Name: implementation of interference reflection microscopy for label-free, high-speed imaging of microtubules
Uploaded: 2019-08-08T11:30:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Implementation of Interference Reflection Microscopy for Label-free, High-speed Imaging of Microtubules at JoVE.com

המחברים מודים לאנה לוקניאק ויין-ווי קואו לקריאה ביקורתית והערות על הפרוטוקול.

1. שינוי מיקרוסקופ ועדשה אובייקטיבית
<ol><li>הכנס מראה 50/50 לתוך גלגל המסנן של מיקרוסקופ הפלורסנט באמצעות קוביית סינון מתאימה (איור 1). לטפל במראה 50/50 עם טיפול לעתים קרובות יש להם ציפוי נגד השתקפות. הערה: השתמשנו 50/50 מראה בקוביית מסנן ריקה של המיקרוסקופ. השיקוף 50/50 מוכנס במקום שבו ממוקמת השיקוף הדיקרואיק.</li>
	<li>השתמש במטרה גבוהה הגדלה/גבוהה NA שמן. הערה: בפרוטוקול זה השתמשנו במטרה של 100x/1.3 NA.</li>
</ol>2. הכנה קאמרית לדבוק במיקרוטובוקלס לפני השטח
<ol><li>ניקוי שקופיות מיקרוסקופ ו 22 מ"מ x 22 מילימטר שמיכות (עבור מיקרוסקופ זקוף) או 22 מ"מ x 22 מ"מ ו 18 מ"מ x 18 מ"מ שמיכות (עבור מיקרוסקופים הפוכה). שנה את המשטח לפי הצורך. לדוגמה, לנקות את הכיסויים באמצעות אבקת כביסה אלקליין (ראה טבלת חומרים) ואחריו 100% אתנול עם שטיפת מים מזוקקים בין ואחרי11.</li>
	<li>גזור 3 מילימטר רצועות רחב של סרט פרפין פלסטיק (ראה טבלת חומרים) באמצעות להב תער ושקופית אחרת מיקרוסקופ כקצה.</li>
	<li>מניחים שני הסרט הפרפין פלסטיק שקופיות 3 מ ' בנפרד על שובר נקי 22 x 22mm לכסות. ואז למקם שמיכות 18 מ"מ x 18 מ"מ כדי ליצור ערוץ. אם באמצעות מיקרוסקופ זקוף, למקם את הרצועות על גבי שקופית מיקרוסקופ נקי ולאחר מכן למקם שמיכות על גבי.</li>
	<li>מניחים את הcoverslip (או שקופית) על בלוק חום ב 100 ° c עבור 10-30 s עבור הסרט פרפין ליצור ערוץ אטום.</li>
	<li>זרימה ב 50 μg/mL של נוגדן (ברינקלי מאגר 1980 (BRB80)) על ידי זלוף באמצעות פיפטה. . מודטה למשך 10 דקות הערה: אנו משתמשים בנוגדנים אנטי-רומדנים כדי לאגד זרעים מיקרודכדורית המסומנים לפני השטח. לחילופין, ניתן להשתמש באבידין כדי לאגד זרעים מיקרוכדורית ביוטין או לחלקיקי זהב ביולוגיים. כדי פשוט להסתכל microtubules בהעדר טובולין בפתרון (כלומר, שיטת לא דינמי), נוגדן אנטי טובולין ניתן להשתמש.</li>
	<li>שטוף חמש פעמים עם BRB80 מאגר. מומלץ לסנן את הפתרונות באמצעות מסנן של 0.22 יקרומטר.</li>
	<li>זרימה ב 1% poloxamer 407 (משולש סופולימר triblock) ב BRB80 לחסום את פני השטח מפני איגוד לא ספציפי. . מודטה למשך 10 דקות</li>
	<li>שטוף חמש פעמים עם BRB80 מאגר.</li>
	<li>המדגם מוכן להיות ממוקם על המיקרוסקופ. כדי למנוע את הדגימה מייבוש, להוסיף שתי טיפות של BRB80 מאגר בקצות הערוץ ולחדש בעת הצורך.</li>
</ol>3. יישור מיקרוסקופ
<ol><li>מניחים את הדגימה על הבמה במיקרוסקופ. . תדליק את מקור התאורה של האפינפרין</li>
	<li>. תתרכז במשטח הדגימה תוכלו להתבונן משטחים מרובים כמטרה מועברת למעלה ולמטה עקב השתקפות הגב של האור מן האופטיקה בתוך הנתיב האופטי. שיטה טובה למצוא את משטח המדגם היא להתמקד בקצה הסרט פרפין. לאחר השטח נמצא, להגדיר את שדה התצוגה למרכז החדר.</li>
	<li>המרכז את הסרעפת בשדה התצוגה על-ידי סגירתו במחצית הדרך ושימוש בברגים הכוונון. לאחר היישור, פתח מחדש את הסרעפת. הערה: התאמת בורג צריך רק להיעשות מתמיד, אולי כל 3-6 חודשים או כאשר פתרון בעיות.</li>
	<li>שקופית בעדשה ברטרנד כדי לראות את האישון היציאה (מטוס מוקד) של המטרה.</li>
	<li>סגור את דיאפרגמה הצמצם (AD) מעבר לקצות האישון של המטרה.</li>
	<li>השתמש בורגי ההתאמה כדי למרכז את המודעה עם תלמיד היציאה. בדיקה כפולה על ידי פתיחת המודעה והתאמת הקצוות שלה עם אלה של התלמיד יציאה. הערה: יש לבצע התאמה זו רק כדי לעשות זאת.</li>
	<li>הגדר את דיאפרגמה הצמצם על 2/3 של NA של המטרה. ראה סעיף 7 להליכים מפורטים למיטוב דיאפרגמה הצמצם.</li>
</ol>4. הדמיה microtubules מיוצב או 40 ננומטר זהב
הערה: microtubules מיוצב וחלקיקי זהב לשמש דגימות שליטה טובה. מומלץ משטח תמונה המצורפת microtubules או חלקיקי זהב כצעד הראשון כדי להעריך את ביצועי IRM ולעזור בקביעת פתיחת הצמצם האופטימלי הסרעפת (סעיף 7).
<ol><li>להגדיר את זמן החשיפה של המצלמה 10 ms ולהתאים את התאורה כדי להרוות כמעט את טווח דינמי המצלמה.</li>
	<li>זרימה 10 μl של guanylyl-(אלפא, בטא)-מתילן-diphosphonate (gmpccp)-או microol מיוצב מיקרוטוקלס ב BRB804,12,13 (או 40 ננומטר חלקיקי זהב) על ידי פרזיה באמצעות פיפטה למדגם טרי ולפקח איגוד על ידי הדמיה של פני השטח. ברגע 10-20 microtubules מאוגדים בתוך שדה התצוגה, לשטוף את המדגם 2x עם BRB80. הערה: עם מיקרוסקופ מיושר היטב, המיקרוטובולים צריכים להיות גלויים ללא חיסור הרקע.</li>
	<li>לרכוש 10 תמונות על ידי קביעת הפקיעה שעה עם 1 תקופת השהיה השנייה עבור 10 שניות (ב 10 ms חשיפה).</li>
	<li>לרכוש תמונת רקע. כדי לעשות זאת, להעביר את השלב באמצעות בקר הבמה או תוכנת המחשב לאורך ציר הערוץ ארוך תוך רכישת 100 תמונות ללא דיחוי (כלומר, הזרמת קרוב 100 fps @ 10 ms חשיפה). הערה: הרקע הוא החציון של 100 תמונות. על ידי נקיטת החציון, פרופיל תאורה ותכונות נייחים אחרים כמו לכלוך על האופטיקה נשמרים כל השאר מסוננים. לא צריך להיות הטיה על המדגם כמו זה יוביל לשנות את מיקום הציר כמו השלב מועבר ובסופו של דבר לבזות את תמונת הרקע. אם לא ניתן למנוע את ההטיה, אז שיטה חלופית היא לרכוש תמונות רקע ממוצעים לפני הזרמת הזרעים.</li>
	<li>לעיבוד וניתוח של התמונות, עבור לשלב 6.</li>
</ol>5. הדמיה מיקרודינמיקה
<ol><li>כדי להשתמש בטובולין המוח, הגדר את טמפרטורת התנור לדוגמה ל-37 ° c.</li>
	<li>זרימה ב 10 μl של gmpccp התייצב מחדש זרעים מיקרו ב11 על ידי זלוף באמצעות פיפטה למדגם טרי ולנטר אותם קשירה על פני השטח על ידי הדמיה פני השטח חיים (כלומר, בעת הזרמת). לאחר 10-20 הזרעים מאוגדים בשדה התצוגה, לשטוף את המדגם באמצעות נפח 2x ערוץ עם BRB80 (BRB80 צריך להיות מראש עד 37 ° צ' או לפחות בטמפרטורת החדר). הערה: עם מיקרוסקופ מיושר היטב, הזרעים צריכים להיות גלויים ללא חיסור הרקע.</li>
