Name: implementation of interference reflection microscopy for label-free, high-speed imaging of microtubules
Uploaded: 2019-08-08T11:30:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Implementation of Interference Reflection Microscopy for Label-free, High-speed Imaging of Microtubules at JoVE.com

Авторы благодарят Анну Лучняк и Инь-вэй Куо за критическое чтение и комментарии к протоколу.

<ol>
	<li>Widlund, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+purification+of+assembly-competent+tubulin+from+diverse+eukaryotic+sources.">One-step purification of assembly-competent tubulin from diverse eukaryotic sources.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (22), 4393-4401 (2012).</li><li>Walker, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+instability+of+individual+microtubules+analyzed+by+video+light+microscopy:+rate+constants+and+transition+frequencies.">Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies.</a> The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1437-1448 (1988).</li><li>Hotani, H., Horio, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+microtubules+visualized+by+darkfield+microscopy:+Treadmilling+and+dynamic+instability.">Dynamics of microtubules visualized by darkfield microscopy: Treadmilling and dynamic instability.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 10 (1-2), 229-236 (1988).</li><li>Gittes, F., Mickey, B., Nettleton, J., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexural+rigidity+of+microtubules+and+actin+filaments+measured+from+thermal+fluctuations+in+shape.">Flexural rigidity of microtubules and actin filaments measured from thermal fluctuations in shape.</a> The Journal of Cell Biology. 120 (4), 923-934 (1993).</li><li>Bormuth, V., Howard, J., Sch&#228;ffer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LED+illumination+for+video-enhanced+DIC+imaging+of+single+microtubules.">LED illumination for video-enhanced DIC imaging of single microtubules.</a> J Microsc. 226 (Pt 1), 1-5 (2007).</li><li>Andrecka, J., Ortega Arroyo, J., Lewis, K., Cross, R. A., Kukura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+Imaging+of+Microtubules+with+Sub-nm+Precision+Using+Interferometric+Scattering+Microscopy.">Label-free Imaging of Microtubules with Sub-nm Precision Using Interferometric Scattering Microscopy.</a> Biophysical Journal. 110 (1), 214-217 (2016).</li><li>Koch, M. D., Rohrbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+Imaging+and+Bending+Analysis+of+Microtubules+by+ROCS+Microscopy+and+Optical+Trapping.">Label-free Imaging and Bending Analysis of Microtubules by ROCS Microscopy and Optical Trapping.</a> Biophysical Journal. 114 (1), 168-177 (2018).</li><li>Kandel, M. E., Teng, K. W., Selvin, P. R., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-Free+Imaging+of+Single+Microtubule+Dynamics+Using+Spatial+Light+Interference+Microscopy.">Label-Free Imaging of Single Microtubule Dynamics Using Spatial Light Interference Microscopy.</a> ACS Nano. 11 (1), 647-655 (2017).</li><li>Curtis, A. S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mechanism+of+Adhesion+of+Cells+to+Glass.">The Mechanism of Adhesion of Cells to Glass.</a> The Journal of Cell Biology. 20 (2), 199-215 (1964).</li><li>Weber, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[2]+Reflection+interference+contrast+microscopy.">[2] Reflection interference contrast microscopy.</a> Methods in Enzymology. 361, 34-47 (2003).</li><li>Gell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+13+-+Microtubule+Dynamics+Reconstituted+In+Vitro+and+Imaged+by+Single-Molecule+Fluorescence+Microscopy.">Chapter 13 - Microtubule Dynamics Reconstituted In Vitro and Imaged by Single-Molecule Fluorescence Microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 95, 221-245 (2010).</li><li>Nitzsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+14+-+Studying+Kinesin+Motors+by+Optical+3D-Nanometry+in+Gliding+Motility+Assays.">Chapter 14 - Studying Kinesin Motors by Optical 3D-Nanometry in Gliding Motility Assays.</a> Methods in Cell Biology. 95, 247-271 (2010).</li><li>Schiff, P. B., Fant, J., Horwitz, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+microtubule+assembly+in+vitro+by+taxol.">Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol.</a> Nature. 277 (5698), 665-667 (1979).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Mahamdeh, M., Simmert, S., Luchniak, A., Sch&#228;ffer, E., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+high-speed+wide-field+imaging+of+single+microtubules+using+interference+reflection+microscopy.">Label-free high-speed wide-field imaging of single microtubules using interference reflection microscopy.</a> Journal of Microscopy. 272 (1), 60-66 (2018).</li><li>Hyman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[39]+Preparation+of+modified+tubulins.">[39] Preparation of modified tubulins.</a> Methods in Enzymology. 196, 478-485 (1991).</li><li>Ruhnow, F., Zwicker, D., Diez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+Single+Particles+and+Elongated+Filaments+with+Nanometer+Precision.">Tracking Single Particles and Elongated Filaments with Nanometer Precision.</a> Biophysical Journal. 100 (11), 2820-2828 (2011).</li><li>Mahamdeh, M., Sch&#228;ffer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+tweezers+with+millikelvin+precision+of+temperature-controlled+objectives+and+base-pair+resolution.">Optical tweezers with millikelvin precision of temperature-controlled objectives and base-pair resolution.</a> Optics Express. 17 (19), 17190-17199 (2009).</li><li>Kim, K., Saleh, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilizing+method+for+reflection+interference+contrast+microscopy.">Stabilizing method for reflection interference contrast microscopy.</a> Applied Optics. 47 (12), 2070-2075 (2008).</li><li>Ortega Arroyo, J., Cole, D., Kukura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferometric+scattering+microscopy+and+its+combination+with+single-molecule+fluorescence+imaging.">Interferometric scattering microscopy and its combination with single-molecule fluorescence imaging.</a> Nature Protocols. 11 (4), 617-633 (2016).</li><li>Carter, A. R., King, G. M., Ulrich, T. A., Halsey, W., Alchenberger, D., Perkins, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+an+optical+microscope+to+0.1+nm+in+three+dimensions.">Stabilization of an optical microscope to 0.1 nm in three dimensions.</a> Appl Opt. 46 (3), 421-427 (2007).</li><li>Limozin, L., Sengupta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Reflection+Interference+Contrast+Microscopy+(RICM)+in+Soft+Matter+and+Cell+Adhesion.">Quantitative Reflection Interference Contrast Microscopy (RICM) in Soft Matter and Cell Adhesion.</a> ChemPhysChem. 10 (16), 2752-2768 (2009).</li></ol>

