Name: implementation of interference reflection microscopy for label-free, high-speed imaging of microtubules
Uploaded: 2019-08-08T11:30:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Implementation of Interference Reflection Microscopy for Label-free, High-speed Imaging of Microtubules at JoVE.com

Forfatterne takker Anna Luchniak og Yin-Wei Kuo for kritisk lesing og kommentarer på protokollen.

1. endring av mikroskop og objektiv objektiv
<ol><li>Sett inn et 50/50 speil i filter hjulet på det fluorescerende mikroskopet ved hjelp av en passende filter kube (figur 1). Håndter 50/50 speilet med forsiktighet så ofte de har anti-refleksjon belegg. Merk: vi brukte et 50/50 speil i en tom filter kube av mikroskopet. Det 50/50 speil er satt inn der dichroic speilet er plassert.</li>
	<li>Bruk en høy forstørrelse/høy NA olje mål. Merk: i denne protokollen brukte vi et mål på 100 a/1.3 NA.</li>
</ol>2. kammer forberedelse til å overholde mikrotubuli til overflaten
<ol><li>Rengjør mikroskop glass og 22 mm x 22 mm coverslips (for stående mikroskop) eller 22 mm x 22 mm og 18 mm x 18 mm coverslips (for invertert mikroskop). Endre overflaten etter behov. For eksempel, rengjør coverslips ved hjelp av et alkalisk vaskemiddel (se tabell over materialer) etterfulgt av 100% etanol med destillert vann vasker i mellom og etter11.</li>
	<li>Skjær 3 mm brede strimler av plast para fin film (se tabell over materialer) ved hjelp av et barberblad og et annet mikroskop lysbilde som en kant.</li>
	<li>Plasser to plastikk parafin film strimler 3 mm fra hverandre på en ren 22 x 22mm deksel slip. Deretter plasseres en 18 mm x 18 mm dekkglass for å danne en kanal. Hvis du bruker et stående mikroskop, plasserer du stripene oppå et rent mikroskop og plasserer en dekkglass oppå.</li>
	<li>Plasser dekkglass (eller skyve) på en varme blokk ved 100 ° c for 10-30 s for para fin filmen for å danne en forseglet kanal.</li>
	<li>Strømning i 50 μg/mL av antistoff (i Brinkley buffer 1980 (BRB80)) ved å bruke en pipette. Ruge i 10 min. Merk: vi bruker anti-rhodamine antistoffer for å binde rhodamine-merket mikrotubulinettverket frø til overflaten. Alternativt kan avidin brukes til å binde biotin-merkede mikrotubulinettverket frø eller til biotinylated gull partikler. For å bare se på mikrotubuli i fravær av tubulin i løsningen (dvs. en ikke-dynamisk analysen), kan et anti-tubulin antistoff brukes.</li>
	<li>Vask fem ganger med BRB80 buffer. Det anbefales å filtrere løsningene ved hjelp av et filter på 0,22 μm.</li>
	<li>Flow i 1% poloksamer 407 (en triblock kopolymer) i BRB80 å blokkere overflaten mot ikke-spesifikk binding. Ruge i 10 min.</li>
	<li>Vask fem ganger med BRB80 buffer.</li>
	<li>Prøven er klar til å plasseres på mikroskopet. For å hindre at prøven tørker ut, Legg to dråper BRB80 buffer på endene av kanalen og etterfylle ved behov.</li>
</ol>3. justering av mikroskop
<ol><li>Plasser prøven på scenen på mikroskopet. Slå på Epi-belysning lyskilde.</li>
	<li>Fokuser på prøveoverflaten. Du vil observere flere overflater som målet er flyttet opp og ned på grunn av tilbake refleksjon av lys fra optikk innenfor den optiske banen. En god metode for å finne prøven overflaten er å fokusere på parafin film kanten. Når overflaten er funnet, setter synsfeltet til sentrum av kammeret.</li>
	<li>Midtstill felt membranen i synsfeltet ved å lukke den halvveis og bruke justeringsskruene. Når den er justert, åpner du membranen på nytt. Merk: skrue justeringen må bare gjøres sporadisk, kanskje hver 3-6 måneder eller når feilsøking.</li>
	<li>Skyv inn Bertrand-objektivet for å vise utgangs eleven (det bakre fokalplanet) for målet.</li>
	<li>Lukk blenderåpning membranen (AD) utover kantene på exit elev av målet.</li>
	<li>Bruk justeringsskruene til å sentrere ANNONSEN med avslutnings Eleven. Dobbeltsjekk ved å åpne AD og matche kantene med de av exit elev. Merk: denne justeringen må bare gjøres sporadisk.</li>
	<li>Sett blenderåpningen membranen til ca 2/3 av NA av målet. Se avsnitt 7 for detaljerte fremgangsmåter for å optimalisere blenderåpningen.</li>
</ol>4. Imaging stabilisert mikrotubuli eller 40 nm gull partikkel
Merk: stabilisert mikrotubuli og gull nanopartikler fungerer som gode kontroll prøver. Det anbefales å bilde overflaten festet mikrotubuli eller gull nanopartikler som et første skritt for å vurdere IRM ytelse og hjelp til å sette den optimale blenderåpning membran åpning (§ 7).
<ol><li>Still eksponeringstid på kameraet til 10 MS og justere belysningen til nesten mette kameraets dynamiske rekkevidde.</li>
	<li>Flow i 10 μL av guanylyl-(Alpha, beta)-metylen-diphosphonate (GMPCCP)-eller taxol-stabilisert mikrotubuli i BRB804,12,13 (eller 40 nm gull partikler) ved å bruke en pipette til en frisk prøve og overvåke bindende ved å avbilde overflaten. Når 10-20 mikrotubuli er bundet innen synsfeltet, vask prøven 2x med BRB80. Merk: med et godt justert mikroskop bør mikrotubuli være synlig uten bakgrunns subtraksjon.</li>
	<li>Erverve 10 profilen av innfatning en tid lapse med 1 andre forsinkelsen periode for 10 sekunder (for 10 MULTIPLE SCLEROSIS avsøring).</li>
	<li>Skaff deg et bakgrunnsbilde. For å gjøre dette, flytte scenen ved hjelp av scenen kontrolleren eller dataprogrammer langs kanalen lange aksen mens anskaffe 100 bilder uten forsinkelse (dvs. streaming nær 100 fps @ 10 MS eksponering). Merk: bakgrunnen er medianen i 100-bildene. Ved å ta medianen bevares belysnings profilen og andre stasjonære funksjoner som smuss på optikk, mens alt annet filtreres ut. Det bør ikke være noen vippe på prøven da dette vil føre til endring i aksial posisjon som scenen er flyttet og til slutt forringe bakgrunnsbildet. Hvis Tilt ikke kan unngås, så en alternativ metode er å erverve gjennomsnitt bakgrunnsbilder før flyter frøene.</li>
	<li>Gå til trinn 6 for å behandle og analysere bildene.</li>
</ol>5. Imaging mikrotubulinettverket dynamikk
