Name: implementation of interference reflection microscopy for label-free, high-speed imaging of microtubules
Uploaded: 2019-08-08T11:30:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Implementation of Interference Reflection Microscopy for Label-free, High-speed Imaging of Microtubules at JoVE.com

Os autores agradecem a Anna Luchniak e Yin-Wei kuo pela leitura crítica e comentários sobre o protocolo.

1. modificação do microscópio e lente objetiva
<ol><li>Insira um espelho 50/50 na roda de filtro do microscópio fluorescente usando um cubo de filtro apropriado (Figura 1). Lidar com o espelho 50/50 com cuidado como muitas vezes eles têm anti-reflexo de revestimento. Nota: nós usamos um espelho 50/50 em um cubo vazio do filtro do microscópio. O espelho 50/50 é introduzido onde o espelho dichroic é situado.</li>
	<li>Use um objetivo elevado da ampliação/óleo elevado do NA. Nota: neste protocolo, utilizou-se um objetivo de 100x/1.3 NA.</li>
</ol>2. preparação da câmara para aderir aos microtúbulos à superfície
<ol><li>Lâminas de microscópio limpas e coberturas de 22 mm x 22 mm (para microscópio vertical) ou 22 mm x 22 mm e 18 mm x 18 mm (para microscópios invertidos). Modifique a superfície conforme necessário. Por exemplo, limpe as coberturas utilizando um detergente alcalino (ver tabela de materiais) seguida de 100% de etanol com lavas de água destilada entre e após11.</li>
	<li>Corte tiras de 3 mm de largura de película de parafina plástica (ver tabela de materiais) usando uma lâmina de barbear e outra corrediça de microscópio como uma aresta.</li>
	<li>Coloque duas tiras de filme plástico de parafina 3 mm de distância em um deslizamento de cobertura de 22 x 22mm limpo. Em seguida, coloque uma lamínula de 18 mm x 18 mm para formar um canal. Se usar um microscópio ereto, coloc as tiras sobre uma corrediça limpa do microscópio e coloc então uma lamínula na parte superior.</li>
	<li>Coloque a lamínula (ou deslize) em um bloco de calor a 100 ° c por 10-30 s para que a película de parafina forme um canal selado.</li>
	<li>Fluxo em 50 μg/mL de anticorpo (em Brinkley buffer 1980 (BRB80)) por perfusão utilizando uma pipeta. Incubar por 10 min. Nota: utilizamos anticorpos anti-rhodamina para ligar sementes de microtúter rotuladas com rodamina à superfície. Alternativamente, a avidina pode ser usada para ligar sementes de microtúpodes com rótulo de biotina ou partículas de ouro biotiniladas. Para simplesmente olhar para microtúbulos na ausência de tubulina em solução (ou seja, um ensaio não-dinâmico), um anticorpo antitubulina pode ser usado.</li>
	<li>Lave cinco vezes com o tampão BRB80. Recomenda-se filtrar as soluções usando um filtro de 0,22 μm.</li>
	<li>Fluxo em 1% POLOXAMER 407 (um copolímero Triblock) em BRB80 para bloquear a superfície contra ligação não-específica. Incubar por 10 min.</li>
	<li>Lave cinco vezes com o tampão BRB80.</li>
	<li>A amostra está pronta para ser colocada no microscópio. Para evitar que a amostra seque, adicione duas gotas de buffer BRB80 nas extremidades do canal e reabasteça quando necessário.</li>
</ol>3. alinhamento do microscópio
<ol><li>Coloque a amostra na fase do microscópio. Ligue a fonte de luz epi-iluminação.</li>
	<li>Concentre-se na superfície da amostra. Você observará superfícies múltiplas enquanto o objetivo é movido para cima e para baixo devido à reflexão traseira da luz do sistema ótico dentro do trajeto ótico. Um bom método para encontrar a superfície da amostra é concentrar-se na borda da película de parafina. Uma vez que a superfície é encontrada, defina o campo de visão para o centro da câmara.</li>
	<li>Centrar o diafragma do campo no campo de visão fechando-o a meio caminho e usando os parafusos de ajuste. Uma vez alinhado, reabra o diafragma. Nota: o ajuste do parafuso só precisa ser feito esporadicamente, talvez a cada 3-6 meses ou quando a solução de problemas.</li>
	<li>Deslize na lente Bertrand para ver a pupila de saída (plano focal traseiro) do objetivo.</li>
	<li>Feche o diafragma de abertura (AD) para além das bordas da pupila de saída do objetivo.</li>
	<li>Use os parafusos de ajuste para centralizar o AD com a pupila de saída. Duplo cheque abrindo o AD e combinando suas bordas com os da pupila de saída. Nota: este ajuste só precisa ser feito esporadicamente.</li>
	<li>Ajuste o diafragma da abertura a aproximadamente 2/3 do NA do objetivo. Consulte a seção 7 para obter procedimentos detalhados para otimizar o diafragma de abertura.</li>
