Name: implementation of interference reflection microscopy for label-free, high-speed imaging of microtubules
Uploaded: 2019-08-08T11:30:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Implementation of Interference Reflection Microscopy for Label-free, High-speed Imaging of Microtubules at JoVE.com

Gli Autori ringraziano Anna Luchniak e Yin-wei Kuo per la lettura critica e i commenti sul protocollo.

1. Modifica del microscopio e lente obiettivo
<ol><li>Inserire uno specchio 50/50 nella ruota filtrante del microscopio fluorescente utilizzando un cubo di filtro appropriato (Figura 1). Maneggiare lo specchio 50/50 con cura come spesso hanno rivestimento antiriflesso. NOTA: Abbiamo usato uno specchio 50/50 in un cubo di filtro vuoto del microscopio. Lo specchio 50/50 viene inserito nel punto in cui si trova lo specchio dicroico.</li>
	<li>Utilizzare un obiettivo di olio NA alto e ingrandimento. NOTA: in questo protocollo è stato utilizzato un obiettivo 100x/1.3 NA.</li>
</ol>2. Preparazione della camera per aderire microtubuli alla superficie
<ol><li>Vetrini al microscopio puliti e copricapi 22 mm x 22 mm (per microscopio verticale) o 22 mm x 22 mm e 18 mm x 18 mm (per microscopi invertiti). Modificare la superficie in base alle esigenze. Ad esempio, pulire i coperchi utilizzando un detergente alcalina (vedi Tabella dei materiali) seguito da 100% di etanolo con lava acqua distillata tra e dopo11.</li>
	<li>Tagliare strisce larghe 3 mm di pellicola di paraffina di plastica (vedi Tabella deimateriali) utilizzando una lama di rasoio e un altro vetrino al microscopio come bordo.</li>
	<li>Posizionare due pellicole di paraffina di plastica distanti 3 mm su uno scivolo di copertura pulito da 22 x 22 mm. Quindi posizionare un coverslip da 18 mm x 18 mm per formare un canale. Se si utilizza un microscopio verticale, posizionare le strisce sopra un vetrino al microscopio pulito e quindi posizionare un coperchio sulla parte superiore.</li>
	<li>Posizionare il coperchio (o scivolare) su un blocco di calore a 100 gradi centigradi per 10-30 s affinché la pellicola di paraffina formi un canale sigillato.</li>
	<li>Flusso in 50 g/mL di anticorpo (in Brinkley Buffer 1980 (BRB80)) mediante perfusione con una pipetta. Incubare per 10 min. NOTA: Utilizziamo anticorpi anti-rhodamine per legare semi di microtubuli etichettati con rhodamina alla superficie. In alternativa, l'avidina può essere utilizzata per legare semi di microtubuli etichettati con biotina o per particelle d'oro biotinylate. Per guardare semplicemente i microtubuli in assenza di tubulina in soluzione (cioè un saggio non dinamico), può essere utilizzato un anticorpo anti-tubulina.</li>
	<li>Lavare cinque volte con il buffer BRB80. Si consiglia di filtrare le soluzioni utilizzando un filtro di 0,22 m.</li>
	<li>Flusso nell'1% poloxamer 407 (un copolimero triblocco) in BRB80 per bloccare la superficie contro un legame non specifico. Incubare per 10 min.</li>
	<li>Lavare cinque volte con il buffer BRB80.</li>
	<li>Il campione è pronto per essere posizionato al microscopio. Per evitare che il campione si secchi, aggiungere due goccioline di tampone BRB80 alle estremità del canale e ricostituire quando necessario.</li>
</ol>3. Allineamento del microscopio
<ol><li>Posizionare il campione sullo stadio del microscopio. Accendere la fonte di luce per l'epiilluminazione.</li>
	<li>Concentrarsi sulla superficie campione. Si osserveranno più superfici mentre l'obiettivo viene spostato su e giù a causa del riflesso posteriore della luce proveniente dall'ottica all'interno del percorso ottico. Un buon metodo per trovare la superficie di campionamento è quello di concentrarsi sul bordo della pellicola di paraffina. Una volta trovata la superficie, impostare il campo visivo al centro della camera.</li>
	<li>Centrare il diaframma del campo nel campo visivo chiudendolo a metà strada e utilizzando le viti di regolazione. Una volta allineato, riaprire il diaframma. NOTA: la regolazione delle viti deve essere eseguita solo sporadicamente, forse ogni 3-6 mesi o durante la risoluzione dei problemi.</li>
	<li>Far scorrere nell'obiettivo di Bertrand per visualizzare la pupilla di uscita (piano focale posteriore) dell'obiettivo.</li>
	<li>Chiudere il diaframma di apertura (AD) oltre i bordi della pupilla di uscita dell'obiettivo.</li>
	<li>Utilizzare le viti di regolazione per centrare l'AD con la pupilla di uscita. Controllare due volte aprendo l'AD e abbinando i suoi bordi con quelli della pupilla di uscita. NOTA: Questa regolazione deve essere eseguita solo sporadicamente.</li>
	<li>Impostare il diaframma di apertura a circa 2/3 della NA dell'obiettivo. Vedere la sezione 7 per le procedure dettagliate per l'ottimizzazione del diaframma di apertura.</li>
</ol>4. Imaging di microtubuli stabilizzati o particelle d'oro da 40 nm
NOTA: microtubuli stabilizzati e nanoparticelle d'oro servono come buoni campioni di controllo. Si raccomanda di visualizzare microtubuli attaccati alla superficie o nanoparticelle d'oro come primo passo per valutare le prestazioni IRM e aiutare a impostare l'apertura ottimale del diaframma di apertura (sezione 7).