<ol><li>For mikrotubulinettverket dynamikk ved hjelp av hjerne tubulin, Still prøve varme temperaturen til 37 ° c.</li>
	<li>Flow i 10 μL av GMPCCP-stabilisert mikrotubulinettverket frø i BRB8011 ved å bruke en pipette til en frisk prøve og overvåke dem binding til overflaten ved å avbilde overflaten Live (dvs. mens streaming). Når 10-20 frø er bundet med synsfelt, vask prøven med 2x kanal volum med BRB80 (BRB80 skal prewarmed til 37 ° c eller i det minste ved romtemperatur). Merk: med et godt justert mikroskop bør frøene være synlige uten bakgrunns subtraksjon.</li>
	<li>Flow i polymerisering mix (7,5 μM umerkede tubulin + 1 mM guanosin trifosfat (GTP) + 1 mM Dithiotreitol (DTT) i BRB80 buffer). For å måle mikrotubulinettverket vekst, angi en tidsforløp ved hjelp av oppkjøpet programvare for å få et bilde hvert 5 sekunder (0,2 bilder per sekund (FPS)) i 15 minutter.</li>
	<li>Å forsterke kontrasten, erverve 10 profilen (istedet for ettall) for hver tid punkt og middel seg. For mikrotubulinettverket krymping, få bilder på 100 fps ved å sette tidsforsinkelsen til 0 og en eksponeringstid på 10ms (høyere FPS er mulig med mindre områder av interesse avhengig av kameraet som brukes).</li>
	<li>Skaff deg et bakgrunnsbilde som i trinn 4,4.</li>
</ol>6. bildebehandling og analyse
Merk: for analyse, bruker denne protokollen Fiji14 , men leseren er gratis å bruke programvare hun/han finner egnet.
<ol><li>Åpne lagrede bakgrunnsbilder.</li>
	<li>Beregn median bildet (dvs. bakgrunn) ved hjelp av bilde &Gt; stable &Gt; Z-prosjekt &Gt; median.</li>
	<li>Åpne mikrotubulinettverket Dynamics-film som en stabel (samme for ikke-dynamisk mikrotubuli) ved hjelp av fil &Gt; åpne.</li>
	<li>Trekk bakgrunnsbildet fra stabelen ved hjelp av prosess &Gt; bilde kalkulator. Sørg for å sjekke "32Bit (float) resultat" alternativet.</li>
	<li>For dynamiske mikrotubuli kan du bruke linjeverktøyet til å tegne en linje langs mikrotubulinettverket og legge den til i regionen av interesse lederen ved å trykke på "t". Gjenta for alle mikrotubuli av interesse.</li>
	<li>For dynamiske mikrotubuli kan du kjøre multi-Kymo-makroen (tilleggsfil 1). Makroen vil generere en video og en kymograph for hver mikrotubulinettverket i ROI Manager. Hver mikrotubulinettverket vil få en unik identifikator.</li>
	<li>For dynamiske mikrotubuli kan du kjøre Kymo-analyse-makroen (tilleggsfil 2) og følge fremgangsmåten for å måle vekstrater og svinn rater for mikrotubuli.</li>
</ol>7. blender membran størrelse
Merk: en viktig faktor for å oppnå høy kontrast bilder av mikrotubuli ved hjelp av IRM er å sette belysning numerisk blenderåpning (Ina) riktig10,15. Den Ina kan endres ved å endre størrelsen på innkommende lysstrålen på målet er exit elev som styres av størrelsen på AD (ad er plassert på et bøy plan med exit elev (tilbake fokalplanet) av målet , Figur 1): <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59520/59520eq1.jpg"> der DAd er diameteren på blenderåpning membranen, fmålet er brennvidde på målet og DEP er målet er exit elev diameter. Vanligvis er AD venstre helt åpen for fluorescens Imaging, så Ina lik målet ' s na. I et fluorescens mikroskop, indikerer AD skalaen ikke sin diameter, dermed Ina kan ikke beregnes. Det er mulig å kalibrere AD størrelse ved hjelp av en objektiv. Likevel, det er ikke nødvendig siden annonsestørrelsen ville være fast til den størrelsen som gir den høyeste kontrasten.
<ol><li>Forbered en prøve av fluorescensmerkete merket stabilisert mikrotubuli fast til overflaten (trinn 4.1-4.2). Merk: vi brukte tetramethylrhodamine merket mikrotubuli16 (Ex: 550 NM, Em: 580 NM).</li>
	<li>Bring mikrotubuli i fokus ved hjelp av mikroskopet med fokuserings knotten mens fluorescensmerkete Imaging dem (hvis mikrotubuli ikke er merket, bilde dem med IRM15 eller dic5).</li>
	<li>Angi kamera eksponering til 10 MS ved hjelp av kameraprogramvaren. Merk: denne eksponeringen er vilkårlig og en eksponering av 100 MS vil også fungere.</li>
	<li>Lukk AD til minste åpning. Juster belysningen til å nesten mette kameraets dynamiske område eller til det maksimale mulige. Merk: som en guide, bruker du slå opp tabellen vanligvis gitt av oppkjøpet programvare.</li>
	<li>Skaff deg 10 bilder (ved å strømme eller ta et bilde hvert sekund) av et synsfelt som inneholder 10 + mikrotubuli.</li>
	<li>Skaff deg et bakgrunnsbilde som i trinn 4,4.</li>
	<li>Endre størrelsen på AD og gjenta trinn 7.5-7.6 for hele annonse åpnings området (fra lukket til exit eleven størrelse, figur 2). Hver gang annonsestørrelsen endres, justerer du lysstyrken slik at den samsvarer med trinn 7,4.</li>
	<li>For hvert felt av visningen ervervet, subtrahere den tilsvarende bakgrunn ved hjelp av prosess > bilde kalkulator og velge "subtrahere" fra rullegardinmenyen. Kontroller at "32Bit (float) resultat" alternativet er sjekket. Deretter gjennomsnittlig de resulterende bildene ved hjelp av bilde > stable &Gt; Z prosjekt > gjennomsnitt.</li>
	<li>Mål signal-til-bakgrunn støy ratio (SBR) av mikrotubuli definert som den gjennomsnittlige intensiteten av mikrotubulinettverket signal (intensiteten av mikrotubulinettverket minus intensiteten av bakgrunnen) dividert med standardavviket i bakgrunnen ( Figur 3).</li>