	<li>זרימה בתמהיל הפילמור (7.5 μm מטובולין + 1 מ"מ guanosine טריפוספט) + 1 מ"מ (dtt) במאגר BRB80). למדידת צמיחה מיקרוכדורית, לקבוע זמן פקיעה באמצעות תוכנת הרכישה לרכוש תמונה כל 5 שניות (0.2 מסגרות לשנייה (fps)) עבור 15 דקות.</li>
	<li>כדי לשפר את הניגודיות, לרכוש 10 תמונות (במקום אחד) בכל נקודה וממוצע אותם. עבור הצטמקות מיקרוטובית, לרכוש תמונות ב 100 fps על ידי הגדרת העיכוב זמן 0 ו זמן חשיפה של 10ms (fps גבוה יותר אפשרי עם אזורים קטנים יותר של ריבית בהתאם למצלמה בשימוש).</li>
	<li>לרכוש תמונת רקע כמו בשלב 4.4.</li>
</ol>6. עיבוד תמונה וניתוח
הערה: לצורך ניתוח, פרוטוקול זה משתמש בפיג14 אך הקורא חופשי להשתמש בכל תוכנה שהיא/הוא מתאים לו.
<ol><li>פתח תמונות רקע שמורות.</li>
	<li>חישוב התמונה החציוני (כלומר רקע) באמצעות תמונה > הפרוייקט ' מחסנית &Gt; Z ' &Gt; חציון.</li>
	<li>פתח סרט למיקרו-כדורית כערימה (זהה עבור microtubules שאינם דינאמיים) באמצעות הקובץ &Gt; פתיחה.</li>
	<li>הפחת את תמונת הרקע מהמחסנית באמצעות תהליך > מחשבון תמונה. הקפד לבדוק את התוצאה "32bit (ציפה)" אופציה.</li>
	<li>עבור microtubules דינאמי, באמצעות הכלי קו לצייר קו לאורך המיקרוכדורית של עניין ולהוסיף אותו לאזור של מנהל הריבית על ידי לחיצה על "t". חזור על כל המיקרוטובולים המעניינים.</li>
	<li>עבור microtubules דינאמי, הפעל את מאקרו Multi-Kymo (קובץ משלים 1). המאקרו יפיק וידאו ו-kymograph עבור כל מיקרוטוכדורית במנהל ROI. . כל מיקרוטוכדורית יקבלו מזהה ייחודי</li>
	<li>עבור microtubules דינאמי, להפעיל את המאקרו Kymo ניתוח (קובץ משלים 2) ובצע את הצעדים שלה כדי למדוד את שיעורי הצמיחה ואת שיעורי הצטמקות של microtubules.</li>
</ol>7. גודל הסרעפת הצמצם
הערה: גורם חשוב להשגת תמונות חדות גבוהה של microtubules באמצעות IRM הוא הגדרת הצמצם מספריים תאורה (INA) כראוי10,15. ניתן לשנות את האפשרות לשנות את הגודל של קרן התאורה הנכנסת באישון של המטרה הנשלט על-ידי גודל המודעה (ad ממוקם במישור המשלים עם התלמיד היציאה (מטוס מוקד לאחור) של המטרה , איור 1): <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59520/59520eq1.jpg"> כאשר DAD הוא קוטר של סרעפת הצמצם, fהמטרה היא אורך המוקד של המטרה ו -Dep הוא קוטר של המטרה של היציאה של היעד. בדרך כלל, ה-AD נשאר פתוח לחלוטין עבור הדמיה פלואורסצנטית, כך INA שווה NAשל המטרה. במיקרוסקופ פלואורסצנטית, סולם המודעה אינו מצביע על קוטרו, ולכן אי אפשר לחשב אותה. ניתן לכייל את גודל המודעה בעזרת מטרה. עם זאת, הדבר אינו נחוץ מכיוון שגודל המודעה יתוקן לגודל היוצר את הניגודיות הגבוהה ביותר.
<ol><li>הכינו דגימה של microtubules התייצב על ידי מיקרוטובוקלס מיוצב על פני השטח (שלבים 4.1-4.2). הערה: השתמשנו טטרמתירומדאן בתווית microtubules16 (Ex: 550 ננומטר, Em: 580 nm).</li>
	<li>הביאו microtubules לתוך המוקד באמצעות מיקרוסקופ התמקדות כפתור תוך הדמיה בלתי מרוכזת (אם microtubules אינם מתויג, לדמות אותם עם IRM15 או DIC5).</li>
	<li>הגדר חשיפה למצלמה 10 ms באמצעות תוכנת המצלמה. הערה: חשיפה זו היא שרירותית וחשיפה של 100 ms יעבוד גם.</li>
	<li>סגור את המודעה לפתח הקטן ביותר שלה. כוונן את התאורה כדי להרוות כמעט את הטווח הדינמי של המצלמה או עד למקסימום האפשרי. הערה: כמדריך, השתמש בטבלת המראה המסופקת בדרך כלל על-ידי תוכנת הרכישה.</li>
	<li>לרכוש 10 תמונות (על ידי זרימה או לקיחת תמונה כל שנייה) של שדה של נוף המכיל 10 + microtubules.</li>
	<li>לרכוש תמונת רקע כמו בשלב 4.4.</li>
	<li>שנה את גודל ה-AD וחזור על שלבים 7.5-7.6 לכל טווח הפתיחה של המודעה (מסגירת האישון ועד לגודל היציאה, איור 2). בכל פעם שגודל המודעה משתנה, התאימו את עוצמת התאורה שתתאים לשלב 7.4.</li>
	<li>עבור כל שדה תצוגה שנרכש, הפחת את הרקע המתאים באמצעות תהליך > מחשבון תמונה ובחירת "חיסור" מהתפריט הנפתח. ודא כי האפשרות "32bit (ציפה)" מסומנת. לאחר מכן, הממוצע תמונות שנוצרו באמצעות תמונה > חסנית > פרוייקט Z > ממוצע.</li>
	<li>מדוד את יחס הרעש לרקע (SBR) של המיקרוטובולים המוגדרים כעוצמה הממוצעת של האות המיקרו-כדורית (האינטנסיביות של המיקרו-כדורית פחות את עוצמת הרקע) מחולקת בסטיית התקן של הרקע ( איור 3).</li>
	<li>לקבוע את גודל AD האופטימלי (כלומר אופטימלית INA) על ידי חישוב sbr הממוצע של microtubules עבור כל גודל הפתיחה ולהגדיר את גודל המודעה לאחד לייצר את sbr הגבוהה ביותר (איור 2). ייתכן שקיים מגוון של גדלי AD המייצרים ניגודיות דומה15.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Widlund, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+purification+of+assembly-competent+tubulin+from+diverse+eukaryotic+sources.">One-step purification of assembly-competent tubulin from diverse eukaryotic sources.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (22), 4393-4401 (2012).</li><li>Walker, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+individual+microtubules+analyzed+by+video+light+microscopy:+rate+constants+and+transition+frequencies.">Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies.</a> The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1437-1448 (1988).</li><li>Hotani, H., Horio, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+microtubules+visualized+by+darkfield+microscopy:+Treadmilling+and+dynamic+instability.">Dynamics of microtubules visualized by darkfield microscopy: Treadmilling and dynamic instability.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 10 (1-2), 229-236 (1988).</li><li>Gittes, F., Mickey, B., Nettleton, J., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexural+rigidity+of+microtubules+and+actin+filaments+measured+from+thermal+fluctuations+in+shape.">Flexural rigidity of microtubules and actin filaments measured from thermal fluctuations in shape.