<ol><li>Impostare il tempo di esposizione della fotocamera su 10 ms e regolare l'illuminazione per quasi saturare la gamma dinamica della fotocamera.</li>
	<li>Flusso in microtubuli 10 -L di guanylyl-(alpha, beta)-diphosphonate (GMPCCP)- o taxol-stabilid in BRB804,12,13 (o 40 nm gold particles) mediante perfusione utilizzando una pipetta a un campione nuovo e monitorare rilegatura mediante l'imaging della superficie. Una volta che 10-20 microtubuli sono legati all'interno del campo visivo, lavare il campione 2x con BRB80. NOTA: Con un microscopio ben allineato, i microtubuli devono essere visibili senza sottrazione di fondo.</li>
	<li>Acquisire 10 immagini impostando un intervallo di tempo con un periodo di ritardo di 1 secondo per 10 secondi (a 10 ms di esposizione).</li>
	<li>Acquisire un'immagine di sfondo. A tale scopo, spostare lo stage utilizzando il controller dello stage o il software del computer lungo l'asse lungo del canale durante l'acquisizione di 100 immagini senza ritardo (cioè lo streaming vicino a 100 fps e 10 ms di esposizione). NOTA: lo sfondo è la mediana delle 100 immagini. Prendendo la mediana, il profilo di illuminazione e altre caratteristiche fisse come lo sporco sull'ottica vengono conservati mentre tutto il resto viene filtrato. Non ci dovrebbe essere alcuna inclinazione sul campione in quanto questo porterà a cambiare la posizione assiale come lo stage viene spostato e, infine, degradare l'immagine di sfondo. Se l'inclinazione non può essere evitata, allora un metodo alternativo è quello di acquisire immagini di sfondo medie prima di scorrere i semi.</li>
	<li>Per l'elaborazione e l'analisi delle immagini, andare al passaggio 6.</li>
</ol>5. Imaging microtubulo dinamiche
<ol><li>Per la dinamica dei microtubuli che utilizzano la tubulina cerebrale, impostare la temperatura del riscaldatore del campione su 37 gradi centigradi.</li>
	<li>Flusso in 10 -L di semi di microtubuli stabilizzati da GMPCCP in BRB8011 mediante perfusione utilizzando una pipetta su un campione fresco e monitorarli legandosi alla superficie mediante l'imaging della superficie in diretta (cioè durante lo streaming). Una volta che 10-20 semi sono legati con campo visivo, lavare il campione utilizzando il volume di 2x canale con BRB80 (BRB80 deve essere preriscaldato a 37 o almeno a temperatura ambiente). NOTA: Con un microscopio ben allineato, i semi dovrebbero essere visibili senza sottrazione di fondo.</li>
	<li>Flusso nella miscela di polimerizzazione (7,5 M di tubulina non etichettata - 1 mM di trefosfato di guanosina (GTP) - 1 mM Dithiothreitol (DTT) nel buffer BRB80). Per misurare la crescita dei microtubuli, impostare un time-lapse utilizzando il software di acquisizione per acquisire un'immagine ogni 5 secondi (0,2 fotogrammi al secondo (fps)) per 15 minuti.</li>
	<li>Per migliorare il contrasto, acquisisci 10 immagini (invece di una) ad ogni punto temporale e calcola la media. Per il ritiro dei microtubuli, acquisire immagini a 100 fps impostando il ritardo su 0 e un tempo di esposizione di 10 ms (fps più alti è possibile con regioni di interesse più piccole a seconda della fotocamera utilizzata).</li>
	<li>Acquisire un'immagine di sfondo come nel passaggio 4.4.</li>
</ol>6. Elaborazione e analisi delle immagini
NOTA: Per l'analisi, questo protocollo utilizza Fiji14 ma il lettore è libero di utilizzare qualsiasi software che lei / lui trovare adatto.