	<li>Bestem den optimale AD størrelse (dvs. optimal Ina) ved å beregne gjennomsnittlig SBR av mikrotubuli for hver åpning størrelse og sett ad størrelse til den som produserer den høyeste SBR (figur 2). Det er mulig at det er en rekke AD størrelser som produserer sammenlignbare kontrast15.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Widlund, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+purification+of+assembly-competent+tubulin+from+diverse+eukaryotic+sources.">One-step purification of assembly-competent tubulin from diverse eukaryotic sources.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (22), 4393-4401 (2012).</li><li>Walker, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+individual+microtubules+analyzed+by+video+light+microscopy:+rate+constants+and+transition+frequencies.">Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies.</a> The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1437-1448 (1988).</li><li>Hotani, H., Horio, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+microtubules+visualized+by+darkfield+microscopy:+Treadmilling+and+dynamic+instability.">Dynamics of microtubules visualized by darkfield microscopy: Treadmilling and dynamic instability.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 10 (1-2), 229-236 (1988).</li><li>Gittes, F., Mickey, B., Nettleton, J., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexural+rigidity+of+microtubules+and+actin+filaments+measured+from+thermal+fluctuations+in+shape.">Flexural rigidity of microtubules and actin filaments measured from thermal fluctuations in shape.</a> The Journal of Cell Biology. 120 (4), 923-934 (1993).</li><li>Bormuth, V., Howard, J., Sch&#228;ffer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LED+illumination+for+video-enhanced+DIC+imaging+of+single+microtubules.">LED illumination for video-enhanced DIC imaging of single microtubules.</a> J Microsc. 226 (Pt 1), 1-5 (2007).</li><li>Andrecka, J., Ortega Arroyo, J., Lewis, K., Cross, R. A., Kukura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+Imaging+of+Microtubules+with+Sub-nm+Precision+Using+Interferometric+Scattering+Microscopy.">Label-free Imaging of Microtubules with Sub-nm Precision Using Interferometric Scattering Microscopy.</a> Biophysical Journal. 110 (1), 214-217 (2016).</li><li>Koch, M. D., Rohrbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+Imaging+and+Bending+Analysis+of+Microtubules+by+ROCS+Microscopy+and+Optical+Trapping.">Label-free Imaging and Bending Analysis of Microtubules by ROCS Microscopy and Optical Trapping.</a> Biophysical Journal. 114 (1), 168-177 (2018).</li><li>Kandel, M. E., Teng, K. W., Selvin, P. R., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-Free+Imaging+of+Single+Microtubule+Dynamics+Using+Spatial+Light+Interference+Microscopy.">Label-Free Imaging of Single Microtubule Dynamics Using Spatial Light Interference Microscopy.</a> ACS Nano. 11 (1), 647-655 (2017).</li><li>Curtis, A. S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mechanism+of+Adhesion+of+Cells+to+Glass.">The Mechanism of Adhesion of Cells to Glass.</a> The Journal of Cell Biology. 20 (2), 199-215 (1964).</li><li>Weber, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[2]+Reflection+interference+contrast+microscopy.">[2] Reflection interference contrast microscopy.</a> Methods in Enzymology. 361, 34-47 (2003).</li><li>Gell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+13+-+Microtubule+Dynamics+Reconstituted+In+Vitro+and+Imaged+by+Single-Molecule+Fluorescence+Microscopy.">Chapter 13 - Microtubule Dynamics Reconstituted In Vitro and Imaged by Single-Molecule Fluorescence Microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 95, 221-245 (2010).</li><li>Nitzsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+14+-+Studying+Kinesin+Motors+by+Optical+3D-Nanometry+in+Gliding+Motility+Assays.">Chapter 14 - Studying Kinesin Motors by Optical 3D-Nanometry in Gliding Motility Assays.</a> Methods in Cell Biology. 95, 247-271 (2010).</li><li>Schiff, P. B., Fant, J., Horwitz, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+microtubule+assembly+in+vitro+by+taxol.">Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol.</a> Nature. 277 (5698), 665-667 (1979).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Mahamdeh, M., Simmert, S., Luchniak, A., Sch&#228;ffer, E., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+high-speed+wide-field+imaging+of+single+microtubules+using+interference+reflection+microscopy.">Label-free high-speed wide-field imaging of single microtubules using interference reflection microscopy.</a> Journal of Microscopy. 272 (1), 60-66 (2018).</li><li>Hyman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[39]+Preparation+of+modified+tubulins.">[39] Preparation of modified tubulins.</a> Methods in Enzymology. 196, 478-485 (1991).</li><li>Ruhnow, F., Zwicker, D., Diez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+Single+Particles+and+Elongated+Filaments+with+Nanometer+Precision.">Tracking Single Particles and Elongated Filaments with Nanometer Precision.</a> Biophysical Journal. 100 (11), 2820-2828 (2011).</li><li>Mahamdeh, M., Sch&#228;ffer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+tweezers+with+millikelvin+precision+of+temperature-controlled+objectives+and+base-pair+resolution.">Optical tweezers with millikelvin precision of temperature-controlled objectives and base-pair resolution.</a> Optics Express. 17 (19), 17190-17199 (2009).</li><li>Kim, K., Saleh, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilizing+method+for+reflection+interference+contrast+microscopy.">Stabilizing method for reflection interference contrast microscopy.</a> Applied Optics. 47 (12), 2070-2075 (2008).</li><li>Ortega Arroyo, J., Cole, D., Kukura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferometric+scattering+microscopy+and+its+combination+with+single-molecule+fluorescence+imaging.">Interferometric scattering microscopy and its combination with single-molecule fluorescence imaging.</a> Nature Protocols. 11 (4), 617-633 (2016).</li><li>Carter, A. R., King, G. M., Ulrich, T. A., Halsey, W., Alchenberger, D., Perkins, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+an+optical+microscope+to+0.1+nm+in+three+dimensions.">Stabilization of an optical microscope to 0.1 nm in three dimensions.</a> Appl Opt. 46 (3), 421-427 (2007).</li><li>Limozin, L., Sengupta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Reflection+Interference+Contrast+Microscopy+(RICM)+in+Soft+Matter+and+Cell+Adhesion.">Quantitative Reflection Interference Contrast Microscopy (RICM) in Soft Matter and Cell Adhesion.</a> ChemPhysChem. 10 (16), 2752-2768 (2009).</li></ol>

Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.

Denne protokollen viste vellykket bruk av IRM for avbildning og måling av mikrotubulinettverket dynamikk. Forsiktighet bør gis til riktig sette belysning numerisk blenderåpning som den har den sterkeste innvirkning på bildet kontrast. Også ved hjelp av høy numerisk blenderåpning (NA) mål er viktig for å få høy oppløsning/høy kontrast bilder, som høyere NA objektiv har høyere lys samle makt i forhold til lav NA mål. Renere overflaten og løsninger som brukes lavere støy som smuss ender opp feste til overflaten og legge til (i løpet av eksperimentet) speckle som støy til bildene. Oppkjøp av et bakgrunnsbilde er viktig, så vel som det fjerner belysning inhomogeneities, statisk støy og overflate uregelmessigheter.
En anbefalt modifikasjon er å innføre et langt pass filter (> 600 NM) i belysnings banen. Spekteret av hvite lyskilder inneholder vanligvis bølgelengder i UV som kan skade mikrotubuli. I tillegg er bruk av Langbølge lengde for IRM nyttig når du kombinerer IRM med fluorescens (f.eks. Når du studerer effekten av mikrotubulinettverket tilknyttede proteiner (kart) på mikrotubulinettverket dynamikk). Vær oppmerksom på at når Imaging for brukt tid, sample drift (spesielt langs den optiske aksen) reduserer bildekontrasten på grunn av avviket i bildet planet fra bakgrunnen planet. Moderne mikroskop er ofte utstyrt med stabiliserings mekanismer (f.eks. perfekt fokus (Nikon), bestemt fokus. 2 (Zeiss), IX3-ZDC2 (Olympus)). En alternativ løsning er å termisk stabilisere oppsettet enten passivt eller aktivt18 eller ved å korrigere for drift19,20,21. Til slutt kan mikrotubulinettverket kontrast økes ved å redusere størrelsen på feltet membran (en 70% åpning er godt valg som det er en balanse mellom økende kontrast og synsfelt størrelse)15.
Selv om IRM er egnet for bilde mikrotubuli, er det ikke følsomt nok til å oppdage enkelt proteiner. For slik anvendelse, er iSCAT en mer egnet teknikk. På samme måte er fluorescens og iSCAT bedre egnet hvis det er behov for å spore presisjon på mindre enn 10 NM. For IRM er den målte lengden på sporings presisjonen ~ 20 NM som vist i figur 7.
Bruk av IRM i overflate analyser kan gå utover mikrotubuli; for eksempel kan molekylære motorer merkes med gull nanopartikler og spores når de samhandler med mikrotubuli. I tillegg en mer avansert form for IRM kjent som reflekterende interferens kontrast mikroskopi (RICM)22 kan i prinsippet brukes til å ytterligere forsterke mikrotubuli kontrast og oppnå høyere sporing presisjon.