</a> The Journal of Cell Biology. 120 (4), 923-934 (1993).</li><li>Bormuth, V., Howard, J., Sch&#228;ffer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LED+illumination+for+video-enhanced+DIC+imaging+of+single+microtubules.">LED illumination for video-enhanced DIC imaging of single microtubules.</a> J Microsc. 226 (Pt 1), 1-5 (2007).</li><li>Andrecka, J., Ortega Arroyo, J., Lewis, K., Cross, R. A., Kukura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+Imaging+of+Microtubules+with+Sub-nm+Precision+Using+Interferometric+Scattering+Microscopy.">Label-free Imaging of Microtubules with Sub-nm Precision Using Interferometric Scattering Microscopy.</a> Biophysical Journal. 110 (1), 214-217 (2016).</li><li>Koch, M. D., Rohrbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+Imaging+and+Bending+Analysis+of+Microtubules+by+ROCS+Microscopy+and+Optical+Trapping.">Label-free Imaging and Bending Analysis of Microtubules by ROCS Microscopy and Optical Trapping.</a> Biophysical Journal. 114 (1), 168-177 (2018).</li><li>Kandel, M. E., Teng, K. W., Selvin, P. R., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-Free+Imaging+of+Single+Microtubule+Dynamics+Using+Spatial+Light+Interference+Microscopy.">Label-Free Imaging of Single Microtubule Dynamics Using Spatial Light Interference Microscopy.</a> ACS Nano. 11 (1), 647-655 (2017).</li><li>Curtis, A. S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mechanism+of+Adhesion+of+Cells+to+Glass.">The Mechanism of Adhesion of Cells to Glass.</a> The Journal of Cell Biology. 20 (2), 199-215 (1964).</li><li>Weber, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[2]+Reflection+interference+contrast+microscopy.">[2] Reflection interference contrast microscopy.</a> Methods in Enzymology. 361, 34-47 (2003).</li><li>Gell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+13+-+Microtubule+Dynamics+Reconstituted+In+Vitro+and+Imaged+by+Single-Molecule+Fluorescence+Microscopy.">Chapter 13 - Microtubule Dynamics Reconstituted In Vitro and Imaged by Single-Molecule Fluorescence Microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 95, 221-245 (2010).</li><li>Nitzsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+14+-+Studying+Kinesin+Motors+by+Optical+3D-Nanometry+in+Gliding+Motility+Assays.">Chapter 14 - Studying Kinesin Motors by Optical 3D-Nanometry in Gliding Motility Assays.</a> Methods in Cell Biology. 95, 247-271 (2010).</li><li>Schiff, P. B., Fant, J., Horwitz, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+microtubule+assembly+in+vitro+by+taxol.">Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol.</a> Nature. 277 (5698), 665-667 (1979).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Mahamdeh, M., Simmert, S., Luchniak, A., Sch&#228;ffer, E., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+high-speed+wide-field+imaging+of+single+microtubules+using+interference+reflection+microscopy.">Label-free high-speed wide-field imaging of single microtubules using interference reflection microscopy.</a> Journal of Microscopy. 272 (1), 60-66 (2018).</li><li>Hyman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[39]+Preparation+of+modified+tubulins.">[39] Preparation of modified tubulins.</a> Methods in Enzymology. 196, 478-485 (1991).</li><li>Ruhnow, F., Zwicker, D., Diez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+Single+Particles+and+Elongated+Filaments+with+Nanometer+Precision.">Tracking Single Particles and Elongated Filaments with Nanometer Precision.</a> Biophysical Journal. 100 (11), 2820-2828 (2011).</li><li>Mahamdeh, M., Sch&#228;ffer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+tweezers+with+millikelvin+precision+of+temperature-controlled+objectives+and+base-pair+resolution.">Optical tweezers with millikelvin precision of temperature-controlled objectives and base-pair resolution.</a> Optics Express. 17 (19), 17190-17199 (2009).</li><li>Kim, K., Saleh, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilizing+method+for+reflection+interference+contrast+microscopy.">Stabilizing method for reflection interference contrast microscopy.</a> Applied Optics. 47 (12), 2070-2075 (2008).</li><li>Ortega Arroyo, J., Cole, D., Kukura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferometric+scattering+microscopy+and+its+combination+with+single-molecule+fluorescence+imaging.">Interferometric scattering microscopy and its combination with single-molecule fluorescence imaging.</a> Nature Protocols. 11 (4), 617-633 (2016).</li><li>Carter, A. R., King, G. M., Ulrich, T. A., Halsey, W., Alchenberger, D., Perkins, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+an+optical+microscope+to+0.1+nm+in+three+dimensions.">Stabilization of an optical microscope to 0.1 nm in three dimensions.</a> Appl Opt. 46 (3), 421-427 (2007).</li><li>Limozin, L., Sengupta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Reflection+Interference+Contrast+Microscopy+(RICM)+in+Soft+Matter+and+Cell+Adhesion.">Quantitative Reflection Interference Contrast Microscopy (RICM) in Soft Matter and Cell Adhesion.</a> ChemPhysChem. 10 (16), 2752-2768 (2009).</li></ol>