Авторы не имеют конфликта интересов раскрыть.

Этот протокол продемонстрировал успешное использование IRM для визуализации и измерения динамики микротруб. Следует позаботиться о правильном настройке просветительной численной диафрагмы, так как она оказывает самое сильное влияние на контраст изображения. Кроме того, использование высоких численных целей диафрагмы (NA) имеет важное значение для получения высокого разрешения / высокой контрастности изображения, как более высокая цель NA имеют более высокую мощность сбора света по сравнению с низкими целями NA. Чище поверхности и растворов используется ниже шума, как грязь заканчивается крепления к поверхности и добавления (в течение эксперимента) пятнышко, как шум на изображения. Приобретение фонового изображения имеет важное значение, а также удаляет неоднородности освещения, статического шума и поверхностных неровностей.
Рекомендуемая модификация заключается в том, чтобы ввести фильтр длинного прохода (Зgt;600 нм) в траектории освещения. Спектр белых источников света обычно содержит длины волн в УФ-излучения, которые могут повредить микротрубочки. Кроме того, использование длинной длины волны для IRM пригодится при сочетании IRM с флуоресценцией (например, при изучении влияния микротрубок связанных белков (МЭП) на динамику микротрубок). Имейте в виду, что при визуализации за расходуемый период времени, дрейф образца (особенно вдоль оптической оси) уменьшает контраст изображения из-за отклонения плоскости изображения от фонового самолета. Современные микроскопы часто оснащены стабилизационными механизмами (например, идеальным фокусом (Nikon), Определенным фокусом.2 (Зейсс), IX3-ЗДК2 (Олимп)). Альтернативным решением является термически стабилизировать установку либо пассивно или активно18 или путем коррекции для дрейфа19,20,21. Наконец, контраст микротрубок может быть увеличен за счет уменьшения размера поля диафрагмы (70% открытие является хорошим выбором, как это баланс между увеличением контрастности и поля зрения размера)15.
В то время как IRM подходит для визуализации микротрубочек, он не достаточно чувствителен для обнаружения одиночных белков. Для такого применения iSCAT является более подходящей техникой. Аналогичным образом, флуоресценция и iSCAT лучше подходят, если требуется точность отслеживания менее 10 нм. Для IRM измеренная точность отслеживания длины составляет 20 нм, как показано на рисунке 7.
Использование IRM в поверхностных анализах может выйти за рамки микротрубок; например, молекулярные двигатели могут быть помечены золотыми наночастицами и отслеживаться при взаимодействии с микротрубами. Кроме того, более продвинутая форма IRM, известная как светоотражающая микроскопия интерференции (RICM)22, в принципе может быть использована для дальнейшего повышения контраста микротрубок и получения более высокой точности отслеживания.