<ol><li>Aprire le immagini di sfondo salvate.</li>
	<li>Calcolate l'immagine mediana (cioè lo sfondo) utilizzando Immagine > Stack > : progetto > Mediana.</li>
	<li>Aprite il filmato delle dinamiche dei microtubuli come pila (lo stesso per i microtubuli non dinamici) utilizzando File > Apri.</li>
	<li>Sottrarre l'immagine di sfondo dalla pila utilizzando Processo > Calcolatore immagini. Assicurati di controllare l'opzione "risultato 32bit (float)".</li>
	<li>Per i microtubuli dinamici, l'utilizzo dello strumento linea traccia una linea lungo il microtubulo di interesse e lo aggiunge alla regione di gestione degli interessi premendo "t". Ripetere l'operazione per tutti i microtubuli di interesse.</li>
	<li>Per i microtubuli dinamici, eseguire la macro Multi-Kymo (File supplementare 1). La macro genererà un video e un kymografo per ogni microtubulo nel gestore del ROI. Ogni microtubulo otterrà un identificatore univoco.</li>
	<li>Per i microtubuli dinamici, eseguire la macro Kymo-Analysis (Supplementary File 2) e seguire i suoi passi per misurare i tassi di crescita e i tassi di restringimento dei microtubuli.</li>
</ol>7. Aperture diaframma taglia
NOTA: Un fattore importante per l'acquisizione di immagini ad alto contrasto di microtubuli utilizzando IRM è l'impostazione corretta dell'apertura numerica dell'illuminazione (INA)10,15. L'INA può essere modificato modificando la dimensione del fascio di illuminazione in entrata presso l'alunno di uscita dell'obiettivo che è controllato dalle dimensioni dell'AD (l'AD si trova su un piano coniugato con la pupilla di uscita (piano posteriore) dell'obiettivo , Figura 1): <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59520/59520eq1.jpg"> dove DAD è il diametro del diaframma di apertura, l'obiettivo f è la lunghezza focale dell'obiettivo e Dep è il diametro della pupilla di uscita dell'obiettivo. Tipicamente, l'AD viene lasciato completamente aperto per l'imaging a fluorescenza, quindi l'INA è uguale a NAdell'obiettivo. In un microscopio a fluorescenza, la scala AD non ne indica il diametro, quindi l'INA non può essere calcolato. È possibile calibrare la dimensione ad con l'aiuto di un obiettivo. Tuttavia, non è necessario poiché la dimensione di AD sarebbe fissata alla dimensione che produce il contrasto più alto.
<ol><li>Preparare un campione di microtubuli stabilizzati etichettati fluorescentmente attaccati alla superficie (passi 4.1-4.2). NOTA: Abbiamo usato microtubuli tetrametilholrhodamine etichettati16 (Es. 550 nm, Em: 580 nm).</li>
	<li>Mettere a fuoco i microtubuli utilizzando la manopola di messa a fuoco del microscopio durante l'imaging fluorescente (se i microtubuli non sono etichettati, immagine con IRM15 o DIC5).</li>
	<li>Impostare l'esposizione della fotocamera a 10 ms utilizzando il software della fotocamera. NOTA: Questa esposizione è arbitraria e funzionerebbe anche un'esposizione di 100 ms.</li>
	<li>Chiudere l'AD alla sua apertura più piccola. Regolare l'illuminazione per quasi saturare l'intervallo dinamico della fotocamera o al massimo possibile. NOTA: come guida, utilizzare la tabella di ricerca fornita in genere dal software di acquisizione.</li>
	<li>Acquisisci 10 immagini (trasmettendo un'immagine ogni secondo) di un campo visivo contenente oltre 10 microtubuli.</li>
	<li>Acquisire un'immagine di sfondo come nel passaggio 4.4.</li>
	<li>Modificare le dimensioni di Active Directory e ripetere i passaggi 7.5-7.6 per l'intero intervallo di apertura di Active Directory (dalla dimensione della pupilla chiusa alla dimensione della pupilla di uscita, Figura 2). Ogni volta che la dimensione dell'AD viene modificata, regolare l'intensità di illuminazione in modo che corrisponda a quella del passaggio 7.4.</li>
	<li>Per ogni campo visivo acquisito, sottrarre lo sfondo corrispondente utilizzando processo > calcolatrice di immagini e scegliendo "Sottrai" dal menu a discesa. Assicurati che l'opzione "Risultato a 32 bit (float)" sia selezionata. Quindi calcolare la media delle immagini risultanti utilizzando image > stack > : progetto > media.</li>
	<li>Misurare il rapporto segnale-rumore di fondo (SBR) dei microtubuli definiti come l'intensità media del segnale di microtubuli (intensità del microtubulo meno l'intensità dello sfondo) diviso per la deviazione standard dello sfondo ( Figura 3).</li>
	<li>Determinare la dimensione ottimale dell'AD (cioè l'INA ottimale) calcolando la SBR media dei microtubuli per ogni dimensione di apertura e impostare la dimensione dell'AD su quella che produce la SBR più alta (Figura 2). È possibile che esista una gamma di dimensioni AD che producono un contrasto comparabile15.</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Questo protocollo ha dimostrato il successo dell'uso di IRM per l'imaging e la misurazione della dinamica dei microtubuli. Occorre prestare attenzione a impostare correttamente l'apertura numerica dell'illuminazione in quanto ha il maggiore impatto sul contrasto dell'immagine. Inoltre, l'utilizzo di obiettivi ad alta apertura numerica (NA) è importante per ottenere immagini ad alta risoluzione/contrasto elevato, poiché un obiettivo NA più alto ha una maggiore potenza di raccolta della luce rispetto agli obiettivi NA bassi. Più pulita è la superficie e le soluzioni utilizzate minore è il rumore quando lo sporco finisce per attaccarsi alla superficie e aggiungere (nel corso dell'esperimento) macchiare come il rumore alle immagini. L'acquisizione di un'immagine di sfondo è importante in quanto rimuove le inomogeneità dell'illuminazione, il rumore statico e le irregolarità superficiali.