למחברים אין קונפליקטים של עניין לגלות.

פרוטוקול זה הפגין את השימוש המוצלח ב-IRM לדימות ולמדידה של הדינמיקה המיקרוכדורית. הטיפול צריך לתת נכונה להגדיר את הצמצם מספריים תאורה כפי שיש לו את ההשפעה החזקה ביותר על ניגודיות התמונה. גם, באמצעות הצמצם מספריים גבוהה (NA) מטרות חשוב לקבלת ברזולוציה גבוהה/תמונות חדות גבוהה, כמו מטרת NA גבוהה יותר יש אור גבוה יותר איסוף כוח לעומת מטרות NA נמוכה. המנקה את פני השטח ואת הפתרונות השתמשו הנמוך את הרעש כמו עפר בסופו של דבר הצמדת אל פני השטח והוספת (במהלך הניסוי) מיוחד כמו רעש לתמונות. הרכישה של תמונת רקע חשובה, כמו גם היא מסירה את התאורה מתאים, רעש סטטי וחריגות פני השטח.
שינוי מומלץ הוא להציג מסנן מעבר ארוך (> 600 ננומטר) בנתיב התאורה. הספקטרום של מקורות אור לבן בדרך כלל מכיל אורכי גל UV אשר יכול לפגוע microtubules. בנוסף, שימוש באורך גל ארוך עבור IRM שימושי כאשר משלבים את IRM עם הקרינה הפלואורסצנטית (למשל, כשאתה לומד את ההשפעה של חלבונים הקשורים למיקרו-כדורית (מפות) על מיקרוטוכדורית. להיות מודע לכך כאשר הדמיה לתקופה של שעות, לדוגמה להיסחף (במיוחד לאורך הציר האופטי) מקטין את ניגוד התמונה עקב סטייה של מישור התמונה מהמטוס ברקע. מיקרוסקופים מודרני מצוידים לעתים קרובות עם מנגנוני ייצוב (למשל, פוקוס מושלם (ניקון), מיקוד מובהק .2 (Zeiss), IX3-ZDC2 (אולימפוס)). פתרון אלטרנטיבי הוא לייצב את ההתקנה באופן פסיבי או פעיל18 או על ידי תיקון להיסחף19,20,21. בסופו של דבר, ניגודיות מיקרוכדורית יכולה להיות מוגברת על ידי הקטנת גודל הסרעפת (a 70% פתיחה היא בחירה טובה כפי שהוא איזון בין הניגודיות הגוברת והשדה של גודל תצוגה)15.
בעוד IRM מתאים לדימות microtubules הוא לא רגיש מספיק כדי לזהות חלבונים בודדים. עבור יישום כזה, iSCAT היא טכניקה מתאימה יותר. באופן דומה, זריחה ו-iSCAT מתאימים יותר אם מעקב אחר דיוק של פחות מ 10 ננומטר נדרש. עבור IRM, דיוק המעקב הנמדד הוא ~ 20 ננומטר כמוצג באיור 7.
שימוש ב-IRM בפני השטח יכול ללכת מעבר microtubules; למשל, מנועים מולקולריים יכול להיות מתויג עם חלקיקי זהב מעקב כפי שהם אינטראקציה עם microtubules. בנוסף לצורה מתקדמת יותר של IRM המכונה מיקרוסקופ ניגודיות רפלקטיבי (RICM)22 יכול, בעיקרון, לשמש כדי לשפר עוד יותר את הניגודיות microtubules ולקבל דיוק מעקב גבוה יותר.

