticles+disrupt+germline+stem+cell+maintenance+in+the+Drosophila+testis.">Silver nanoparticles disrupt germline stem cell maintenance in the Drosophila testis.</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li><li>Alaraby, M., Demir, E., Hernandez, A., Marcos, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+potential+harmful+effects+of+CdSe+quantum+dots+by+using+Drosophila+melanogaster+as+in+vivo+model.">Assessing potential harmful effects of CdSe quantum dots by using Drosophila melanogaster as in vivo model.</a> Science of the Total Environment. 530-531, 66-75 (2015).</li><li>Barik, B. K., Mishra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+as+a+potential+teratogen:+a+lesson+learnt+from+fruit+fly.">Nanoparticles as a potential teratogen: a lesson learnt from fruit fly.</a> Nanotoxicology. , 1-27 (2018).</li><li>Jovanovic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+a+human+food+additive,+titanium+dioxide+nanoparticles+E171,+on+Drosophila+melanogaster+-+a+20+generation+dietary+exposure+experiment.">The effects of a human food additive, titanium dioxide nanoparticles E171, on Drosophila melanogaster - a 20 generation dietary exposure experiment.</a> Scientific Reports. 8, (2018).</li><li>Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Toxicity+of+Nanoparticles+to+Human+Endothelial+Cells.">The Toxicity of Nanoparticles to Human Endothelial Cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1048, 59-69 (2018).</li><li>Akhtar, M. J., Ahamed, M., Alhadlaq, H. A., Alshamsan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+ROS+scavenging+and+antioxidant+signalling+by+redox+metallic+and+fullerene+nanomaterials:+Potential+implications+in+ROS+associated+degenerative+disorders.">Mechanism of ROS scavenging and antioxidant signalling by redox metallic and fullerene nanomaterials: Potential implications in ROS associated degenerative disorders.</a> Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1861, 802-813 (2017).</li><li>Akter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+on+silver+nanoparticles-induced+cytotoxicity:+Physicochemical+properties+and+perspectives.">A systematic review on silver nanoparticles-induced cytotoxicity: Physicochemical properties and perspectives.</a> Journal of Advanced Research. 9, 1-16 (2018).</li><li>Vecchio, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fruit+fly+in+the+nanoworld:+once+again+Drosophila+contributes+to+environment+and+human+health.">A fruit fly in the nanoworld: once again Drosophila contributes to environment and human health.</a> Nanotoxicology. 9, 135-137 (2015).</li><li>Marino, G., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+apoptotic+phosphatidylserine+exposure.">Mechanisms of apoptotic phosphatidylserine exposure.</a> Cell Research. 23, 1247-1248 (2013).</li><li>Stoddart, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Viability+Assays:+Introduction.">Cell Viability Assays: Introduction.</a> Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols. , (2011).</li><li>Yazdani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concerns+in+the+application+of+fluorescent+probes+DCDHF-DA,+DHR+123+and+DHE+to+measure+reactive+oxygen+species+in+vitro.">Concerns in the application of fluorescent probes DCDHF-DA, DHR 123 and DHE to measure reactive oxygen species in vitro.</a> Toxicology in Vitro. 30, 578-582 (2015).</li><li>Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+kinetics+of+dihydroethidium+fluorescence+with+superoxide+using+xanthine+oxidase+and+hypoxanthine+assay.">Analysis of kinetics of dihydroethidium fluorescence with superoxide using xanthine oxidase and hypoxanthine assay.</a> Annals of Biomedical Engineering. 41, 327-337 (2013).</li><li>Hartig, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+image+analysis+and+manipulation+in+ImageJ.">Basic image analysis and manipulation in ImageJ.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2013).</li></ol>

För att bedöma om ZnO NP kan inducera apoptos i MRC5 fibroblaster, använder vi flödescytometri för att särskilja cellerna från nekrotisk eller apoptotisk celldöd. I normala levande celler, Fosfatidylserin (PS) är lokaliserad på cellmembranet. Om apoptos inträffar, är PS transplacerad till den extracellulära broschyren av plasmamembranet, vilket gör att bindningen av Annexin V märkt med fluorescein (FITC Annexin V)29. Å andra sidan, den rödfluorescerande propidiumjodid jodid (PI), ...