Una modifica consigliata consiste nell'introdurre un filtro passa lungo (>600 nm) nel percorso di illuminazione. Lo spettro delle sorgenti di luce bianca contiene in genere lunghezze d'onda nei raggi UV che possono danneggiare i microtubuli. Inoltre, l'utilizzo della lunghezza a onde lunghe per IRM è utile quando si combina IRM con la fluorescenza (ad esempio, quando si studia l'effetto delle proteine associate ai microtubuli (MAC) sulla dinamica dei microtubuli. Tenere presente che quando si esegue l'imaging per un periodo di tempo accelerato, la deriva del campione (soprattutto lungo l'asse ottico) riduce il contrasto dell'immagine a causa della deviazione del piano dell'immagine dal piano di sfondo. I microscopi moderni sono spesso dotati di meccanismi di stabilizzazione (ad es. messa a fuoco perfetta (Nikon), Messa a fuoco definita.2 (Eiss), IX3-'DC2 (Olympus)). Una soluzione alternativa è quella di stabilizzare termicamente l'impostazione passivamente o attivamente18 o correggendo per deriva19,20,21. Infine, il contrasto dei microtubuli può essere aumentato riducendo le dimensioni del diaframma di campo (un'apertura del 70% è una buona scelta in quanto è un equilibrio tra contrasto crescente e campo di dimensione della vista)15.
Mentre IRM è adatto per l'imaging di microtubuli non è abbastanza sensibile per rilevare singole proteine. Per tale applicazione, iSCAT è una tecnica più adatta. Analogamente, la fluorescenza e iSCAT sono più adatte se è necessaria una precisione di tracciamento inferiore a 10 nm. Per IRM, la precisione di rilevamento della lunghezza misurata è di 20 nm, come illustrato nella Figura 7.
L'uso di IRM nei saggi di superficie può andare oltre i microtubuli; ad esempio, i motori molecolari possono essere etichettati con nanoparticelle d'oro e tracciati mentre interagiscono con i microtubuli. Inoltre, una forma più avanzata di IRM, nota come microscopia riflettente a contrasto di interferenza (RICM)22, può, in linea di principio, essere utilizzata per migliorare ulteriormente il contrasto dei microtubuli e ottenere una maggiore precisione di tracciamento.

L'imaging senza etichette di microtubuli è di interesse in quanto elude la necessità di etichettatura fluorescente della tubulina per generare contrasto nelle immagini. L'etichettatura fluorescente presenta diversi inconvenienti: non è possibile se la concentrazione proteica è bassa1 e il fotosbleaching e il fotodanno limitano il tempo di osservazione. Diverse tecniche sono state utilizzate per l'immagine di microtubuli senza etichetta, tra cui la microscopia a contrasto delle interferenze differenziali potenziata video (DIC) e la microscopia darkfield2,3,4,5. Recentemente, sono state utilizzate anche la microscopia a dispersione interferometrica (iSCAT)6, la microscopia a dispersione rotante-coerente (ROCS)7 e la microscopia a interferenza spaziale della luce (SLIM)8. Tutte queste tecniche sono in grado di imaging microtubuli e si sono dimostrate preziose per lo studio della dinamica dei microtubuli. Tuttavia, ognuno ha i propri limiti. In DIC il contrasto dipende dall'angolo tra il microtubulo e l'asse del prisma Nomarski.  Nel campo oscuro, il segnale del microtubulo è degradato dalla luce diffusa proveniente da impurità o difetti superficiali. Anche se iSCAT presenta una straordinaria sensibilità (fino a singole proteine) e ROCS può immagini microtubuli più in profondità nel campione, entrambi i metodi sono tecnicamente esigenti, che richiedono scanner laser.