הדמיה ללא תווית של microtubules הוא עניין כפי שהוא חוסם את הצורך תיוג פלורסנט של טובולין כדי ליצור ניגודיות בתמונות. תיוג פלורסנט יש החסרונות מספר: זה לא ריאלי אם ריכוז החלבון הוא נמוך1 ו-photobleaching לבנה ו-photobleaching הגבלת זמן התצפית. מספר טכניקות שימשו לתמונה ללא תווית microtubules, כולל וידאו משופר הפרעות דיפרנציאליות מיקרוסקופית הניגוד (DIC) ו ושלכת מיקרוסקופ2,3,4,5. לאחרונה, מיקרוסקופ פיזור הפרעות בהפרעות (iSCAT)6, מיקרוסקופ מסתובב קוהרנטי-פיזור (rocs)7 ומיקרוסקופ הפרעות אור מרחבית (רזה)8, יש גם שימשו. כל הטכניקות הללו מסוגלות הדמיה microtubules והוכיחו להיות ערך עבור לימוד מיקרואוכדורית. עם זאת, לכל אחד מהם יש מגבלות משלהם. ב-DIC הניגודיות תלויה בזווית שבין המיקרו-כדורית לציר הפריזמה של נוארסקי.  בשדה האפל, האות המיקרוכדורית מושפל באור מפוזר מזיהומים או פגמים במשטחים. למרות iSCAT מציג רגישות יוצאת דופן (למטה לחלבונים בודדים) ו ROCS יכול התמונה microtubules עמוק יותר לתוך המדגם, שתי השיטות הן בדרישה טכנית, הדורשות סורקי לייזר.
פרוטוקול זה מדגים כיצד מיקרוסקופ הפרעות רפלקציה (IRM)9,10 ניתן להגדיר כטכניקה חלופית עבור הדמיה ללא תווית של microtubules. IRM קל ליישם כפי שהוא דורש רק את התוספת של מראה 50/50 זולה למיקרוסקופ פלורסנט רגיל. כאשר נעשה שימוש בשילוב עם התוכנה המתוארת כאן, IRM מפיק תמונות מיקרוכדורית בחדות גבוהה, ניתן לדמות שדות גדולים של תצוגה במהירות גבוהה, מחייב יישור חד פעמי, והוא יכול בקלות להשתלב עם טכניקות אחרות כגון הדמיה פלואורסצנטית.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti-Eclipse</td>
			<td>An inverted microscope used for perfoming the expriments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50/50 beam splitter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>21000</td>
			<td>When buying make sure to choose the splitter dimensions that fit the cube used in the microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIKON PLAN FLUOR 100X/0.5-1.3 Iris objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRH02902</td>
			<td>Imaging objective. This objective has a NA adjusting iris that was opened to NA 1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mucasol universal detergent</td>
			<td>Sigma-aAldrich</td>
			<td>Z637181-2L</td>
			<td>Used for cleaning coverslips and slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic paraffin film (commerical name Parafilm M)</td>
			<td>Sigma-aAldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td>Used for constructing flow channels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TAMRA antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-6397</td>
			<td>Used to bind TAMRA labeled molecules (e.g. microtubules) to the sample surface. RRID (AB_2536196)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poloxamer 407 (commercial name Pluronic F-127)</td>
			<td>Sigma-aAldrich</td>
			<td></td>
			<td>Used for blocking the channel surface to prevent nonspecific binding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 nm gold nanoparticles</td>
			<td>Sigma-aAldrich</td>
			<td>753637</td>
			<td>Used as a control sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 nm gold nanoparticles</td>
			<td>Sigma-aAldrich</td>
			<td>753610</td>
			<td>Used as a control sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zyla 4.2 Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Zyla 4.2</td>
			<td>2048x2048 pixles (6.5&#181;m pixel size) with quantum efficiency of 72% and 16bit dynamic range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feista tracking software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://www.bcube-dresden.de/fiesta/wiki/FIESTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stabilized microtubles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>prepared in house (see references in text)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implementation of interference reflection microscopy for label-free, high-speed imaging of microtubules

ישנן מספר שיטות לדמיין biomolecules מטוהרים ליד משטחים. סה כ-פנימי השתקפות פלואורסצנטית (TIRF) מיקרוסקופ היא שיטה נפוצה, אבל יש את החיסרון כי זה דורש תיוג פלורסנט, אשר יכול להפריע לפעילות של המולקולות. כמו כן, הלבנת והנזק לתמונות הן חששות. במקרה של microtubules, גילינו כי תמונות של איכות דומה ל-TIRF ניתן להשיג באמצעות מיקרוסקופ הפרעות רפלקציה (IRM). הדבר מרמז על כך ש-IRM עשוי להיות טכניקה כללית לצורך המחשה של הדינמיקה של biomolecules גדולים ושל oligomers בתוך מבחנה. במאמר זה, אנו מראים כיצד ניתן לשנות מיקרוסקופ פלואורסצנטית פשוט להשגת תמונות IRM. IRM קל והרבה יותר זול ליישם מאשר טכניקות ניגודיות אחרות כגון הפרעות דיפרנציאליות חדות מיקרוסקופיה או פיזור אינטרמטרי. הוא גם רגיש פחות פגמים פני השטח ואת הפתרון זיהומים מיקרוסקופית שדה ושלכת באמצעות IRM, יחד עם תוכנת ניתוח התמונה המתוארת בנייר זה, שדה התצוגה וקצב המסגרות מוגבל רק על-ידי המצלמה; עם מצלמה sCMOS ואת אורך שדה רחב מיקרוכדורית ניתן למדוד עם דיוק עד 20 ננומטר עם רוחב פס של 10 Hz.