Label-fri avbildning av mikrotubuli er av interesse som det omgår behovet for fluorescerende merking av tubulin å generere kontrast i bildene. Fluorescerende merking har flere ulemper: det er ikke gjennomførbart hvis protein konsentrasjonen er lav1 og photobleaching og photoskade begrense observasjons tiden. Flere teknikker har blitt brukt til bilde Label-fri mikrotubuli, inkludert video-forbedret differensial forstyrrelser kontrast mikroskopi (dic) og darkfield mikroskopi2,3,4,5. Nylig, henvise spredning mikroskopi (iSCAT)6, roterende-sammenhengende-spredning MIKROSKOPI (ROCS)7 og romlig lys interferens mikroskopi (Slim)8, har også blitt brukt. Alle disse teknikkene er i stand til Imaging mikrotubuli og har vist seg å være verdifullt for å studere mikrotubulinettverket dynamikk. Men hver har sine egne begrensninger. I DIC kontrasten avhenger av vinkelen mellom mikrotubulinettverket og Nomarski prisme aksen.  I darkfield er det mikrotubulinettverket signalet degradert av spredt lys fra urenheter eller overflater defekter. Selv iSCAT utstillinger ekstraordinære følsomhet (ned til enkelt proteiner) og ROCS kan bildet mikrotubuli dypere inn i prøven, begge metodene er teknisk krevende, krever laser skannere.
Denne protokollen demonstrerer hvordan interferens refleksjon mikroskopi (IRM)9,10 kan settes opp som en alternativ teknikk for Label-fri avbildning av mikrotubuli. IRM er enkelt å implementere ettersom det bare krever et billig 50/50 speil til et standard fluorescerende mikroskop. Når den brukes sammen med programvaren som er beskrevet her, produserer IRM høy kontrast mikrotubulinettverket bilder, kan bildet store visningsfelt ved høy hastighet, krever en en gangs justering, og kan enkelt kombineres med andre teknikker som fluorescens Imaging.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti-Eclipse</td>
			<td>An inverted microscope used for perfoming the expriments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50/50 beam splitter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>21000</td>
			<td>When buying make sure to choose the splitter dimensions that fit the cube used in the microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIKON PLAN FLUOR 100X/0.5-1.3 Iris objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRH02902</td>
			<td>Imaging objective. This objective has a NA adjusting iris that was opened to NA 1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mucasol universal detergent</td>
			<td>Sigma-aAldrich</td>
			<td>Z637181-2L</td>
			<td>Used for cleaning coverslips and slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic paraffin film (commerical name Parafilm M)</td>
			<td>Sigma-aAldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td>Used for constructing flow channels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TAMRA antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-6397</td>
			<td>Used to bind TAMRA labeled molecules (e.g. microtubules) to the sample surface. RRID (AB_2536196)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poloxamer 407 (commercial name Pluronic F-127)</td>
			<td>Sigma-aAldrich</td>
			<td></td>
			<td>Used for blocking the channel surface to prevent nonspecific binding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 nm gold nanoparticles</td>
			<td>Sigma-aAldrich</td>
			<td>753637</td>
			<td>Used as a control sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 nm gold nanoparticles</td>
			<td>Sigma-aAldrich</td>
			<td>753610</td>
			<td>Used as a control sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zyla 4.2 Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Zyla 4.2</td>
			<td>2048x2048 pixles (6.5&#181;m pixel size) with quantum efficiency of 72% and 16bit dynamic range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feista tracking software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://www.bcube-dresden.de/fiesta/wiki/FIESTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stabilized microtubles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>prepared in house (see references in text)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implementation of interference reflection microscopy for label-free, high-speed imaging of microtubules

Det finnes flere metoder for å visualisere renset biomolekyler nær overflater. Total-intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi er en vanlig metode, men har den ulempen at det krever fluorescerende merking, noe som kan forstyrre aktiviteten av molekylene. Også, photobleaching og photoskade er bekymringer. I tilfelle av mikrotubuli, har vi funnet at bilder av lignende kvalitet til TIRF kan fås ved hjelp av interferens refleksjon mikroskopi (IRM). Dette tyder på at IRM kan være en generell teknikk for å visualisere dynamikken i store biomolekyler og oligomers in vitro. I dette dokumentet viser vi hvordan et fluorescens mikroskop kan endres bare for å få IRM-bilder. IRM er enklere og betydelig billigere å implementere enn andre kontrast teknikker som differensial forstyrrelser kontrast microcopy eller henvise spredning mikroskopi. Det er også mindre utsatt for overflate defekter og løsnings urenheter enn darkfield mikroskopi. Ved hjelp av IRM, sammen med bildeanalyse programvaren som er beskrevet i dette dokumentet, er synsfeltet og bildefrekvensen bare begrenset av kameraet. med et sCMOS-kamera og bred felts belysning mikrotubulinettverket lengde kan måles med presisjon opp til 20 NM med en båndbredde på 10 Hz.