Questo protocollo dimostra come la microscopia a riflessione di interferenza (IRM)9,10 può essere impostata come una tecnica alternativa per l'imaging senza etichette di microtubuli. IRM è facile da implementare in quanto richiede solo l'aggiunta di uno specchio 50/50 poco costoso a un microscopio fluorescente standard. Se utilizzato in combinazione con il software descritto qui, IRM produce immagini di microtubuli ad alto contrasto, può immaginare grandi campi visivi ad alta velocità, richiede un allineamento una tantore e può essere facilmente combinato con altre tecniche come l'imaging a fluorescenza.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti-Eclipse</td>
			<td>An inverted microscope used for perfoming the expriments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50/50 beam splitter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>21000</td>
			<td>When buying make sure to choose the splitter dimensions that fit the cube used in the microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIKON PLAN FLUOR 100X/0.5-1.3 Iris objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRH02902</td>
			<td>Imaging objective. This objective has a NA adjusting iris that was opened to NA 1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mucasol universal detergent</td>
			<td>Sigma-aAldrich</td>
			<td>Z637181-2L</td>
			<td>Used for cleaning coverslips and slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic paraffin film (commerical name Parafilm M)</td>
			<td>Sigma-aAldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td>Used for constructing flow channels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TAMRA antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-6397</td>
			<td>Used to bind TAMRA labeled molecules (e.g. microtubules) to the sample surface. RRID (AB_2536196)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poloxamer 407 (commercial name Pluronic F-127)</td>
			<td>Sigma-aAldrich</td>
			<td></td>
			<td>Used for blocking the channel surface to prevent nonspecific binding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 nm gold nanoparticles</td>
			<td>Sigma-aAldrich</td>
			<td>753637</td>
			<td>Used as a control sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 nm gold nanoparticles</td>
			<td>Sigma-aAldrich</td>
			<td>753610</td>
			<td>Used as a control sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zyla 4.2 Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Zyla 4.2</td>
			<td>2048x2048 pixles (6.5&#181;m pixel size) with quantum efficiency of 72% and 16bit dynamic range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feista tracking software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://www.bcube-dresden.de/fiesta/wiki/FIESTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stabilized microtubles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>prepared in house (see references in text)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implementation of interference reflection microscopy for label-free, high-speed imaging of microtubules

Esistono diversi metodi per visualizzare le biomolecole purificate vicino alle superfici. La microscopia a fluorescenza totale-interna (TIRF) è un metodo comunemente usato, ma ha lo svantaggio che richiede un'etichettatura fluorescente, che può interferire con l'attività delle molecole. Inoltre, il fotosbiancamento e i danni fotografici sono preoccupazioni. Nel caso dei microtubuli, abbiamo scoperto che immagini di qualità simile a TIRF possono essere ottenute utilizzando la microscopia di riflessione delle interferenze (IRM). Ciò suggerisce che IRM potrebbe essere una tecnica generale per visualizzare la dinamica di grandi biomolecole e oligomeri in vitro. In questo articolo, mostriamo come un microscopio a fluorescenza può essere modificato semplicemente per ottenere immagini IRM. L'IRM è più facile e notevolmente più economico da implementare rispetto ad altre tecniche di contrasto come la microcopia a contrasto delle interferenze differenziali o la microscopia a dispersione interferometrica. È anche meno suscettibile ai difetti superficiali e alle impurità della soluzione rispetto alla microscopia darkfield. Utilizzando IRM, insieme al software di analisi delle immagini descritto in questo documento, il campo visivo e la frequenza fotogrammi sono limitati solo dalla fotocamera; con una telecamera sCMOS e una lunghezza dei microtubuli di illuminazione a campo largo possono essere misurate con precisione fino a 20 nm con una larghezza di banda di 10 Hz.

Come accennato in precedenza, con un microscopio ben allineato, i microtubuli dovrebbero essere visibili senza sottrazione di fondo (Figura 4A). Sottraendo lo sfondo (Figura 4B) migliora il contrasto dei microtubuli (Figura 4C). Per migliorare ulteriormente il contrasto, è possibile utilizzare la media o il filtro Fourier o una combinazione di entrambi (Figura 4D,F,E). Le scansioni di linea in Figura 4G mostra il miglioramento incrementale della qualità dell'immagine. Si noti la riduzione del rumore di fondo a ogni fase di elaborazione.
Esempi di kymografi e dinamiche di microtubuli generate da filmati time-lapse sono mostrati nella Figura 5. I video sono stati acquisiti a due frame rate: 0,2 fps (lento) e 100 fps (veloce). Il primo è adatto per misurare i tassi di crescita, mentre il secondo è più adatto per misurare il tasso di restringimento che è un ordine di grandezza più veloce del tasso di crescita.