Без этикетки изображение микротрубок представляет интерес, поскольку она обходит необходимость флуоресцентной маркировки тубулина для создания контраста в изображениях. Флуоресцентная маркировка имеет несколько недостатков: это невозможно, если концентрация белка низкая 1, а фотоотбеление и фотоповреждение ограничивают время наблюдения. Несколько методов были использованы для изображения этикетки без микротрубок, в том числе видео-улучшенный дифференциальной интерференции контрастной микроскопии (DIC) и темного поля микроскопии2,3,4,5. В последнее время также использовались интерферометрическая микроскопия рассеяния (iSCAT)6,вращающаяся когеренно-рассеянная микроскопия (ROCS)7 и пространственная световая микроскопическая микроскопия (SLIM)8. Все эти методы способны к визуализации микротрубок и оказались полезными для изучения динамики микротруб. Тем не менее, каждый из них имеет свои собственные ограничения. В DIC контраст зависит от угла между микротрубоком и осью номарской призмы.  В темном поле, сигнал микротрубока деградирует рассеянным светом от примесей или дефектов поверхностей. Хотя iSCAT проявляет чрезвычайную чувствительность (вплоть до отдельных белков) и ROCS может изображение микротрубочек глубже в образец, оба метода являются технически требовательными, требующие лазерных сканеров.
Этот протокол демонстрирует, как микроскопия отражения помех (IRM)9,10 может быть создана в качестве альтернативного метода для без этикетки изображения микротрубок. IRM легко реализовать, поскольку он требует только добавление недорогого зеркала 50/50 к стандартному флуоресцентному микроскопу. При использовании в сочетании с программным обеспечением, описанным здесь, IRM производит высококонтрастные микротрубчатые изображения, может изображения больших полей зрения на высокой скорости, требует однократного выравнивания, и может быть легко объединена с другими методами, такими как флуоресценция изображений.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti-Eclipse</td>
			<td>An inverted microscope used for perfoming the expriments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50/50 beam splitter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>21000</td>
			<td>When buying make sure to choose the splitter dimensions that fit the cube used in the microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIKON PLAN FLUOR 100X/0.5-1.3 Iris objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRH02902</td>
			<td>Imaging objective. This objective has a NA adjusting iris that was opened to NA 1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mucasol universal detergent</td>
			<td>Sigma-aAldrich</td>
			<td>Z637181-2L</td>
			<td>Used for cleaning coverslips and slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic paraffin film (commerical name Parafilm M)</td>
			<td>Sigma-aAldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td>Used for constructing flow channels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TAMRA antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-6397</td>
			<td>Used to bind TAMRA labeled molecules (e.g. microtubules) to the sample surface. RRID (AB_2536196)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poloxamer 407 (commercial name Pluronic F-127)</td>
			<td>Sigma-aAldrich</td>
			<td></td>
			<td>Used for blocking the channel surface to prevent nonspecific binding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 nm gold nanoparticles</td>
			<td>Sigma-aAldrich</td>
			<td>753637</td>
			<td>Used as a control sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 nm gold nanoparticles</td>
			<td>Sigma-aAldrich</td>
			<td>753610</td>
			<td>Used as a control sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zyla 4.2 Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Zyla 4.2</td>
			<td>2048x2048 pixles (6.5&#181;m pixel size) with quantum efficiency of 72% and 16bit dynamic range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feista tracking software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://www.bcube-dresden.de/fiesta/wiki/FIESTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stabilized microtubles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>prepared in house (see references in text)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implementation of interference reflection microscopy for label-free, high-speed imaging of microtubules