Nanoteknik hänvisar till tillämpningen av nanosized material som används inom alla vetenskapliga områden, inklusive medicin, materialvetenskap, och biokemi. Till exempel, ZnO NPs som är kända för sin ultraviolett spridning, kemisk avkänning, och antimikrobiella egenskaper, samt hög elektrisk ledningsförmåga, utnyttjas i produktionen av olika konsumentprodukter såsom livsmedelsförpackningar, kosmetika, textilier, gummi, batterier, katalysator för bil svans gasbehandling, och biomedicinsk-relaterade tillämpningar1,2,3.
Emellertid, den spirande tillämpningar av ZnO NP-baserade produkter, vilket leder till ökad mänsklig exponering för ZnO NPs, har väckt farhågor om deras potentiella negativa effekter på människors hälsa. Ett antal in vitro cellulära studier har visat att ZNO NPS kan framkalla oxidativ stress, autofagi-relaterad cytotoxicitet, inflammation, och genotoxicitet4,5,6,7,8 . Särskilt, toxiciteten av ZnO NPs antas vara orsakad av upplösningen av Zn till fri Zn2 + joner, liksom ytan reaktivitet av ZnO, vilket resulterar i cellulära joniska och metaboliska obalanser som är förknippade med nedsatt jonisk homeostas och en hämning av jontransporten4,7,9,10. Viktigt, studier har visat att generationen av reaktiva syreradikaler (ROS) är en av de primära mekanismerna bakom ZnO NPs-associerad toxicitet. Otillräcklig anti-oxidativ aktivitet efter ROS förolämpning har visat sig vara ansvarig för framkalla cytotoxicitet och DNA-skador9. De toxiska effekterna av ZNO NPS har också rapporterats i djurmodeller, inklusive gnagare1, zebrafiskar11,12, samt ryggradslösa djur Drosophila13.
Drosophila fungerar som en väletablerad alternativ djurmodell för toxicitet screening av kemiska enheter och nanomaterial (NMS)14,15. Viktigt är att det finns höga nivåer av genetisk och fysiologisk likhet mellan människa och Drosophila som motiverar användningen av Drosophila som en in vivo-modell för utvärdering av biologiska svar på miljöföroreningar som NMS 16. Dessutom finns det många fördelar med att använda Drosophila på grund av dess ringa storlek, korta livslängd, genetiska amenability, och enkelt och kostnadseffektivt underhåll. Dessutom har Drosophila blivit allmänt antagen för studiet av genetik, molekylär-och utvecklingsbiologi, ända sedan hela genomet var fullständigt sekvenserat år sedan tillbaka i 2000, vilket gör det lämpligt för en mängd olika högpresterande screening och för att ta itu med olösta biologiska frågor17,18,19,20,21. Under de senaste åren har ett antal studier relaterade till immuntoxicitet med olika typer av NPS i Drosophila rapporterats15,22,23,24. Denna grundläggande nya kunskap som erhållits genom studierna med hjälp av Drosophila har bidragit till att ge mer insikt i vår förståelse av nanotoxikologin.
ROS är en välkänd boven i dramat för cytotoxicitet och genotoxicitet orsakad av NPs, i synnerhet metallbaserade NPs25. ROS är syrehaltiga kemiska arter med högre reaktiva egenskaper än molekyl syre. Fria radikaler såsom superoxid radikal (O2-) och även, icke-radikala molekyler såsom väteperoxid (H2O2) kan fungera som ros. Under normala fysiologiska tillstånd, de är skyldiga att upprätthålla cellulära homeostas26, dock, överdriven ros på grund av överproduktion eller dysreglering av antioxidant försvar kan orsaka oxidativ stress, vilket leder till skador på proteiner, lipider och deoxyribonukleinsyra (DNA)27. Till exempel, som ROS nivåer öka och glutation (GSH) nivå minskar samtidigt, störningar av adenosintrifosfat (ATP) syntes sker och laktatdehydrogenas (LDH) nivå ökar i mediet, som kulminerar i celldöd27.
Här tillhandahåller vi protokoll för att utföra cellulära och genetiska analyser med hjälp av odlade däggdjursceller och Drosophila för att fastställa de potentiella negativa effekterna av ZNO NPS. En översikt över den metod som används för toxicitetsstudien av ZnO NPs visas i figur 1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15% Methyl 4-Hydroxybenzoate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cncCK6/TM3, Sb</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>a gift from Dr. Kerppola T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cornmeal, glucose, yeast brewer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyAn ADP with Summit Software</td>
			<td>DAKO</td>
			<td></td>
			<td>https://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dihydroethidium (Hydroethidine)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D11347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>556547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucolin</td>
			<td>Supermarket</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC5 human lung fibroblast</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#8217;s Drosophila medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21720-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vectashield antifade mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wild- type Canton-S; Sod2N308/CyO</td>
			<td>NIG-FLY</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Oxide Nanoparticles</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>721077</td>
			<td>Refer Sheet 2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

toxicity study of zinc oxide nanoparticles in cell culture and in drosophila melanogaster