Nel caso in cui le nanoparticelle d'oro vengono utilizzate per impostare il microscopio, un'immagine di esempio è mostrata nella Figura 6. Le nanoparticelle d'oro sono state attaccate passivamente alla superficie. Mentre si raccomandano 40 particelle di nm, è anche possibile immaginidi20 nm particelle, ma a un contrasto inferiore.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59520/59520fig1.jpg"> come illustrato nella Figura 1. Rappresentazione schematica di IRM. (A) L'epiilluminazione della sorgente luminosa passa attraverso il diaframma di apertura prima di raggiungere lo specchio 50/50. Il diaframma di apertura imposta la larghezza del fascio così l'illuminazione NA. Lo specchio 50/50 riflette parzialmente la luce fino all'obiettivo di illuminare il campione. La luce riflessa dal campione viene raccolta e quindi proiettata sul chip della fotocamera (dall'obiettivo del tubo) dove interferisce per generare l'immagine. Il contrasto dell'immagine è il risultato dell'interferenza tra la luce riflessa dall'interfaccia vetro/acqua (I1) e la luce riflessa dall'interfaccia acqua/microtubulo (I2). A seconda della distanza microtubulo/superficie (h), la differenza di percorso ottico tra I1 e I2 si tradurrà in un segnale costruttivo (segnale luminoso) o distruttivo (segnale scuro) o qualsiasi altra cosa in mezzo. Ad esempio, se per l'imaging viene utilizzata una luce con una lunghezza d'onda di 600 nm, il contrasto passerà da scuro a luminoso quando l'altezza dei microtubuli cambia di circa 100 nm. L'asterisco indica i piani coniugati (modificati a partire da15). (B) Esempio dell'installazione del mirror 50/50. È stato aperto un cubo di filtro adatto e lo specchio è stato inserito dove di solito si trova uno specchio dicroico. Lo specchio era orientato come dalle istruzioni del produttore. Quindi il cubo è stato inserito nella ruota del filtro che è stata inserita al microscopio (non mostrata). Durante l'installazione, sono stati utilizzati guanti, e lo specchio è stato tenuto solo dai bordi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/59520fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59520/59520fig2.jpg"> come illustrato nella Figura 2. Impostazione ottimale del diaframma di apertura. (A) Lo stesso campo visivo è stato immagine ad diverse aperture diaframma di apertura senza sottrazione dello sfondo. Visivamente, il contrasto aumentò con l'aumentare delle dimensioni del diaframma di apertura fino a raggiungere un altopiano e cominciò a degradarsi in seguito. Ciò è stato confermato dalle misurazioni SBR (B) delle immagini sottratte di sfondo. Le barre di errore sono una deviazione standard.  Le barre di scala sono di 500 m (AD) e di 3 m (microtubuli). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/59520fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59520/59520fig3.jpg"> come illustrato nella figura 3. Misurazione del rapporto di rumore segnale-sfondo. I microtubuli sono stati isolati nelle regioni di interesse. Ogni regione di interesse è stata sogliata per separare il microtubulo dallo sfondo. Il segnale medio del microtubulo è stato ottenuto da una scansione di linea attraverso il microtubulo. La larghezza della linea di scansione è stata impostata in modo da essere uguale alla lunghezza del microtubulo. In questo modo, ogni punto della scansione è una media dei segnali di tutti i pixel lungo l'asse dei microtubuli che sono paralleli a quel punto. Il disturbo di fondo è la deviazione standard di tutti i pixel al di sotto della soglia tagliati.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/59520fig3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59520/59520fig4.jpg"> come illustrato nella Figura 4. Elaborazione delle immagini. Dopo l'acquisizione di immagini grezze (A), lo sfondo (B) è stato sottratto (C) per migliorare il contrasto dei microtubuli. Per migliorare ulteriormente il contrasto le immagini sono state mediate (D) o Fourier filtrate (E) o entrambe (F). Le scansioni di linea (G), la cui posizione è indicata dalla linea rossa tratteggiata in (A) sono a colori corrispondenti alle varie immagini in (A) a (F). I numeri nell'angolo inferiore sono SBR medi misurati per l'intero campo visivo. La barra della scala è di 5 m (modificata a partire da15). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/59520fig4large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59520/59520fig5.jpg"> come illustrato nella Figura 5. Esempi di kymografi. (A) Esempi di Kymograph di dinamiche di microtubuli generate da filmati time-lapse acquisiti a 0,2 fps. (B) Kymograph raffigura un esempio di un evento di restringimento generato da un film acquisito a 100 fps. Linee tratteggiate segnano i semi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/59520fig5large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59520/59520fig6.jpg"> come illustrato nella Figura 6. Esempio di nanoparticelle d'oro immagini con IRM. Le nanoparticelle d'oro delle dimensioni 20 e 40 nm sono state attaccate passivamente alla superficie. Sono state acquisite 10 immagini. Dopo la sottrazione dello sfondo, le immagini sono state mediate per migliorare il contrasto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/59520fig6large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59520/59520fig7.jpg"> come illustrato nella Figura 7. Lunghezza microtubulo Precisione di tracciamento nelle immagini IRM. I microtubuli stabilizzati (cioè le lunghezze fisse) sono stati immagini 200x a 100 fps, quindi mediati a 10 fps per migliorare il contrasto. Successivamente, le lunghezze dei microtubuli sono state misurate utilizzando il software di monitoraggio Fiesta17. Per ogni microtubulo la lunghezza media e la deviazione standard sono state calcolate come mostrato nella figura (la linea tratteggiata rappresenta la media e le linee rosse continue rappresentano la deviazione standard, lunghezza - 3971 - 20 nm. La precisione di tracciamento complessiva è stata la media della deviazione standard di tutti i microtubuli tracciati (n x 6 microtubuli x 20 punti dati , 120 punti dati). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/59520fig7large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
File supplementare 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/Multi_Kymo.ijm" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a> 
File supplementare 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/Kymo_Analysis.ijm" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>

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Implementation of Interference Reflection Microscopy for Label-free, High-speed Imaging of Microtubules

Questo protocollo è una guida per l'implementazione della microscopia a riflessione di interferenza su un microscopio a fluorescenza standard per l'imaging senza etichette, ad alto contrasto e ad alta velocità dei microtubuli utilizzando analisi in vitro.