כפי שהוזכר לעיל, עם מיקרוסקופ מיושר היטב, microtubules צריכים להיות גלויים ללא הרקע חיסור (איור 4A). הפחתת הרקע (איור 4B) מגבירה את הניגודיות של המיקרו-כדורית (איור 4b). כדי לשפר עוד יותר את הניגודיות, ממוצע או סינון פורייה או שילוב של שניהם ניתן להשתמש (איור 4D, F, E). הקווים סריקות באיור 4G מראה את השיפור המצטבר של איכות התמונה. שים לב להפחתת רעשי הרקע בכל שלב בעיבוד.
דוגמאות לקימוגרפים של מיקרוטוכדורית שנוצרו מסרטים בזמן הפקיעה מוצגים באיור 5. קטעי וידאו נרכשו בשני תעריפי מסגרת: 0.2 fps (איטי) ו 100 fps (מהר). הראשון מתאים למדידת קצבי צמיחה, והאחרון מתאים יותר למדידת שיעור הצטמקות המהווה סדר גודל מהיר יותר מקצב הצמיחה.
עבור המקרה שבו חלקיקי זהב משמשים להגדרת המיקרוסקופ, תמונה לדוגמה מוצג באיור 6. חלקיקי זהב היו מחוברים בפסיביות לפני השטח. בעוד 40 מומלצים חלקיקים ננומטר, ניתן גם לדמות 20 חלקיקים nm, עדיין בניגוד נמוך.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59520/59520fig1.jpg"> איור 1. ייצוג סכימטי של IRM. (א) אפינפרין-תאורה ממקור האור עובר דרך דיאפרגמה הצמצם לפני שהגיע 50/50 המראה. הסרעפת הצמצם מגדירה את רוחב הקרן ובכך NA התאורה. מראה 50/50 משקף באופן חלקי את האור עד המטרה כדי להאיר את המדגם. אור שמשתקף מן המדגם נאסף ולאחר מכן מוקרן על שבב המצלמה (על ידי עדשת הצינור) שבו הוא מפריע ליצור את התמונה. ניגודיות תמונה היא תוצאה של ההפרעה בין האור המשתקף מממשק הזכוכית/המים (I1) והאור המשתקף מממשק המים/המיקרוכדורית (I2). בהתאם למרחק המיקרוכדורית/פני השטח (h), ההפרש בין הנתיב האופטי בין I1 ו-I2 יגרום בונה (אות בהיר) או הרסני (אות כהה) או כל דבר בין. לדוגמה, אם אור עם אורך גל של 600 ננומטר משמש לדימות, הניגוד ישתנה בין כהה לבהיר כאשר שינויים בגובה המיקרו-כדורית על-ידי כ 100 ננומטר. הכוכבית מציינת מישורים מהמשלים (משתנה מ-15). (ב) דוגמה להתקנת השיקוף 50/50. קוביית פילטר מתאימה נפתחה והמראה הוכנס למקום בו מראה דיקרואיק בדרך כלל. המראה הונחה לפי הוראות יצרן. לאחר מכן הקוביה הוכנסה לגלגל הסינון שהוכנס חזרה למיקרוסקופ (לא הוצג). במהלך ההתקנה, שימשו כפפות, והמראה הוחזקו רק בקצוות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/59520fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59520/59520fig2.jpg"> איור 2. הגדרת דיאפרגמה של צמצם אופטימלית. (A) אותו שדה של השקפה היה בתמונה בפתח הצמצם שונים הסרעפת ללא חיסור הרקע. באופן חזותי, הניגוד גדל ככל שגודל הסרעפת עלה עד שהוא הגיע לרמה והחל לבזות לאחר מכן. זה אושר על ידי (ב) sbr מדידות של תמונות רקע מופחתים. קווי שגיאה הם סטיית תקן.  סרגלי קנה מידה הם 500 יקרומטר (AD) ו-3 יקרומטר (microtubules). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/59520fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59520/59520fig3.jpg"> איור 3. . מדידת יחס הרעש לרקע מיקרוטובולים היו מבודדים. באזורי עניין כל אזור מעניין היה thresholded להפריד את המיקרוכדורית מהרקע. האות המיקרוכדורית הממוצעת הושגה מסריקת קו על פני המיקרוכדורית. רוחב שורת הסריקה הוגדר כשווה לאורך המיקרו-כדורית. בדרך זו, כל נקודה בסריקה מהווה ממוצע של האותות של כל הפיקסלים לאורך ציר המיקרו-כדורית המקביל לנקודה זו. רעשי הרקע הם סטיית התקן של כל הפיקסלים שמתחת לסף מנותקים.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/59520fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59520/59520fig4.jpg"> איור 4. עיבוד תמונה. לאחר רכישת תמונות raw (א), הרקע (ב) היה מופחתים (ג) כדי לשפר את הניגודיות המיקרוכדורית. כדי לשפר עוד יותר את הניגודיות התמונות היו ממוצעים (D) או פורייה מסוננים (E) או שניהם (F). השורה סורקת (G), אשר מיקומו מצוין על-ידי הקו האדום המקווקו (a) הם צבע מותאם לתמונות השונות ב ( א) ל (F). המספרים בפינה התחתונה הם ממוצע SBRs נמדד עבור כל שדה הראייה. סרגל קנה המידה הוא 5 יקרומטר (שונה מ15). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/59520fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59520/59520fig5.jpg"> איור 5. דוגמאות של קימוגרפים. (א) הדוגמאות kymograph של מיקרודינמיקה שנוצר מסרטים בזמן פקיעה שנרכשו ב 0.2 fps. (ב) kymograph המתאר דוגמה של אירוע הצטמקות שנוצר מסרט שנרכש ב 100 fps. קווים מקווקווים מסמנים את הזרעים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/59520fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59520/59520fig6.jpg"> איור 6. דוגמה של חלקיקי זהב בתמונה עם IRM. זהב חלקיקים של גדלים 20 ו 40 ננומטר היו מחוברים בפסיביות על פני השטח. 10 תמונות נרכשו. לאחר החיסור הרקע, התמונות היו ממוצעים כדי לשפר את הניגודיות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/59520fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59520/59520fig7.jpg"> איור 7. אורך מיקרוכדורית מעקב אחר דיוק בתמונות IRM. Microtubules התייצב (כלומר, אורכים קבועים) היו התמונה 200x ב 100 fps אז בממוצע כדי 10 fps כדי לשפר את הניגודיות. לאחר מכן, אורכם של microtubules נמדדה באמצעות תוכנת מעקב של פייסטה17 . עבור כל מיקרוכדורית האורך הממוצע וסטיית התקן חושבו כפי שמוצג בדמות (קו מקווקו מייצג את הקווים האדומים הממוצע מייצג את סטיית התקן, אורך = 3971 ± 20 ננומטר. דיוק המעקב הכולל היה הממוצע של סטיית התקן של כל microtubules מסומנים (n = 6 microtubules x 20 נקודות נתונים = 120 נקודות נתונים). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/59520fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
קובץ משלים 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/Multi_Kymo.ijm" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a> 
קובץ משלים 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/Kymo_Analysis.ijm" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Implementation of Interference Reflection Microscopy for Label-free, High-speed Imaging of Microtubules at JoVE.com

Implementation of Interference Reflection Microscopy for Label-free, High-speed Imaging of Microtubules

פרוטוקול זה הוא מדריך ליישום מיקרוסקופ הפרעות הפרעה על מיקרוסקופ מתקן פלואורסצנטית רגיל עבור תוויות ללא תווית, ניגודיות גבוהה, הדמיה במהירות גבוהה של microtubules באמצעות משטחי החוץ מבחנה assays.