Существует несколько методов визуализации очищенных биомолекул вблизи поверхностей. Полностью внутреннее отражение флуоресценции (TIRF) микроскопии является широко используемым методом, но имеет недостаток, что он требует флуоресцентной маркировки, которая может помешать деятельности молекул. Кроме того, фотоотбеление и фотоповреждения являются проблемами. В случае микротрубок, мы обнаружили, что изображения аналогичного качества TIRF могут быть получены с помощью микроскопии отражения помех (IRM). Это говорит о том, что IRM может быть общим методом визуализации динамики крупных биомолекул и олигомеров in vitro. В этой работе мы показываем, как флуоресцентный микроскоп может быть модифицирован просто для получения изображений IRM. IRM проще и значительно дешевле в реализации, чем другие методы контраста, такие как дифференциальная интерференция контрастной микроскопии или интерферометрической рассеяния микроскопии. Он также менее восприимчив к поверхностным дефектам и примесям раствора, чем микроскопия темного поля. Использование IRM, вместе с программным обеспечением для анализа изображений, описанным в настоящем документе, поле зрения и частота кадров ограничены только камерой; с помощью камеры sCMOS и широкоугольной длины микротрубока можно измерить с точностью до 20 нм с пропускной способностью 10 Гц.

Как уже упоминалось выше, с хорошо выровнены микроскоп, микротрубочки должны быть видны без фонового вычитания(Рисунок 4A). Вычитание фона(рисунок 4B) усиливает контраст микротрубока (рисунок4C). Для дальнейшего повышения контраста, усреднения или Fourier фильтрации или сочетание обоих могут быть использованы(Рисунок 4D, F, E). Сканирование линии на рисунке 4G показывает постепенное улучшение качества изображения. Обратите внимание на снижение фонового шума с каждым этапом обработки.
Примеры kymographs динамики микротрубочек, генерируемых из фильмов замедленного времени, показаны на рисунке 5. Видео были приобретены с двумя частотами кадров: 0,2 fps (медленный) и 100 кадров в секунду (быстрый). Первый подходит для измерения темпов роста, в то время как второй больше подходит для измерения темпов сокращения, что на порядок быстрее, чем темпы роста.
В случае, когда золотые наночастицы используются для настройки микроскопа, пример изображения отображается на рисунке 6. Золотые наночастицы пассивно прикреплялись к поверхности. Хотя 40 нм частиц рекомендуется, это также возможно изображение 20 нм частиц, но на более низком контрасте.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59520/59520fig1.jpg"> Рисунок 1. Схематическое представление IRM. (A) Эпи-освещение от источника света проходит через диафрагму диафрагмы до достижения 50/50 зеркало. Диафрагма диафрагмы диафрагмы устанавливает ширину луча таким образом освещение NA. Зеркало 50/50 частично отражает свет до цели, чтобы осветить образец. Свет, отраженный в образце, собирается, а затем проецируется на чип камеры (по объективу трубки), где он мешает генерировать изображение. Контраст изображения является результатом взаимодействия между светом, отраженным от стеклянного/водного интерфейса (I1) и светом, отраженным от интерфейса воды/микротрубочки (I2). В зависимости от микротрубочки/расстояния поверхности (h), оптическая разница пути между I1 и I2 приведет к конструктивному (яркий сигнал) или разрушительному (темный сигнал) или что-нибудь между ними. Например, если свет с длиной волны 600 нм используется для визуализации, контраст будет переключаться между темным и ярким, когда высота микротрубока изменяется примерно на 100 нм. Звездочка указывает на конъюгированные плоскости (измененные из15). (B) Пример установки зеркала 50/50. Подходящий кубик фильтра был открыт и зеркало было вставлено где дикроаическое зеркало обычно сидит. Зеркало было ориентировано в рамках инструкций производителя. Затем куб был вставлен в фильтрколесо, которое было вставлено обратно в микроскоп (не показано). Во время установки использовались перчатки, а зеркало держалось только по краям. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/59520fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59520/59520fig2.jpg"> Рисунок 2. Оптимальная диафрагма диафрагмы. (A) То же поле зрения было изображено на различных отверстиях диафрагмы диафрагмы без фонового вычитания. Визуально контраст увеличивался по мере увеличения размера диафрагмы диафрагмы, пока она не достигла плато и не начала ухудшаться впоследствии. Это было подтверждено (B) SBR измерения фоновых вычитаемых изображений. Бары ошибок являются стандартным отклонением.  Шкала баров 500 мкм (н.э.) и 3 мкм (микротрубочки). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/59520fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59520/59520fig3.jpg"> Рисунок 3. Измерение соотношения шума от сигнала к фону. Микротрубочки были изолированы в интересуемых регионах. Каждый регион, представляющий интерес, был заранее отделен от фона микротрубока. Средний сигнал микротрубока был получен из сканирования линии по микротрубе. Ширина линии сканирования была установлена в соответствии с длиной микротрубок. Таким образом, каждая точка сканирования представляет собой среднее значение сигналов всех пикселей вдоль оси микротрубок, параллельных этой точке. Фоновый шум является стандартным отклонением всех пикселей ниже отсеченного порога.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/59520fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59520/59520fig4.jpg"> Рисунок 4. Обработка изображений. После получения необработанных изображений (A)фон (B) был вычтен (C) для повышения контраста микротрубок. Для дальнейшего улучшения контраста изображения были либо усреднены (D) или Фурье фильтруется (E) или оба (F). Сканирование линии (G),местоположение которой указывается на пунктирной красной линии в (A) являются цветом, соответствующим различным изображениям в (A) к (F). Цифры в нижнем углу являются средними SBRs, измеренными для всего поля зрения. Шкала бар 5 мкм (изменено от15) . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/59520fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59520/59520fig5.jpg"> Рисунок 5. Примеры кимографов. (A) Kymograph примеры динамики микротрубочек, генерируемых из замедленного фильмов, приобретенных на 0,2 fps. (B) Kymograph с изображением примера события усадки, порожденных из фильма, приобретенного на 100 кадров в секунду. Dashed линии отмечают семена. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/59520fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59520/59520fig6.jpg"> Рисунок 6. Пример золотых наночастиц, изображенных irM. Золотые наночастицы размеров 20 и 40 нм были пассивно прикреплены к поверхности. Было получено 10 изображений. После фонового вычитания изображения усреднели для повышения контраста. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/59520fig6large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59520/59520fig7.jpg"> Рисунок 7. Точность отслеживания длины микротрубок в изображениях IRM. Стабилизированные микротрубочки (т.е. фиксированная длина) были изображены 200x на 100 кадров в секунду, а затем в среднем до 10 кадров в секунду для повышения контрастности. Далее, длина микротрубочки были измерены с помощью программного обеспечения отслеживания Fiesta17. Для каждого микротрубока средняя длина и стандартное отклонение были рассчитаны, как показано на рисунке (пунктирная линия представляет собой среднее и сплошные красные линии, представляющие стандартное отклонение, длина 3971 и 20 нм. Общая точность отслеживания была в среднем по стандартному отклонению всех гусеничных микротрубок (n no 6 микротрубчатых х 20 точек данных и 120 точек данных). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/59520fig7large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
Дополнительный файл 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/Multi_Kymo.ijm" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a> 
Дополнительный файл 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/Kymo_Analysis.ijm" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Implementation of Interference Reflection Microscopy for Label-free, High-speed Imaging of Microtubules at JoVE.com

Implementation of Interference Reflection Microscopy for Label-free, High-speed Imaging of Microtubules

Этот протокол является руководством для реализации микроскопии отражения помех на стандартном флуоресцентном микроскопе для безэтикетки, высококонтрастной, высокоскоростной визуализации микротрубок с использованием анализов поверхностей in vitro.