Som nevnt ovenfor, med et godt justert mikroskop, bør mikrotubuli være synlig uten bakgrunn subtraksjon (figur 4a). Hvis du trekker fra bakgrunnen (figur 4b), forbedres kontrasten i Mikrotubulinettverket (figur 4c). For ytterligere å forbedre kontrasten, snitt eller Fourier-filtrering eller en kombinasjon av begge kan brukes (figur 4d, F, E). Linjen skanner i figur 4G viser trinnvis forbedring av bildekvalitet. Legg merke til reduksjonen av bakgrunnsstøy med hvert behandlingstrinn.
Eksempler på kymographs av mikrotubulinettverket dynamikk generert fra tidsforløp filmer vises i figur 5. Videoene ble kjøpt på to bildefrekvenser: 0,2 fps (sakte) og 100 fps (rask). Den førstnevnte er egnet for å måle vekstrater, mens sistnevnte er mer egnet for å måle krymping hastighet som er en størrelsesorden raskere enn vekstraten.
For tilfeller der gull nanopartikler brukes til å sette opp mikroskopet, vises et eksempel bilde i figur 6. Gull nanopartikler ble passivt festet til overflaten. Mens 40 nm partikler anbefales, er det også mulig å avbilde 20 NM partikler, men på en lavere kontrast.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59520/59520fig1.jpg"> Figur 1. Skjematisk representasjon av IRM. (A) Epi-belysning fra lyskilden passerer gjennom blenderåpningen membranen før den når 50/50 speilet. Blenderåpningen membran setter strålen bredde dermed belysning NA. 50/50 speilet reflekterer delvis lyset opp til målsettingen for å belyse prøven. Lys reflekteres fra prøven er samlet og deretter projisert på kamera brikken (av røret linsen) der det forstyrrer å generere bildet. Bilde kontrast er et resultat av forstyrrelsen mellom lyset som reflekteres fra glass/vann-grensesnittet (i1) og lyset som reflekteres fra vann/mikrotubulinettverket-grensesnittet (I2). Avhengig av mikrotubulinettverket/overflate avstanden (h), vil den optiske bane forskjellen mellom i1 og i2 resultere i et konstruktivt (skarpt signal) eller ødeleggende (mørkt signal) eller noe i mellom. For eksempel, hvis lys med en bølgelengde på 600 NM brukes til bildebehandling, vil kontrasten veksle mellom mørke og lyse når mikrotubulinettverket høyde endres med ca 100 NM. Stjernen angir bøy plan (endret fra15). (B) eksempel på installasjon av 50/50-speilet. En passende filter kube ble åpnet og speilet ble satt inn der et dichroic speil vanligvis sitter. Speilet var orientert som per produsent instruksjoner. Deretter ble kuben satt inn i filter hjulet som ble satt tilbake til mikroskopet (ikke vist). Under installasjonen ble hansker brukt, og speilet ble bare holdt av kantene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/59520fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59520/59520fig2.jpg"> Figur 2. Optimal blenderåpning. (A) samme synsfelt ble avbildet ved forskjellige blenderåpninger uten bakgrunn subtraksjon. Visuelt, kontrasten økt som størrelsen på blenderåpningen membranen økt til den nådde et platå og begynte å brytes ned etterpå. Dette ble bekreftet av (B) SBR målinger av bakgrunnen trekkes bilder. Feilfelt er standardavvik.  Vektstenger er 500 μm (AD) og 3 μm (mikrotubuli). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/59520fig2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59520/59520fig3.jpg"> Figur 3. Måle signal-til-bakgrunn støyforhold. Mikrotubuli ble isolert i områder av interesse. Hver region av interesse var thresholded å skille mikrotubulinettverket fra bakgrunnen. Den gjennomsnittlige mikrotubulinettverket signalet ble innhentet fra en linjeskanning over mikrotubulinettverket. Bredden på skanne linjen ble satt til lik mikrotubulinettverket lengde. På denne måten er hvert punkt på skanningen et gjennomsnitt av signalene fra alle bildepunkter langs mikrotubulinettverket akse som er parallelt med dette punktet. Bakgrunnsstøyen er standardavviket for alle pikslene under terskelen avskåret.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/59520fig3large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59520/59520fig4.jpg"> Figur 4. Bildebehandling. Etter å ha innhentet RAW-bilder (A), ble bakgrunnen (B) trukket (C) for å forsterke mikrotubulinettverket kontrast. For ytterligere å forbedre kontrasten bildene var enten gjennomsnitt (D) eller Fourier-filtrert (E) eller begge (F). Linjen skanner (G), hvis plassering er angitt med den stiplede røde linjen i (a) er farge matchet til de ulike bildene i (a) til (F). Tallene i det nedre hjørnet er gjennomsnittlig SBRs målt for hele synsfeltet. Skalaen stang er 5 μm (modifisert fra15). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/59520fig4large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59520/59520fig5.jpg"> Figur 5. Eksempler på kymographs. (A) Kymograph eksempler på mikrotubulinettverket dynamikk generert fra tid-lapse filmer ervervet på 0,2 fps. (B) Kymograph skildrer et eksempel på en krymping hendelse generert fra en film ervervet på 100 fps. Stiplede linjer markerer frøene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/59520fig5large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59520/59520fig6.jpg"> Figur 6. Eksempel på gull nanopartikler avbildet med IRM. Gull nanopartikler av størrelser 20 og 40 nm ble passivt festet til overflaten. 10 bilder ble anskaffet. Etter at bakgrunnen ble subtraksjon, var bildene i gjennomsnitt å forbedre kontrasten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/59520fig6large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59520/59520fig7.jpg"> Figur 7. Mikrotubulinettverket lengde sporings presisjon i IRM-bilder. Stabilisert mikrotubuli (dvs. faste lengder) ble avbildet 200x på 100 fps deretter gjennomsnitt til 10 fps for å forbedre kontrasten. Neste, mikrotubuli ' lengder ble målt ved hjelp av Fiesta17 sporing programvare. For hver mikrotubulinettverket gjennomsnittlig lengde og standardavvik ble beregnet som vist i figuren (stiplet linje representerer gjennomsnittet og faste røde linjer representerer standardavviket, lengde = 3971 ± 20 NM. Den totale sporings presisjonen var gjennomsnittet av standardavviket for alle sporede mikrotubuli (n = 6 mikrotubuli x 20 datapunkter = 120 datapunkter). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/59520fig7large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
Tilleggsfil 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/Multi_Kymo.ijm" target="_blank">Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.</a> 
Tilleggsfil 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/Kymo_Analysis.ijm" target="_blank">Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Implementation of Interference Reflection Microscopy for Label-free, High-speed Imaging of Microtubules at JoVE.com