Zinkoxid nanopartiklar (ZnO NPs) har ett brett spektrum av tillämpningar, men antalet rapporter om ZnO NP-associerad toxicitet har vuxit snabbt under de senaste åren. Emellertid, studier som belyser de bakomliggande mekanismerna för ZnO NP-inducerad toxicitet är knappare. Vi bestämde toxicitetsprofilerna för ZnO NPs med hjälp av både in vitro-och in vivo-experimentella modeller. En signifikant minskning av cellernas lönsamhet observerades i ZnO NP-exponerade MRC5 lung fibroblaster, visar att ZnO NPs utöva cytotoxiska effekter. Likaså, intressant, Gut utsätts för ZnO NPs uppvisade en dramatisk ökning av reaktiva syreradikaler (ROS) i bananfluga Drosophila. Mer djupgående studier krävs för att fastställa en riskbedömning för ökad användning av ZnO NPs av konsumenter.

NP-exponerade celler behandlades med cell färgning reagens kit, följt av cell sortering med flödescytometri. ZnO NP-behandlade celler (botten, höger panel) uppvisar en högre andel av tidiga (R3)/sena apoptotiska celler (R6) än kontrollceller (R5, botten, vänster panel). Nekrotisk celldöd betecknas med R4 (övre, högra panelen) (figur 2). Resultaten av FITC/Annexin V-analysen på ZnO NP-behandlade fibroblaster i MRC-5 visas i figu...

Watch this Scientific Journal Video about Toxicity Study of Zinc Oxide Nanoparticles in Cell Culture and in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Toxicity Study of Zinc Oxide Nanoparticles in Cell Culture and in Drosophila melanogaster

Vi beskriver ett detaljerat protokoll för att utvärdera de toxikologiska profilerna av zinkoxidnanopartiklar (ZnO NPs) i synnerhet, vilken typ av celldöd i human MRC5 lung fibroblaster och ROS formation i bananfluga Drosophila.

Toxicitetsstudie av Zinkoxidnanopartiklar i cell kulturen och i Drosophila melanogaster

Zinc oxide nanoparticles (ZnO NPs) have a wide range of applications, but the number of reports on ZnO NP-associated toxicity has grown rapidly in recent ...