</ol>4. microtúbulos estabilizados por imagem ou partículas de ouro de 40 nm
Nota: microtúbulos estabilizados e nanopartículas de ouro servem como boas amostras de controle. Recomenda-se a superfície da imagem anexado microtúbulos ou nanopartículas de ouro como um primeiro passo para avaliar o desempenho do IRM e ajudar na definição da abertura de diafragma de abertura ideal (seção 7).
<ol><li>Defina o tempo de exposição da câmera para 10 ms e ajuste a iluminação para quase saturar a faixa dinâmica da câmera.</li>
	<li>Fluxo em 10 μL de guanylyl-(alfa, beta)-metileno-diphosphonate (gmpccp)-ou microtúbulos Taxol-estabilizados em BRB804,12,13 (ou partículas do ouro de 40 nanômetro) pela perfusão usando uma pipeta a uma amostra fresca e monitoram ligação por imagem da superfície. Uma vez que 10-20 microtúbulos estão ligados dentro do campo de visão, lave a amostra 2x com BRB80. Nota: com um microscópio bem alinhado, os microtúbulos devem ser visíveis sem subtração de fundo.</li>
	<li>Adquira 10 imagens definindo um lapso de tempo com 1 segundo período de atraso por 10 segundos (a 10 ms de exposição).</li>
	<li>Adquira uma imagem de fundo. Para fazer isso, mova o palco usando o controlador de palco ou software de computador ao longo do eixo longo do canal ao adquirir 100 imagens sem demora (ou seja, streaming perto de 100 FPS @ 10 ms exposição). Nota: o fundo é a mediana das 100 imagens. Tomando a mediana, o perfil da iluminação e outras características estacionárias como a sujeira na ótica são preservadas quando todo o outro for filtrado para fora. Não deve haver inclinação na amostra, pois isso levará à mudança na posição axial conforme o estágio é movido e, em última análise, degradar a imagem de fundo. Se a inclinação não pode ser evitada, então um método alternativo é adquirir imagens de fundo médias antes de fluir as sementes.</li>
	<li>Para processar e analisar as imagens, avance para o passo 6.</li>
</ol>5. dinâmica do microtúe de imagem
<ol><li>Para a dinâmica do microtúse usando o tubulin do cérebro, ajuste a temperatura do calefator da amostra a 37 ° c.</li>
	<li>Fluxo em 10 μL de sementes de microtúnos estabilizados com GMPCCP em BRB8011 por perfusão usando uma pipeta para uma amostra fresca e monitorá-los ligando para a superfície por imagem a superfície ao vivo (ou seja, durante a transmissão). Uma vez que 10-20 sementes são encadernadas com campo de visão, lave a amostra usando 2x volume do canal com BRB80 (BRB80 deve ser pré-aquecido para 37 ° c ou pelo menos à temperatura ambiente). Nota: com um microscópio bem alinhado, as sementes devem ser visíveis sem subtração de fundo.</li>
	<li>Fluxo na mistura da polimerização (7,5 μm tubulina sem rótulo + 1 milímetro trifosfato do guanosina (GTP) + 1 milímetro dithiothreitol (DTT) no amortecedor BRB80). Para medir o crescimento do microtúse, defina um lapso de tempo usando o software de aquisição para adquirir uma imagem a cada 5 segundos (0,2 quadros por segundo (FPS)) por 15 minutos.</li>
	<li>Para aumentar o contraste, adquira 10 imagens (em vez de uma) em cada ponto de tempo e a média deles. Para o encolhimento do microtubule, adquira imagens em 100 fps ajustando o atraso de tempo a 0 e um tempo de exposição de 10ms (FPS mais elevado é possível com as regiões menores do interesse dependendo da câmera usada).</li>
	<li>Adquira uma imagem de fundo como na etapa 4,4.</li>
</ol>6. processamento e análise de imagens
Nota: para análise, este protocolo usa Fiji14 mas o leitor é livre para usar qualquer software que ela/ele encontrar adequado.
<ol><li>Abra imagens de fundo salvas.</li>
	<li>Calcule a imagem mediana (ou seja, fundo) usando image &Gt; Stack &Gt; Z projeto &Gt; mediana.</li>
	<li>Abra o filme de dinâmica de microtúbulos como uma pilha (mesmo para microtubules não dinâmicos) usando o arquivo &Gt; abrir.</li>
	<li>Subtrair a imagem de plano de fundo da pilha usando o processo > Calculadora de imagem. Certifique-se de verificar a opção "32bit (float) Result".</li>
	<li>Para microtúbulos dinâmicos, usando a ferramenta de linha desenhe uma linha ao longo do microtubule de interesse e adicioná-lo para a região de gerente de interesse, pressionando "t". Repita para todos os microtúbulos de interesse.</li>
	<li>Para microtúbulos dinâmicos, execute a macro multi-Kymo (arquivo complementar 1). A macro gerará um vídeo e um quimógrafo para cada microtubule no Gerenciador de ROI. Cada microtúter terá um identificador único.</li>