יישום של מיקרוסקופ רפלקציה הפרעות עבור הדמיה ללא תווית, במהירות גבוהה של Microtubules

There are several methods for visualizing purified biomolecules near surfaces. Total-internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a commonly used ...

המשמעות של פרוטוקול זה היא שהוא מציג טכניקת הדמיה ללא תווית המסוגלת לרכוש תמונות חדות גבוהה בשיעורי פריימים גבוהים, פשוטים וזולים יותר מטכניקות אחרות כמו DIC ותחום כהה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שזה קל ליישם וזה קל לשימוש. זה זול וזה יכול להיות משולב עם מיקרוסקופים פלואורסצנטיים בקלות.השיטה פותחה להדמיית מיקרוטובולים בודדים. יש לו פוטנציאל לשמש להדמיית קומפלקסים חלבון גדולים חלקיקים. הקושי העיקרי הוא אנרגיית ההפעלה הנדרשת כדי להתעסק עם קוביית המסנן כדי להוסיף את המראה חצי כסף.העצה שלי למישהו שמנסה את הטכניקה בפעם הראשונה היא פשוט לעשות את זה. כדי להתחיל, הכנס מראה 50/50 לתוך גלגל המסנן של מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות קוביית מסנן מתאימה. לטפל במראה בזהירות לעתים קרובות יש להם קידוד נגד השתקפות.הפוך למטרה הגדלה גבוהה כי יש גם צמצם מספרי גבוה. זה המוצג כאן הוא יעד שמן 100x עם צמצם מספרי של 1.3. לאחר מכן, השתמש בסכין גילוח ובשקופית מיקרוסקופ כקצה ישר כדי לחתוך שלוש רצועות רחבות מילימטר של סרט פרפין מפלסטיק.מניחים שניים של רצועות סרט פרפין פלסטיק שלושה מילימטרים זה מזה על 22 נקי על ידי 22 מילימטר כיסוי להחליק, ולאחר מכן למקם 18 על ידי 18 מילימטר כיסוי להחליק על גבי הרצועות כדי ליצור ערוץ. מעבירים את החלקת הכיסוי לבלוק חום ב-100 מעלות צלזיוס למשך 10 עד 30 שניות כדי שסרט הפרפין יתגבש בערוץ אטום. באמצעות פיפטה, לזרום 50 מיקרוגרם למיליליטר של נוגדן אנטי רודמין על ידי נזיפה דגירה את השקופית במשך 10 דקות.לאחר הדגירה, לשטוף את הערוץ חמש פעמים באמצעות BRB80 מסונן, ולאחר מכן לזרום 1%Poloxamer 407 ב BRB80 מסונן כדי לחסום את פני השטח נגד כריכה לא ספציפית דגירה השקופית במשך 10 דקות. שוב, לשטוף את הערוץ חמש פעמים באמצעות BRB80 מסונן. כדי למנוע התייבשות הדגימה, הוסף שתי טיפות של BRB80 המסונן בקצות הערוץ והוסף מאגר נוסף לפי הצורך.מניחים את הדגימה על שלב המיקרוסקופ ומדליקים את מקור האור של תאורת האפי. התמקד בקצה סרט הפרפין כדי למצוא את משטח הדגימה ולאחר מכן הזז את השדה כדי להגדיר את התצוגה למרכז התא. תוכלו לצפות משטחים מרובים כמו המטרה מועברת למעלה ולמטה עקב השתקפות אחורית של אור אופטי בתוך הנתיב האופטי.לאחר מכן, מרכז את הסרעפת בשדה התצוגה על-ידי סגירתה באמצע הדרך ושימוש בברגים של ההתאמה. לאחר הסרעפת מיושר כראוי, לפתוח אותו מחדש. לאחר מכן, החלק בעדשת ברטרנד כדי להציג את מישור המוקד האחורי, הידוע גם כתלמיד היציאה של המטרה.סגור את הסרעפת הצמצם מעבר לקצוות של אישון היציאה ולהשתמש ברגים התאמה למרכז הסרעפת הצמצם ביחס לתלמיד היציאה. בדוק שוב על ידי פתיחת הסרעפת הצמצם התאמת הקצוות שלה עם אלה של אישון היציאה. לאחר מכן, הגדר את הסרעפת הצמצם כשני שלישים של הצמצם המספרי של המטרה.כדי להתחיל, הגדר את זמן החשיפה של המצלמה ל- 10 אלפיות שניה והתאם את התאורה כך שכמעט תרווה את הטווח הדינמי של המצלמה. לאחר מכן, השתמשו בפיפסה כדי לזרום ב-10 מיקרוליטרים של מיקרוטובולים המיוצבים על ידי GMPCPP במיקרו-מיקרומטר מסונן BRB80. לפקח על כריכת microtubule על ההדמיה של פני השטח.לאחר 10 עד 20 microtubules כבולים בתוך שדה הנוף, לשטוף את המדגם פעמיים עם BRB80 מסונן. רכוש 10 תמונות של המיקרוטובולים על-ידי הגדרת מעידת זמן עם חשיפה של 10 אלפיות שנייה ותהליכי השהיה של שנייה אחת למשך 10 שניות בסך הכל. לאחר מכן, רכוש תמונות רקע על-ידי הזזת השלב באמצעות בקר הבמה לאורך הציר הארוך של הערוץ תוך רכישת 100 תמונות ללא השהיה.כדי לדמיין דינמיקה של microtubule באמצעות צינורית המוח, התחל בקביעת טמפרטורת התנור לדוגמה ל- 37 מעלות צלזיוס. באמצעות פיפטה, לזרום 10 microliters של זרעי microtubule מיוצב GMPCPP ולנטר אותם מחייב אל פני השטח על ידי הדמיה פני השטח לחיות. לאחר 10 עד 20 זרעים כבולים בתוך שדה התצוגה, לשטוף את המדגם באמצעות נפח ערוץ כפול של BRB80 מחומם מראש ומסונן.לאחר מכן, זורמים ב-10 מיקרוליטרים של תערובת הפולימריזציה. כדי למדוד צמיחת microtubule, להגדיר לשגות זמן באמצעות תוכנת הרכישה כדי להשיג תמונה כל חמש שניות במשך 15 דקות. שפר את החדות על-ידי רכישת תמונה ממוצעת של 10 בכל נקודת זמן.רכוש תמונות רקע כפי שמוצג בסעיף הקודם. חשב את החציון על-ידי ניתוח תמונה, בחירת מחסנית ולאחר מכן פרוייקט Z ולאחר מכן חציון. הפחת את הרקע המתאים על-ידי הליכה לעיבוד, הליכה אל מחשבון תמונה ובחירה בהפחתה מהתפריט הנפתח.ודא שאפשרות התוצאה של ציפה של 32 סיביות מסומנת. עבור התכווצות microtubule, לרכוש תמונות ב 100 מסגרות לשנייה על ידי הגדרת השהיית הזמן לאפס ושמירה על זמן החשיפה ב 10 אלפיות השניה. גורם חשוב לרכישת תמונות חדות גבוהה עם מיקרוסקופ אינדוקציה הפרעה היא להגדיר כראוי את הצמצם המספרי של התאורה.זה יכול להיעשות על ידי הנחיית גודל קרן התאורה בתלמיד היציאה של המטרה, הנשלטת על ידי גודל הסרעפת הצמצם. באמצעות מדגם של microtubules מיוצבים המסומנות באופן פלורנטי, להביא את microtubules לפוקוס באמצעות ידית המיקוד של המיקרוסקופ תוך הדמיה פלואורסצנטית אותם. הגדר את החשיפה למצלמה ל- 10 אלפיות השניה וסגור את הסרעפת הצמצם לפתיחה הקטנה ביותר שלו.כמו כן, התאימו את התאורה לכמעט רוויה בטווח הדינמי של המצלמה או עד להגעה למקסימום. רכוש 10 תמונות על-ידי הזרמת שדה תצוגה המכיל 10 מיקרוטובולים או יותר. לאחר מכן רכוש תמונת רקע.שנה את גודל הסרעפת והתאם את עוצמת התאורה כך שתתאים לזה שנקבע קודם לכן. לרכוש 10 תמונות חדשות ורקע חדש. חזור על תהליך זה עד שכל טווח הסרעפת יושלם.עבור כל שדה תצוגה שנרכש, הפחת את הרקע המתאים וה ממוצע התמונות המחסות ברקע כפי שהוצגו קודם לכן. לאחר מכן, לחשב את האות הממוצע יחס רעש רקע של microtubules עבור כל גודל פתיחה. הגדר את גודל הסרעפת לזה המייצר את יחס האות הגבוה ביותר לרעשי רקע.ייתכן שיש מגוון גדלים המייצרים ניגודיות דומה כפי שמוצג כאן. עם מיקרוסקופ מיושר היטב, microtubules צריך להיות גלוי ללא חיסור רקע. עם זאת, חיסור הרקע משפר את הניגודיות של המיקרוטובול.כדי לשפר עוד יותר את הניגודיות, ממוצע, סינון 4a, או שילוב של שניהם ניתן להשתמש. סריקות הקו המוצגות כאן מתארות את השיפור המצטבר באיכות התמונה. אלה מתארים הפחתה ניכרת של רעשי רקע עם כל שלב עיבוד.דינמיקה microtubule ניתן דיווח בקינוגרפים, אשר נוצרים מסרטים לשגות זמן. קינוגרף לדוגמה שנרכש בקצב פריימים של 0.2 מסגרות לשנייה מוצג כאן. הקווים המקווקווים מסמנים את הזרעים.בעת ביצוע הליך זה, חשוב לעבוד עם מטרות צמצם מספרי גבוהות. חשוב גם ליישר ולהגדיר את גודל מסגרת קוטר הצמצם בצורה נכונה. קל לשלב IRM עם הדמיה פלואורסצנטית כדי ללמוד, למשל, חלבונים מחייבים microtubule וכיצד הם משנים דינמיקה microtubule.הטכניקה מפחיתה במידה ניכרת את נזקי הצילום ומאפשרת רכישת קצב מסגרות גבוה יותר, מה שמקל על לימוד ביופולימרים מסומנים כגון microtubules לפרקי זמן ממושכים עם רזולוציית זמן גבוהה ודיוק מעקב טוב.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Bioengineering