Implementation of Interference Reflection Microscopy for Label-free, High-speed Imaging of Microtubules

Denne protokollen er en guide for å implementere interferens refleksjon mikroskopi på et standard fluorescens mikroskop for etikett-fri, høy kontrast, høyhastighets avbildning av mikrotubuli bruker in vitro overflater analyser.

Gjennomføring av interferens refleksjon mikroskopi for Label-fri, High-Speed Imaging av Mikrotubuli

There are several methods for visualizing purified biomolecules near surfaces. Total-internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a commonly used ...

Betydningen av denne protokollen er at den introduserer en etikettfri bildeteknikk som er i stand til å anskaffe bilder med høy kontrast ved høye bildefrekvenser som er enklere og billigere enn andre teknikker som DIC og mørkt felt. Den største fordelen med denne teknikken er at den er enkel å implementere, og den er enkel å bruke. Det er billig, og det kan kombineres med fluorescensmikroskoper enkelt.Metoden ble utviklet for å visualisere individuelle mikrotubuli. Den har potensial til å bli brukt til å visualisere store proteinkomplekser og nanopartikler. Hovedproblemet er aktiveringsenergien som kreves for å tinker med filterkuben for å legge til halvsølvspeilet.Mitt råd til noen som prøver teknikken for første gang er bare å gjøre det. For å begynne, sett et 50/50 speil inn i filterhjulet på et fluorescerende mikroskop ved hjelp av en passende filterkube. Håndter speilet med forsiktighet så ofte de har en antireflekskoding.Slå til et høyt forstørrelsesmål som også har en høy numerisk blenderåpning. Den som vises her er et 100x oljemål med en numerisk blenderåpning på 1,3. Deretter bruker du et barberblad og et mikroskop lysbilde som en rett kant for å kutte tre millimeter brede strimler av plast parafin film.Plasser to av plast parafin film strimler tre millimeter fra hverandre på en ren 22 av 22 millimeter cover slip, og deretter plassere en 18 med 18 millimeter cover slip på toppen av strimler for å danne en kanal. Overfør dekselet slip til en varmeblokk på 100 grader celsius i 10 til 30 sekunder for parafin filmen å danne en forseglet kanal. Bruk en pipette, flyt i 50 mikrogram per milliliter av et anti-rhodamin antistoff ved perfusjon og inkuber lysbildet i 10 minutter.Etter inkubasjon vasker du kanalen fem ganger ved hjelp av filtrert BRB80, og deretter flyter du inn 1% Poloxamer 407 i den filtrerte BRB80 for å blokkere overflaten mot ikke-spesifikk binding og inkubere lysbildet i 10 minutter. Igjen, vask kanalen fem ganger ved hjelp av filtrert BRB80. Hvis du vil hindre at prøven tørker ut, legger du til to dråper av den filtrerte BRB80 i endene av kanalen og legger til mer buffer etter behov.Plasser prøven på mikroskopstadiet og slå på lyskilden for epilyse. Fokuser på parafinfilmkanten for å finne prøveoverflaten, og flytt deretter feltet for å sette visningen til midten av kammeret. Du vil observere flere overflater som målet flyttes opp og ned på grunn av tilbake refleksjon av lys fra optikk i den optiske banen.Deretter sentrerer du feltmembranen i synsfeltet ved å lukke den halvveis og bruke justeringsskruene. Når membranen er riktig justert, åpner du den på igjen. Deretter skyver du inn Bertrand-linsen for å vise det tilbakekale flyet, også kjent som utgangseleven av målet.Lukk blenderåpningsmembranen utover kantene på utgangseleven og bruk justeringsskruene til å sentrere blendermæren med hensyn til utgangseleven. Dobbeltsjekk ved å åpne blenderåpningsmembranen og matche kantene med utgangselevens. Deretter setter du blenderåpningsmembranen til omtrent to tredjedeler av det numeriske blenderåpningen av målet.Til å begynne med setter du kameraets eksponeringstid til 10 millisekunder og justerer belysningen slik at den nesten metter kameraets dynamiske rekkevidde. Deretter bruker du en pipette til å strømme i 10 mikroliter gmpcpp-stabiliserte mikrotubuli i 0,22 mikrometer filtrert BRB80. Overvåk mikrotubulibindingen på avbildningen av overflaten.Når 10 til 20 mikrotubuli er bundet innenfor synsfeltet, vask prøven to ganger med den filtrerte BRB80. Få 10 bilder av mikrotubuli ved å sette opp en tidsforløp med en 10 millisekundeksponering og en forsinkelsesperiode på ett sekund i totalt 10 sekunder. Deretter kan du skaffe bakgrunnsbilder ved å flytte scenen ved hjelp av scenekontrolleren langs kanalens lange akse mens du anskaffer 100 bilder uten forsinkelse.For å bilde mikrotubuli dynamikk ved hjelp av hjernen tubulin, start med å sette prøvevarmertemperaturen til 37 grader celsius. Bruk en pipette til å strømme inn 10 mikroliter av GMPCPP-stabiliserte mikrotubulifrø og overvåke dem som binder seg til overflaten ved å avbilde overflaten live. Når 10 til 20 frø er bundet innenfor synsfeltet, vask prøven med dobbelt så mye kanalvolum for forhåndsoppvarmet og filtrert BRB80.Deretter strømmer du i 10 mikroliter av polymeriseringsblandingen. For å måle mikrotubulivekst, sett opp en tidsforløp ved hjelp av oppkjøpsprogramvaren for å skaffe et bilde hvert femte sekund i 15 minutter. Forbedre kontrasten ved å anskaffe et gjennomsnittlig bilde på 10 på hvert tidspunkt.Hent bakgrunnsbilder som vist i forrige del. Beregn medianen ved å gå til bilde, velge stabel, deretter Z-prosjekt, deretter median. Trekk den tilsvarende bakgrunnen ved å gå til å behandle, gå til bildekalkulator og velge trekke fra rullegardinmenyen.Kontroller at det er merket av for 32-biters flottørresultat. For krymping av mikrotubuli kan du skaffe bilder med 100 bilder per sekund ved å sette tidsforsinkelsen til null og holde eksponeringstiden på 10 millisekunder. En viktig faktor for å skaffe bilder med høy kontrast med interferensinduksjonsmikroskopien er å riktig angi den numeriske blenderåpningen av belysningen.Dette kan gjøres ved å styre størrelsen på belysningsstrålen ved utgangen elev av målet, som styres av blenderåpningen membran størrelse. Bruk en prøve av blomstrende merkede stabiliserte mikrotubuli, sett mikrotubuli i fokus ved hjelp av mikroskopets fokusknapp mens de fluorescerende avbilder dem. Sett kameraeksponeringen til 10 millisekunder og lukk blenderåpningsmembranen til den minste åpningen.Juster også belysningen slik at den nesten metter kameraets dynamiske område eller til maksimumet er nådd. Hent 10 bilder ved å strømme et synsfelt som inneholder 10 eller flere mikrotubuer. Deretter får du et bakgrunnsbilde.Endre størrelsen på membranen og juster belysningsintensiteten slik at den samsvarer med det som tidligere ble bestemt. Skaff deg 10 nye bilder og en ny bakgrunn. Gjenta denne prosessen til hele mellomgulvet er fullført.For hvert synsfelt som er anskaffet, trekker du den tilsvarende bakgrunnen og gjennomsnitter de resulterende bakgrunnstredde bildene som vist tidligere. Deretter beregner du gjennomsnittlig signal til bakgrunnsstøyforhold av mikrotubuli for hver åpningsstørrelse. Sett mellomgulvstørrelsen til den som produserer det høyeste signalet til bakgrunnsstøyforholdet.Det er mulig at det er en rekke størrelser som produserer sammenlignbar kontrast som vist her. Med et veljustert mikroskop skal mikrotubuli være synlige uten bakgrunnsundertraksjon. Trekke bakgrunnen, men forbedrer kontrasten til mikrotubuli.For ytterligere å forbedre kontrasten, kan snitt, 4a filtrering eller en kombinasjon av begge brukes. Linjeskanningene som vises her, beskriver den trinnvise forbedringen av bildekvaliteten. Disse beskriver en merkbar reduksjon av bakgrunnsstøy med hvert behandlingstrinn.Mikrotubulidynamikk kan rapporteres i kinografer, som genereres fra tidsforløp filmer. Et eksempel kinograph kjøpt med en bildefrekvens på 0,2 bilder per sekund er vist her. De stiplede linjene markerer frøene.Når du utfører denne prosedyren, er det viktig å arbeide med høye numeriske blendermål. Det er også viktig å justere og angi størrelsen på blenderåpningdiameterrammen riktig. Det er lett å kombinere IRM med fluorescensavbildning for å studere, for eksempel mikrotubulbindende proteiner og hvordan de endrer mikrotubulidynamikk.Teknikken reduserer bildeskader betydelig og gir høyere bildefrekvensoppkjøp, noe som gjør det lettere å studere merkede biopolymerer som mikrotubuli i lengre perioder med høy temporal oppløsning og god sporingspresisjon.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Bioengineering