	<li>Para microtúbulos dinâmicos, execute a macro Kymo-Analysis (arquivo complementar 2) e siga seus passos para medir as taxas de crescimento e as taxas de encolhimento dos microtúbulos.</li>
</ol>7. tamanho do diafragma da abertura
Nota: um fator importante para a aquisição de imagens de alto contraste de microtúbulos usando IRM é definir a abertura numérica de iluminação (INA) corretamente10,15. O INA pode ser mudado mudando o tamanho do feixe de iluminação entrante na pupila da saída do objetivo que é controlada pelo tamanho do anúncio (o anúncio está localizado em um plano conjugado com a pupila de saída (plano focal traseiro) do objetivo , Figura 1): <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59520/59520eq1.jpg"> onde dad é o diâmetro do diafragma de abertura, fobjetivo é o comprimento focal do objetivo e DEP é o diâmetro da pupila de saída do objetivo. Tipicamente, o anúncio é deixado inteiramente aberto para a imagem latente da fluorescência, assim que o INA iguala o objetivo ' s na. Em um microscópio de fluorescência, a escala AD não indica seu diâmetro, portanto, a INA não pode ser calculada. É possível calibrar o tamanho do anúncio com a ajuda de um objetivo. No entanto, não é necessário uma vez que o tamanho do AD seria corrigido para o tamanho que produz o maior contraste.
<ol><li>Prepare uma amostra de microtúbulos estabilizados fluorescentamente rotulados presos à superfície (etapas 4.1-4.2). Nota: utilizamos tetrametilrodamina rotulada microtúbulos16 (Ex: 550 nm, Em: 580 nm).</li>
	<li>Coloque os microtúbulos em foco usando o botão de focagem do microscópio enquanto a imagem é fluorescentamente (se os microtúbulos não estiverem rotulados, com IRM15 ou DIC5).</li>
	<li>Defina a exposição da câmera para 10 MS usando o software da câmera. Nota: esta exposição é arbitrária e uma exposição de 100 ms também funcionaria.</li>
	<li>Feche o AD para a sua menor abertura. Ajuste a iluminação para quase saturar o alcance dinâmico da câmera ou o máximo possível. Nota: como um guia, use o olhar acima da tabela fornecida tipicamente pelo software da aquisição.</li>
	<li>Adquira 10 imagens (por streaming ou tirando uma imagem a cada segundo) de um campo de visão contendo 10 + microtúbulos.</li>
	<li>Adquira uma imagem de fundo como na etapa 4,4.</li>
	<li>Altere o tamanho do AD e repita as etapas 7.5-7.6 para todo o intervalo de abertura do AD (de fechado para o tamanho da pupila de saída, Figura 2). Toda vez que o tamanho do anúncio é alterado, ajuste a intensidade da iluminação para corresponder à da etapa 7,4.</li>
	<li>Para cada campo de visão adquirido, subtrair o fundo correspondente usando o processo > Calculadora de imagem e escolhendo "subtrair" no menu suspenso. Certifique-se que a opção "32bit (float) Result" está marcada. Em seguida, a média das imagens resultantes usando image > stack > projeto Z > média.</li>
	<li>Meça a razão sinal-para-ruído de fundo (SBR) dos microtúbulos definidos como a intensidade média do sinal do microtubule (intensidade do microtubule menos a intensidade do fundo) dividido pelo desvio padrão do fundo ( Figura 3).</li>
	<li>Determine o tamanho ideal do anúncio (ou seja, INA ideal) calculando a média de SBR dos microtúbulos para cada tamanho de abertura e defina o tamanho do anúncio para aquele que produz o SBR mais alto (Figura 2). É possível que haja uma variedade de tamanhos de AD que produzem contraste comparável15.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Widlund, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+purification+of+assembly-competent+tubulin+from+diverse+eukaryotic+sources.">One-step purification of assembly-competent tubulin from diverse eukaryotic sources.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (22), 4393-4401 (2012).</li><li>Walker, R. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+an+optical+microscope+to+0.1+nm+in+three+dimensions.">Stabilization of an optical microscope to 0.1 nm in three dimensions.</a> Appl Opt. 46 (3), 421-427 (2007).</li><li>Limozin, L., Sengupta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Reflection+Interference+Contrast+Microscopy+(RICM)+in+Soft+Matter+and+Cell+Adhesion.">Quantitative Reflection Interference Contrast Microscopy (RICM) in Soft Matter and Cell Adhesion.</a> ChemPhysChem. 10 (16), 2752-2768 (2009).</li></ol>