Implementazione della microscopia di riflessione delle interferenze per l'imaging ad alta velocità e senza etichetta dei microtubuli

There are several methods for visualizing purified biomolecules near surfaces. Total-internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a commonly used ...

Il significato di questo protocollo è che introduce una tecnica di imaging senza etichette in grado di acquisire immagini ad alto contrasto ad alte velocità di fotogrammi che è più semplice ed economica di altre tecniche come DIC e campo scuro. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è facile da implementare ed è facile da usare. È economico e può essere combinato facilmente con microscopi a fluorescenza.Il metodo è stato sviluppato per visualizzare i singoli microtubuli. Ha il potenziale per essere utilizzato per visualizzare grandi complessi proteici e nanoparticelle. La difficoltà principale è l'energia di attivazione necessaria per armeggiare con il cubo filtrante per aggiungere il mezzo specchio d'argento.Il mio consiglio a qualcuno che sta provando la tecnica per la prima volta è solo farlo. Per iniziare, inserire uno specchio 50/50 nella ruota filtrante di un microscopio fluorescente utilizzando un cubo filtrante appropriato. Maneggiare lo specchio con cura tutte le volte che hanno una codifica anti-riflessione.Passare a un obiettivo ad alto ingrandimento che ha anche un'apertura numerica elevata. Quello mostrato qui è un obiettivo di olio 100x con un'apertura numerica di 1,3. Successivamente, utilizzare una lama di rasoio e uno scivolo al microscopio come bordo dritto per tagliare tre strisce larghe tre millimetri di pellicola di paraffina di plastica.Posizionare due strisce di pellicola di paraffina di plastica a tre millimetri di distanza su uno scivolo di copertura pulito di 22 per 22 millimetri, quindi posizionare uno scivolo di copertura di 18 per 18 millimetri sopra le strisce per formare un canale. Trasferire il coperchio in un blocco di calore a 100 gradi celsius per 10-30 secondi affinché la pellicola di paraffina formi un canale sigillato. Utilizzando una pipetta, scorrere in 50 microgrammi per millilitro di un anticorpo anti-rodiammina per perfusione e incubare lo scivolo per 10 minuti.Dopo l'incubazione, lavare il canale cinque volte utilizzando BRB80 filtrato, quindi scorrere in 1%Poloxamer 407 nel BRB80 filtrato per bloccare la superficie contro attacchi non specifici e incubare il vetrino per 10 minuti. Ancora una volta, lavare il canale cinque volte utilizzando BRB80 filtrato. Per evitare che il campione si asciughi, aggiungere due goccioline del BRB80 filtrato alle estremità del canale e aggiungere più buffer in base alle esigenze.Posizionare il campione sullo stadio del microscopio e accendere la sorgente luminosa dell'epi-illuminazione. Concentrati sullo spigolo della pellicola di paraffina per trovare la superficie del campione, quindi sposta il campo per impostare la vista al centro della camera. Osserverai più superfici mentre l'obiettivo viene spostato su e giù a causa del riflesso posteriore della luce dall'ottica all'interno del percorso ottico.Quindi, centrare il diaframma del campo nel campo visivo chiudendolo a metà strada e utilizzando le viti di regolazione. Una volta allineato correttamente il diaframma, riaprarlo. Quindi, fai scorrere l'obiettivo Bertrand per vedere il piano focale posteriore, noto anche come pupilla di uscita dell'obiettivo.Chiudere il diaframma di apertura oltre i bordi della pupilla di uscita e utilizzare le viti di regolazione per centrare il diaframma di apertura rispetto alla pupilla di uscita. Ricontrolla aprendo il diaframma di apertura e abbinando i suoi bordi a quelli della pupilla di uscita. Quindi, impostare il diaframma di apertura su circa due terzi dell'apertura numerica dell'obiettivo.Per iniziare, impostare il tempo di esposizione della fotocamera su 10 millisecondi e regolare l'illuminazione per saturare quasi l'intervallo dinamico della fotocamera. Successivamente, utilizzare una pipetta per fluire in 10 microlitri di microtubuli stabilizzati gmpcpp in BRB80 filtrato da 0,22 micrometri. Monitorare il legame del microtubulo sull'imaging della superficie.Una volta che da 10 a 20 microtubuli sono legati all'interno del campo visivo, lavare il campione due volte con il BRB80 filtrato. Acquisire 10 immagini dei microtubuli impostando un time lapse con un'esposizione di 10 millisecondi e un periodo di ritardo di un secondo per un totale di 10 secondi. Quindi, acquisisci immagini di sfondo spostando il palco