Unit 1

The Cytoskeleton II: Microtubules and Intermediate Filaments

SCIENTISTS IN ACTION

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Ikke-kontakt, Label-fri Overvåking av celler og ekstracellulær matriks med Raman spektroskopi

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualisering av Cortex Organisasjon og Dynamics i Mikroorganismer, bruke Total Internal Reflection fluorescensmikroskopi

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

En microfluidic basert Elektrokjemisk biochip for Label-free DNA Hybridisering Analyse

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

En etikett-fri teknikk for rom-tid-Imaging av enkeltcelle Sekret

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Etikett-free enkelt molekyl Detection Bruke Microtoroid Optiske resonatorer

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

High Speed Sub-GHz Spectrometer for Brillouin Scattering Analysis

High Speed ​​Under GHz Spectrometer for Brillouin Spredning Analysis

The goal of this protocol is to build a parallel high-extinction and high-resolution optical Brillouin spectrometer. Brillouin spectroscopy is a ...

A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors

En guide til Strukturert Illumination TIRF Mikros i høy hastighet med flere farger

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular ...

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

PIP-on-a-chip: En etikettfri studie av protein-fosfinositid-interaksjoner

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy

Vurdere kollagen og Elastin press-avhengige Microarchitectures i Live, menneskelig motstand arterier av etiketten-fri fluorescens mikroskopi

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Visualisere vedheft formasjon i celler ved hjelp av avansert spinner disken totalt interne refleksjon fluorescens mikroskopi

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...