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Este protocolo demonstrou o uso bem sucedido do IRM para a imagem latente e a medida da dinâmica do microtubule. O cuidado deve ser dado para ajustar corretamente a abertura numérica da iluminação porque tem o impacto o mais forte no contraste da imagem. Além disso, o uso de objetivos de alta abertura numérica (NA) é importante para obter imagens de alta resolução/alto contraste, pois um objetivo maior de NA tem maior poder de coleta de luz em comparação aos objetivos de baixa NA. O limpador a superfície e as soluções usaram o mais baixo o ruído como a sujeira termina acima a fixação à superfície e a adição (sobre o curso do experimento) speckle como o ruído às imagens. A aquisição de uma imagem de fundo é importante, bem como remove inhomogenidades de iluminação, ruído estático e irregularidades superficiais.
Uma modificação recomendada é introduzir um filtro longo da passagem (> 600 nanômetro) no trajeto da iluminação. O espectro de fontes de luz branca tipicamente contém comprimentos de onda no UV que pode danificar os microtúbulos. Além disso, o uso de comprimento de onda longo para IRM é útil ao combinar o IRM com fluorescência (por exemplo, ao estudar o efeito de proteínas associadas ao microtúse (MAPs) na dinâmica do microtúse). Esteja ciente de que, quando a imagem para o período de tempo gasto, a deriva da amostra (especialmente ao longo do eixo óptico) diminui o contraste da imagem devido ao desvio do plano de imagem do plano de fundo. Os microscópios modernos são equipados frequentemente com os mecanismos da estabilização (por exemplo, foco perfeito (Nikon), Focus. 2 definitivo (Zeiss), IX3-ZDC2 (Olympus)). Uma solução alternativa é estabilizar termicamente a instalação passivamente ou ativamente18 ou corrigindo para Drift19,20,21. Finalmente, o contraste do microtubule pode ser aumentado reduzindo o tamanho do diafragma do campo (uma abertura de 70% é boa escolha porque é um contrapeso entre o contraste crescente e o tamanho do campo de vista)15.
Enquanto o IRM é adequado para microtúbulos de imagem não é sensível o suficiente para detectar proteínas únicas. Para tal aplicação, iSCAT é uma técnica mais adequada. Similarmente, a fluorescência e o iSCAT são seridos melhor se a precisão de seguimento de menos de 10 nanômetro é precisada. Para IRM, a precisão de rastreamento de comprimento medido é ~ 20 nm, como mostrado na Figura 7.
O uso de IRM em ensaios de superfície pode ir além dos microtúbulos; por exemplo, os motores moleculares podem ser rotulados com nanopartículas de ouro e controlados como eles interagem com microtúbulos. Além disso, uma forma mais avançada de IRM conhecida como microscopia de contraste de interferência reflexiva (RICM)22 pode, em princípio, ser usada para aprimorar ainda mais o contraste dos microtúbulos e obter maior precisão de rastreamento.