utilizzando il controller di scena lungo l'asse lungo del canale acquisendo 100 immagini senza ritardi.Per immaginire la dinamica dei microtubuli usando la tubulina cerebrale, inizia impostando la temperatura del riscaldatore del campione a 37 gradi celsius. Utilizzando una pipetta, flusso in 10 microlitri di semi di microtubuli stabilizzati GMPCPP e monitorarli legandoli alla superficie imaging della superficie viva. Una volta che 10-20 semi sono legati all'interno del campo visivo, lavare il campione utilizzando il doppio del volume del canale di BRB80 preri warmed e filtrato.Successivamente, flusso in 10 microlitri del mix di polimerizzazione. Per misurare la crescita dei microtubuli, impostare un time lapse utilizzando il software di acquisizione per acquisire un'immagine ogni cinque secondi per 15 minuti. Migliora il contrasto acquisendo un'immagine media di 10 in ogni punto di tempo.Acquisire immagini di sfondo come illustrato nella sezione precedente. Calcola la mediana andando all'immagine, selezionando stack, quindi progetto Z, quindi mediana. Sottrarre lo sfondo corrispondente andando a elaborare, andando al calcolatore di immagini e scegliendo sottrai dal menu a discesa.Verificare che l'opzione del risultato float a 32 bit sia selezionata. Per il restringimento dei microtubuli, acquisire immagini a 100 fotogrammi al secondo impostando il ritardo su zero e mantenendo il tempo di esposizione a 10 millisecondi. Un fattore importante per acquisire immagini ad alto contrasto con la microscopia a induzione di interferenza è quello di impostare correttamente l'apertura numerica dell'illuminazione.Questo può essere fatto guidando la dimensione del fascio di illuminazione alla pupilla di uscita dell'obiettivo, che è controllato dalla dimensione del diaframma di apertura. Utilizzando un campione di microtubuli stabilizzati con etichetta fluorescente, mettere a fuoco i microtubuli usando la manopola di messa a fuoco del microscopio mentre li immagini fluorescentmente. Impostare l'esposizione della fotocamera a 10 millisecondi e chiudere il diaframma di apertura alla più piccola apertura.Inoltre, regolare l'illuminazione per saturare quasi l'intervallo dinamico della fotocamera o fino al massimo. Acquisisci 10 immagini trasmettendo in streaming un campo visivo contenente 10 o più microtubuli. Quindi acquisire un'immagine di sfondo.Modificare le dimensioni del diaframma e regolare l'intensità dell'illuminazione in base a quella precedentemente determinata. Acquisisci 10 nuove immagini e un nuovo sfondo. Ripetere questo processo fino al completamento dell'intero intervallo del diaframma.Per ogni campo visivo acquisito, sottrarre lo sfondo corrispondente e mediare le immagini sottratte in background risultanti come mostrato in precedenza. Quindi, calcola il rapporto medio segnale/rumore di fondo dei microtubuli per ogni dimensione di apertura. Impostare la dimensione del diaframma su quella che produce il rapporto segnale/rumore di fondo più elevato.È possibile che vi sia una gamma di dimensioni che producono un contrasto comparabile come mostrato qui. Con un microscopio ben allineato, i microtubuli dovrebbero essere visibili senza sottrazione di sfondo. Sottrarre lo sfondo, tuttavia, migliora il contrasto del microtubulo.Per migliorare ulteriormente il contrasto, è possibile utilizzare una media, un filtraggio 4a o una combinazione di entrambi. Le scansioni di linea mostrate qui descrivono il miglioramento incrementale della qualità dell'immagine. Questi descrivono una notevole riduzione del rumore di fondo ad ogni fase di elaborazione.La dinamica dei microtubuli può essere riportata nei chiografi, che vengono generati da film time lapse. Qui viene mostrata una cinegrafia di esempio acquisita a una frequenza fotogrammi di 0,2 fotogrammi al secondo. Le linee tratteggiate segnano i semi.Quando si esegue questa procedura, è importante lavorare con obiettivi ad alta apertura numerica. È anche importante allineare e impostare correttamente le dimensioni del telaio del diametro dell'apertura. È facile combinare IRM con imaging a fluorescenza per studiare, ad esempio, le proteine leganti i microtubuli e come modificano la dinamica dei microtubuli.La tecnica riduce notevolmente i danni fotografici e consente un'acquisizione più elevata della frequenza dei fotogrammi, rendendo più facile lo studio di biopolimeri etichettati come i microtubuli per lunghi periodi di tempo con alta risoluzione temporale e una buona precisione di tracciamento.

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