Unit 1

The Cytoskeleton II: Microtubules and Intermediate Filaments

SCIENTISTS IN ACTION

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

ללא קשר, לייבל ללא ניטור של תאים תאי מטריקס באמצעות ספקטרוסקופיית ראמאן

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

ויזואליזציה של קליפת הארגון ואת הדינמיקה של מיקרואורגניזמים, באמצעות Fluorescence סה&quot;כ פנימי מיקרוסקופית השתקפות

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Biochip אלקטרוכימי מבוסס Microfluidic לניתוח הכלאה DNA ללא תווית

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

טכניקה ללא תווית להדמית החלל-הזמן של פרשות תא בודדת

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

ללא תווית מולקולה בודדת איתור באמצעות תהודה אופטית Microtoroid

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

High Speed Sub-GHz Spectrometer for Brillouin Scattering Analysis

ספקטרומטר תת-GHz מהירות גבוהה לניתוח פיזור רילואן

The goal of this protocol is to build a parallel high-extinction and high-resolution optical Brillouin spectrometer. Brillouin spectroscopy is a ...

A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors

A Guide to מיקרוסקופית TIRF תאורה מובנית ב- High Speed ​​עם צבעים מרובים

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular ...

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

PIP על שבב: מחקר ללא תווית של אינטראקציות חלבון- phosphoinositide

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy

הערכת Microarchitectures תלויי-לחץ קולגן ואלסטין, חיים, אנושי התנגדות העורקים על ידי קרינה פלואורסצנטית ללא תווית מיקרוסקופ

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

להמחיש אדהזיה היווצרות בתאים באמצעות מתקדם ספינינג מיקרוסקופ פלורסצנטיות השתקפות פנימית דיסק-סיכום

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...