A imagem latente Label-Free dos microtúbulos é do interesse porque contorna a necessidade para a rotulagem fluorescente do tubulina para gerar o contraste nas imagens. A rotulagem fluorescente tem diversos inconvenientes: não praticável se a concentração da proteína é baixa1 e photobranqueamento e photodamage limitam o tempo da observação. Várias técnicas têm sido utilizadas para a imagem de microtúbulos sem rótulo, incluindo a microscopia de contraste de interferência diferencial com vídeo-Enhanced (DIC) e a microscopia Darkfield2,3,4,5. Recentemente, a microscopia de espalhamento interferométrico (iSCAT)6, a microscopia rotatória-coerente-espalhamento (ROCs)7 e a microscopia de interferência de luz espacial (Slim)8, também foram utilizadas. Todas estas técnicas são capazes de microtúbulos da imagem latente e provaram ser valiosas para estudar a dinâmica do microtubule. No entanto, cada um tem suas próprias limitações. No DIC o contraste depende do ângulo entre o microtúter e o eixo de prisma de Nomarski.  No campo escuro, o sinal de microtúse é degradado pela luz dispersa de impurezas ou defeitos de superfícies. Embora iSCAT exibe sensibilidade extraordinária (até proteínas únicas) e ROCS pode imagem microtúbulos mais profundos na amostra, ambos os métodos são tecnicamente exigentes, exigindo scanners a laser.
Este protocolo demonstra como a microscopia da reflexão da interferência (IRM)9,10 pode ser ajustada acima como uma técnica alternativa para a imagem latente Label-Free dos microtubules. O IRM é fácil de implementar, pois requer apenas a adição de um espelho 50/50 barato a um microscópio fluorescente padrão. Quando usado em conjunto com o software descrito aqui, o IRM produz imagens de microtubule de alto contraste, pode imagem grandes campos de visão em alta velocidade, requer um alinhamento OneTime, e pode ser facilmente combinada com outras técnicas, como a imagem latente de fluorescência.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti-Eclipse</td>
			<td>An inverted microscope used for perfoming the expriments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50/50 beam splitter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>21000</td>
			<td>When buying make sure to choose the splitter dimensions that fit the cube used in the microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIKON PLAN FLUOR 100X/0.5-1.3 Iris objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRH02902</td>
			<td>Imaging objective. This objective has a NA adjusting iris that was opened to NA 1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mucasol universal detergent</td>
			<td>Sigma-aAldrich</td>
			<td>Z637181-2L</td>
			<td>Used for cleaning coverslips and slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic paraffin film (commerical name Parafilm M)</td>
			<td>Sigma-aAldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td>Used for constructing flow channels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TAMRA antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-6397</td>
			<td>Used to bind TAMRA labeled molecules (e.g. microtubules) to the sample surface. RRID (AB_2536196)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poloxamer 407 (commercial name Pluronic F-127)</td>
			<td>Sigma-aAldrich</td>
			<td></td>
			<td>Used for blocking the channel surface to prevent nonspecific binding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 nm gold nanoparticles</td>
			<td>Sigma-aAldrich</td>
			<td>753637</td>
			<td>Used as a control sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 nm gold nanoparticles</td>
			<td>Sigma-aAldrich</td>
			<td>753610</td>
			<td>Used as a control sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zyla 4.2 Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Zyla 4.2</td>
			<td>2048x2048 pixles (6.5&#181;m pixel size) with quantum efficiency of 72% and 16bit dynamic range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feista tracking software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://www.bcube-dresden.de/fiesta/wiki/FIESTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stabilized microtubles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>prepared in house (see references in text)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implementation of interference reflection microscopy for label-free, high-speed imaging of microtubules