Våra metoder beskriver ett enkelt och upprepat sätt för att studera nanotoxicitet, som att undersöka typerna av celldöd och undersöka produktionen av reaktiva syrearter. Fluorescens aktiverad cellsortering är ett strikt format som gör att vi kan studera subpopulationen av celler och de växande olika typerna av celldöd. DHE-sondstudiemetoden gör det möjligt för oss att upptäcka och kvantifiera reaktiva syrearter följt av flödescytometri, mikroskopisk bildframställning med hög innehållshalt och av en couplet-baserad fluorescensanalys.Till att börja placera ett Eppendorf-rör som innehåller nanopartiklar av zinkoxid i nanopartikellösning av zinkoxid till en soniker i 15 minuter. Förbered nanopartiklar av zinkoxid vid olika koncentrationer med hjälp av ett milligram per milliliter nanopartikellager av zinkoxid. Sedan, i en biosäkerhet skåp, utsäde MRC5 mänskliga lungfibroster på tre sex-brunn kultur plattor i koncentration av en gånger 10 till de femte cellerna per brunn.Inkubera cellerna i 37 grader Celsius. Efter en dag, behandla cellerna med två milliliter av nanopartiklar av zinkoxid i åtta timmar, 16 timmar eller 24 timmar. Vid varje tidpunkt, samla cellerna i en 15-milliliter centrifugrör, och centrifug vid 300 gånger g i fem minuter.Tvätta cellpelletsen två gånger med fosfatbuffrad saltlösning, och sedan återanvänd cellerna med 1X-bindningsbuffert. Därefter lägger fem mikroliter av FITC Annexin V fläck i fem mikroliter av propidium iodide DNA-fläck. Inkubera de färgade cellerna i 15 minuter vid rumstemperatur i mörker.Innan cellerna sorteras efter flödescytometri, fylla på proverna med ytterligare 400 mikroliter av 1X bindningsbuffert. Tabbforma stapeldiagrammet med hjälp av den medianintensitet som erhålls. Använd nu en pipett för att lägga till en milliliter nanopartiklar i olika koncentrationer i injektionsflaska, följt av nio milliliter flugmat för att göra en slutlig koncentration på 0,1 milligram per milliliter, 0,25 milligram per milliliter, eller 0,5 milligram per milliliter zinkoxid nanopartiklar.Pipett upp och ner för att blanda ordentligt. Låt flugfoder som innehåller nanopartiklar av zinkoxid svalna i minst två till tre timmar före användning. Sedan bedöva vuxna manliga och kvinnliga flugor i en injektionsflaska med koldioxid, och införa fem hanflugor och fem kvinnliga flugor i varje injektionsflaska i fem dagar.Låt dem para sig och lägga ägg på ytan av maten. Efter anestetisering, ta bort föräldrarnas flugor och låta äggen genomgå ytterligare utveckling vid rumstemperatur, som består av fyra olika utvecklingsstadier. Embryonala, larv, pupal, och vuxna stadium.Efter 72 till 120 timmar utvecklas nylagda ägg till sena tredje instar larver. Med hjälp av tsningar samlar du larverna från väggen i injektionsflaskaerna för analyser. I en brunn av en dissektionsrätt med dissektionsmedium eller PBS, placera larverna i lösningen.Under stereomikroskopet använder du spetsen på tip-trätsen för att göra ett litet hål och bryta upp ljusbandsskiktet hos larverna. Dra försiktigt ut tarmen. Placera tarmen i en 1,5-milliliter mikrocentrifug rör som innehåller Schneiders Drosophila Medium.Tillsätt en mikroliter av DHE-sonden, och inkubera i mörker i rumstemperatur i 10 minuter. Tvätta tarmen tre gånger med Schneiders Medium var femte minut. Montera tarmen på glas diabilder, och förse med 10 mikroliter av antifade monteringsmedium som innehåller DAPI.Ta bilder under ett konfokalmikroskop. För att mäta fluorescens, importera de tagna fluorescensbilderna som förvärvats med hjälp av fluorescensmikroskopi eller konfokal laserscanningsmikroskopi till ImageJ-programvaran. Klicka på analysera menyn, och välj ange mätningar.Välj utdatamåttet, till exempel områdesintegrerad intensitet och medelvärdet av grått värde. Välj en region utan fluorescens för att ställa in bakgrunden. Klicka på mått.Exportera data i kalkylbladet, och bestäm den korrigerade totala cellfluorescensen. Konstruera ett stapeldiagram, och utför statistisk analys. I denna studie uppvisar nanopartikelbehandlade celler av zinkoxid en högre andel tidiga R3- eller senapoptotiska R6-celler än kontrollceller R5. Necrotic cell död betecknades med R4. Gut extraheras från drosophila larven delades in i tre diskreta domäner av olika utvecklingsmässiga ursprung.Nämligen foregut, midgut och hindgut. DHE lager tenderar att löpa ut ganska snabbt, så var försiktig med stamlösningen du använder. Alternativt kan du prova andra sonder, till exempel cell Roche, som är utformad för att upptäcka intracellulära ROS i gröna signaler, och det är mer photostable än DHE.Vårt protokoll ger en allmän disposition för att studera den intracellulära ROS produktion, och kvantifiering av ROS-nivå för nanotoxicitet studie. DMSO är känt för att vara ett bättre lösningsmedel för DHE än PBS. Dock är DMSO giftigt.Därför vill jag råda användaren att begränsa hela processen för att studera till 30 minuter maximalt. Detta beror på att du kan observera ett falskt positivt resultat som DMSO kan orsaka celldöd.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Toxicity Study of Zinc Oxide Nanoparticles in Cell Culture and in Drosophila melanogaster

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Retroviral Transduction av T-cell receptorer i Mus T-celler

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an ...

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

Systemisk bakterieinfektion och immunförsvar fenotyper i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of ...

Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing

Kupffer Cell Isolation för Nanoparticle kemikalieprövning

The large majority of in vitro nanotoxicological studies have used immortalized cell lines for their practicality. However, results from nanoparticle ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofil Isolering och analys för att fastställa deras roll i lymfom Cell Känslighet för terapeutiska medel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Utvärdering av effekt och toxicitet av RNA Targeting HIV-1-produktion för användning i Gene eller Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

Utvinning av Hemocytes från Drosophila melanogaster larver för mikrobiell infektion och analys

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Karakterisering av Thymus-beroende och oberoende av Thymus immunglobulin isotypen Svaren hos möss använder Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

Inrättandet av virusinfektion och analys av värd-Virus interaktion i Drosophila Melanogaster

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Mänskliga Colonoid enskiktslager att studera interaktioner mellan patogener, förknippas och värd Intestinal epitel

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...