Existem vários métodos para visualizar biomoléculas purificadas perto de superfícies. A microscopia total-interna da fluorescência da reflexão (TIRF) é um método geralmente usado, mas tem a desvantagem que exige a rotulagem fluorescente, que pode interferir com a atividade das moléculas. Além disso, photobranqueamento e photodamage são preocupações. No caso dos microtúbulos, verificou-se que imagens de qualidade semelhante ao TIRF podem ser obtidas por microscopia de reflexão de interferência (IRM). Isto sugere que o IRM pode ser uma técnica geral para visualizar a dinâmica de grandes biomoléculas e oligômeros in vitro. Neste artigo, mostramos como um microscópio de fluorescência pode ser modificado simplesmente para obter imagens de IRM. O IRM é mais fácil e consideravelmente mais barato de implementar do que outras técnicas de contraste, como microscopia de contraste de interferência diferencial ou microscopia de espalhamento interferométrico. É igualmente menos suscetível aos defeitos de superfície e às impurezas da solução do que a microscopia do Darkfield. Usando o IRM, juntamente com o software de análise de imagem descrito neste documento, o campo de visão e a taxa de quadros são limitados apenas pela câmera; com uma câmera de sCMOS e o comprimento do microtubule da iluminação do largo-campo pode ser medido com precisão até 20 nanômetro com uma largura de faixa de 10 hertz.

Como mencionado acima, com um microscópio bem alinhado, os microtúbulos devem ser visíveis sem subtração de fundo (figura 4a). Subtrair o fundo (Figura 4B) aumenta o contraste do microtúlo (Figura 4C). Para aumentar ainda mais o contraste, a média ou a filtragem de Fourier ou uma combinação de ambos podem ser usados (Figura 4D, F, E). A linha digitaliza na Figura 4G mostra a melhoria incremental da qualidade da imagem. Observe a redução do ruído de fundo com cada etapa de processamento.
Os exemplos de kymographs da dinâmica do microtubule gerados dos filmes do lapso de tempo são mostrados em Figura 5. Os vídeos foram adquiridos em duas taxas de quadros: 0,2 fps (lento) e 100 fps (rápido). O primeiro é apropriado para medir taxas de crescimento quando o último for mais apropriado para medir a taxa do encolhimento que é uma ordem de magnitude mais rapidamente do que a taxa de crescimento.
Para o caso em que as nanopartículas de ouro são usadas para configurar o microscópio, uma imagem de exemplo é mostrada na Figura 6. As nanopartículas de ouro foram ligadas passivamente à superfície. Enquanto 40 nm partículas são recomendadas, também é possível a imagem de 20 nm partículas, mas em um menor contraste.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59520/59520fig1.jpg"> Figura 1. Representação esquemática do IRM. (A) EPI-a iluminação da fonte luminosa passa através do diafragma da abertura antes de alcangar o espelho 50/50. O diafragma da abertura ajusta a largura do feixe assim a iluminação NA. O espelho 50/50 reflete parcialmente a luz até o objetivo de iluminar a amostra. A luz refletida da amostra é coletada e projetada então na microplaqueta da câmera (pela lente do tubo) onde interfere para gerar a imagem. O contraste da imagem é o resultado da interferência entre a luz refletida da interface vidro/água (I1) e a luz refletida da interface água/microtúter (I2). Dependendo da distância do microtúter/superfície (h), a diferença de caminho óptico entre i1 e i2 resultará em um sinal construtivo (brilhante) ou destrutivo (sinal escuro) ou qualquer coisa no meio. Por exemplo, se a luz com um comprimento de onda de 600 nm é usada para a imagem latente, o contraste comutará entre escuro e brilhante quando a altura do microtubule muda por aproximadamente 100 nanômetro. O asterisco indica os planos conjugadas (modificados a partir de15). (B) exemplo da instalação do espelho 50/50. Um cubo apropriado do filtro foi aberto e o espelho foi introduzido onde um espelho dichroic se senta geralmente. O espelho foi orientado como por instruções do fabricante. Em seguida, o cubo foi inserido na roda de filtro que foi inserido de volta para o microscópio (não mostrado). Durante a instalação, as luvas foram usadas, e o espelho foi prendido somente pelas bordas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/59520fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59520/59520fig2.jpg"> Figura 2. Ajuste ideal do diafragma da abertura. (A) o mesmo campo de visão foi imaged em aberturas diferentes do diafragma da abertura sem subtração do fundo. Visualmente, o contraste aumentou à medida que o tamanho do diafragma de abertura aumentou até chegar a um planalto e começou a degradar depois. Isto foi confirmado por (B) medidas de SBR de imagens subtraída fundo. As barras de erro são desvio padrão.  As barras de escala são 500 μm (AD) e 3 μm (microtúbulos). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/59520fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59520/59520fig3.jpg"> Figura 3. Medindo a relação de ruído do sinal-à-fundo. Os microtúbulos foram isolados em regiões de interesse. Cada região de interesse foi limitados para separar o microtubule do fundo. O sinal médio do microtubule foi obtido de uma varredura da linha através do microtubule. A largura da linha de digitalização foi definida para igualar o comprimento do microtúter. Desta forma, cada ponto na digitalização é uma média dos sinais de todos os pixels ao longo do eixo do microtubule que são paralelos a esse ponto. O ruído de fundo é o desvio padrão de todos os pixels abaixo do limiar cortado.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/59520fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59520/59520fig4.jpg"> Figura 4. Processamento de imagem. Após a aquisição de imagens cruas (a), o fundo (B) foi subtraído (C) para aumentar o contraste do microtúlilo. Para melhorar ainda mais o contraste as imagens foram médias (D) ou Fourier filtrada (E) ou ambos (F). As varreduras de linha (G), cuja localização é indicada pela linha vermelha tracejada em (a) são cor correspondente às várias imagens em (a) a (F). Os números no canto inferior são SBRs médios medidos para todo o campo de visão. A barra de escala é de 5 μm (modificada a partir de15). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/59520fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59520/59520fig5.jpg"> Figura 5. Exemplos de kymographs. (A) exemplos do kymograph da dinâmica do microtubule gerada dos filmes do lapso de tempo adquiridos em 0,2 fps. (B) kymograph representando um exemplo de um evento de encolhimento gerado a partir de um filme adquirido em 100 fps. Linhas tracejadas marcam as sementes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/59520fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59520/59520fig6.jpg"> Figura 6. Exemplo de nanopartículas de ouro imaged com IRM. As nanopartículas de ouro dos tamanhos 20 e 40 nm foram ligadas passivamente à superfície. foram adquiridas 10 imagens. Após a subtração do fundo, as imagens foram médias para realçar o contraste. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/59520fig6large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59520/59520fig7.jpg"> Figura 7. Comprimento de microtubule rastreamento de precisão em imagens IRM. Microtúbulos estabilizados (ou seja, comprimentos fixos) foram imaged 200x em 100 fps, em seguida, a média de 10 fps para aumentar o contraste. Em seguida, os comprimentos dos microtúbulos foram medidos usando o software de rastreamento do Fiesta17 . Para cada microtúter, calculou-se o comprimento médio e o desvio padrão, conforme mostrado na figura (linha tracejada representa a média e linhas vermelhas sólidas representa o desvio padrão, comprimento = 3971 ± 20 nm. A precisão geral de rastreamento foi a média do desvio padrão de todos os microtúbulos rastreados (n = 6 microtúbulos x 20 pontos de dados = 120 pontos de dados). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/59520fig7large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Arquivo complementar 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/Multi_Kymo.ijm" target="_blank">Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.</a> 
Arquivo complementar 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/Kymo_Analysis.ijm" target="_blank">Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.</a>

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Implementation of Interference Reflection Microscopy for Label-free, High-speed Imaging of Microtubules

Este protocolo é um guia para a implementação de microscopia de reflexão de interferência em um microscópio de fluorescência padrão para imagens sem rótulo, de alto contraste e alta velocidade de microtúbulos usando ensaios de superfícies in vitro.

Implementação de microscopia de reflexão de interferência para imagens sem rótulo e alta velocidade de microtúbulos

There are several methods for visualizing purified biomolecules near surfaces. Total-internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a commonly used ...

O significado deste protocolo é que ele introduz uma técnica de imagem livre de rótulos capaz de adquirir imagens de alto contraste a altas taxas de quadros que é mais simples e barata do que outras técnicas como DIC e dark field. A principal vantagem dessa técnica é que é fácil de implementar e é fácil de usar. É barato e pode ser combinado com microscópios de fluorescência facilmente.O método foi desenvolvido para visualizar microtúbulos individuais. Tem potencial para ser usado para visualizar grandes complexos proteicos e nanopartículas. A principal dificuldade é a energia de ativação necessária para mexer com o cubo do filtro para adicionar o espelho meio prata.Meu conselho para alguém que está tentando a técnica pela primeira vez é apenas fazê-lo. Para começar, insira um espelho 50/50 na roda do filtro de um microscópio fluorescente usando um cubo de filtro apropriado. Manuseie o espelho com cuidado, pois muitas vezes eles têm uma codificação anti-reflexão.Recorrida a um objetivo de alta ampliação que também tem uma alta abertura numérica. O mostrado aqui é um objetivo de óleo de 100x com uma abertura numérica de 1,3. Em seguida, use uma lâmina de barbear e um slide de microscópio como uma borda reta para cortar três milímetros de tiras de largura de filme de parafina de plástico.Coloque duas tiras de filme de parafina de plástico três milímetros separadas em um deslizamento de cobertura limpo de 22 por 22 milímetros, em seguida, coloque um deslizamento de cobertura de 18 por 18 milímetros em cima das tiras para formar um canal. Transfira o deslizamento de cobertura para um bloco de calor a 100 graus celsius por 10 a 30 segundos para que o filme de parafina forme um canal selado. Usando uma pipeta, flua em 50 microgramas por mililitro de um anticorpo anti-rhodamina por perfusão e incubar o slide por 10 minutos.Após a incubação, lave o canal cinco vezes usando BRB80 filtrado e flua em 1%Poloxamer 407 no BRB80 filtrado para bloquear a superfície contra ligação não específica e incubar o slide por 10 minutos. Novamente, lave o canal cinco vezes usando BRB80 filtrado. Para evitar que a amostra seque, adicione duas gotículas do BRB80 filtrado nas extremidades do canal e adicione mais tampão conforme necessário.Coloque a amostra no estágio do microscópio e ligue a fonte de luz epi-iluminação. Concentre-se na borda do filme de parafina para encontrar a superfície da amostra e, em seguida, mova o campo para definir a vista para o centro da câmara. Você observará múltiplas superfícies à medida que o objetivo é movido para cima e para baixo devido ao reflexo da luz da óptica dentro do caminho óptico.Em seguida, centralize o diafragma de campo no campo de visão fechando-o no meio do caminho e usando os parafusos de ajuste. Uma vez que o diafragma esteja devidamente alinhado, reassum-no. Em seguida, deslize na lente Bertrand para ver o plano focal traseiro, também conhecido como o pupilo de saída do objetivo.Feche o diafragma de abertura além das bordas da pupila de saída e use os parafusos de ajuste para centralizar o diafragma de abertura em relação à pupila de saída. Verifique duas vezes abrindo o diafragma de abertura e combinando suas bordas com as da pupila de saída. Em seguida, defina o diafragma de abertura para cerca de dois terços da abertura numérica do objetivo.Para começar, ajuste o tempo de exposição da câmera para 10 milissegundos e ajuste a iluminação para quase saturar o alcance dinâmico da câmera. Em seguida, use uma pipeta para fluir em 10 microlitres de microtúbulos estabilizados GMPCPP em 0,22 micrômetros filtrados BRB80. Monitore a ligação do microtúbulo na imagem da superfície.Uma vez que 10 a 20 microtúbulos estejam ligados no campo de visão, lave a amostra duas vezes com o BRB80 filtrado. Adquira 10 imagens dos microtúbulos configurando um lapso de tempo com uma exposição de 10 milissegundos e um período de atraso de um segundo por um total de 10 segundos. Em seguida, adquira imagens de fundo movendo o palco usando o controlador de palco ao longo do eixo longo do canal, ao mesmo tempo em que adquire 100 imagens sem demora.Para a dinâmica dos microtúbulos de imagem usando tubulina cerebral, comece definindo a temperatura do aquecedor amostral para 37 graus celsius. Usando uma pipeta, flua em 10 microliters de sementes de microtúbulas estabilizadas pelo GMPCPP e monitore-as ligando-as à superfície por meio de imagens ao vivo da superfície. Uma vez que 10 a 20 sementes estejam vinculadas no campo de visão, lave a amostra usando o dobro do volume do canal de BRB80 pré-aquecido e filtrado.Em seguida, flua em 10 microliters da mistura de polimerização. Para medir o crescimento dos microtúbulos, configure um lapso de tempo usando o software de aquisição para adquirir uma imagem a cada cinco segundos por 15 minutos. Melhore o contraste adquirindo uma imagem média de 10 em cada ponto de tempo.Adquira imagens de fundo como mostrado na seção anterior. Calcule a mediana indo para a imagem, selecionando pilha, depois projeto Z, em seguida, mediana. Subtraia o fundo correspondente indo para o processo, indo para a calculadora de imagem e escolhendo subtrair do menu suspenso.Certifique-se de que a opção de resultado de flutuação de 32 bits seja verificada. Para encolhimento de microtúbulos, adquira imagens a 100 quadros por segundo, definindo o atraso de tempo para zero e mantendo o tempo de exposição em 10 milissegundos. Um fator importante para a aquisição de imagens de alto contraste com a microscopia de indução de interferência é definir adequadamente a abertura numérica da iluminação.Isso pode ser feito guiando o tamanho do feixe de iluminação na pupila de saída do objetivo, que é controlada pelo tamanho do diafragma de abertura. Usando uma amostra de microtúbulos estabilizados com rótulos florescentes, leve os microtúbulos em foco usando o botão de foco do microscópio enquanto os imagens fluorescentes. Defina a exposição da câmera a 10 milissegundos e feche o diafragma de abertura à sua menor abertura.Além disso, ajuste a iluminação para quase saturar o alcance dinâmico da câmera ou até que o máximo seja atingido. Adquira 10 imagens transmitindo um campo de visão contendo 10 ou mais microtúbulos. Em seguida, adquira uma imagem de fundo.Altere o tamanho do diafragma e ajuste a intensidade de iluminação para corresponder ao que foi previamente determinado. Adquira 10 novas imagens e um novo plano de fundo. Repita este processo até que toda a gama do diafragma esteja concluída.Para cada campo de visão adquirido, subtraia o fundo correspondente e média das imagens subtraídas de fundo resultantes, como mostrado anteriormente. Em seguida, calcule a relação de ruído médio do sinal para o fundo dos microtúbulos para cada tamanho de abertura. Defina o tamanho do diafragma para aquele que produz a maior relação de ruído de sinal para fundo.É possível que haja uma gama de tamanhos que produzem contraste comparável como mostrado aqui. Com um microscópio bem alinhado, os microtúbulos devem ser visíveis sem subtração de fundo. Subtrair o fundo, no entanto, melhora o contraste do microtúbulo.Para melhorar ainda mais o contraste, a média, a filtragem de 4a ou uma combinação de ambos podem ser usadas. As varreduras de linha mostradas aqui descrevem a melhoria incremental da qualidade da imagem. Estes descrevem uma redução notável do ruído de fundo a cada etapa de processamento.A dinâmica dos microtúbulos pode ser relatada em cineógrafos, que são gerados a partir de filmes de lapso de tempo. Um exemplo de cineógrafo adquirido a uma taxa de quadros de 0,2 quadros por segundo é mostrado aqui. As linhas tracejadas marcam as sementes.Ao realizar este procedimento, é importante trabalhar com objetivos de abertura numérica elevada. Também é importante alinhar e definir corretamente o tamanho do quadro de diâmetro de abertura. É fácil combinar IRM com imagens de fluorescência para estudar, por exemplo, proteínas de ligação de microtúbulos e como modificam a dinâmica dos microtúbulos.A técnica reduz consideravelmente o dano fotográfico e permite maior aquisição de taxas de quadros, facilitando o estudo de biopolímeros rotulados, como microtúbulos por longos períodos de tempo com alta resolução temporal e boa precisão de rastreamento.

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Bioengineering

Unit 1

The Cytoskeleton II: Microtubules and Intermediate Filaments

SCIENTISTS IN ACTION

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Sem contato, Monitoramento Label livre de células e matriz extracelular utilizando Espectroscopia Raman

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Bioengenharia

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Visualização de Cortex organização e dinâmica em microorganismos, utilizando microscopia de fluorescência Total Internal Reflection

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Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

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