Внедрение микроскопии отражения помех для без этикетки, высокоскоростной визуализации микротрубок

There are several methods for visualizing purified biomolecules near surfaces. Total-internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a commonly used ...

Значение этого протокола заключается в том, что он вводит без этикетки метод визуализации, способный приобретать изображения с высоким контрастом при высоких частотах кадров, что проще и дешевле, чем другие методы, такие как DIC и темное поле. Основным преимуществом этой техники является то, что она проста в реализации и проста в использовании. Это недорого, и это может быть объединено с флуоресцентных микроскопов легко.Метод разработан для визуализации отдельных микротрубочек. Он имеет потенциал для визуализации крупных белковых комплексов и наночастиц. Основная трудность заключается в энергии активации, необходимой, чтобы возиться с кубом фильтра, чтобы добавить половину серебряного зеркала.Мой совет тому, кто пытается технику в первый раз просто сделать это. Для начала вставьте зеркало 50/50 в колесо фильтра флуоресцентного микроскопа с помощью соответствующего кубика фильтра. Ручка зеркало с осторожностью, как часто они имеют анти-отражения кодирования.Поверните к высокой цели увеличения, которая также имеет высокую численную диафрагму. Показанная здесь 100-х нефтяная цель с численной диафрагмой 1,3. Далее используйте лезвие бритвы и слайд микроскопа в качестве прямого края, чтобы вырезать три миллиметра в ширину полосы пластиковой парафиновой пленки.Поместите два пластиковых парафиновой пленки полосы три миллиметра друг от друга на чистой 22 на 22 миллиметров крышку скольжения, а затем место 18 на 18 миллиметров крышка скольжения на верхней части полосы, чтобы сформировать канал. Перенесите крышку скольжения в тепловой блок при температуре 100 градусов по Цельсию в течение 10 до 30 секунд для парафиновой пленки, чтобы сформировать запечатанный канал. Используя пипетку, поток в 50 микрограммов на миллилитр анти-родамин антитела перфузии и инкубировать слайд в течение 10 минут.После инкубации, мыть канал пять раз с помощью фильтрованных BRB80, а затем поток в 1%Poloxamer 407 в фильтруемой BRB80, чтобы заблокировать поверхность от неспецифических связывания и инкубировать слайд в течение 10 минут. Опять же, мыть канал пять раз с помощью фильтрованных BRB80. Чтобы предотвратить высыхание образца, добавьте две капли отфильтрованного BRB80 на концах канала и добавьте больше буфера по мере необходимости.Поместите образец на сцену микроскопа и включите источник эпи-освещения. Сосредоточьтесь на краю парафиновой пленки, чтобы найти поверхность образца, а затем переместить поле, чтобы установить вид на центр камеры. Вы будете наблюдать несколько поверхностей, как цель перемещается вверх и вниз из-за обратного отражения света от оптики в оптическом пути.Далее центр поля диафрагмы в поле зрения, закрыв его на полпути и с помощью регулировки винты. После того, как диафрагма правильно выровнены, вновь открыть его. Затем сдвиньте в объектив Бертрана, чтобы просмотреть заднюю фокусную плоскость, также известную как ученик выхода цели.Закройте диафрагму диафрагмы за краями выхода зрачка и используйте винты регулировки для того чтобы центр диафрагмы диафрагмы по отношению к зрачку выхода. Двойная проверка, открыв диафрагму диафрагмы и сопоставляя ее края с краями выхода зрачка. Затем установите диафрагму диафрагмы примерно на две трети численной диафрагмы цели.Для начала установите время экспозиции камеры до 10 миллисекунд и отрегулируйте освещение, чтобы почти насытить динамический диапазон камеры. Далее используйте пипетку для потока в 10 микролитров стабилизированных микротрубочек GMPCPP в 0,22 микрометра отфильтрованного BRB80. Мониторинг связывания микротрубочек на изображении поверхности.После того, как от 10 до 20 микротрубочек связаны в поле зрения, мыть образец дважды с фильтруемой BRB80. Приобрети 10 изображений микротрубочек, установив промежуток времени с 10 миллисекундной экспозицией и один второй период задержки в общей сложности на 10 секунд. Затем приобрети фоновые изображения, перемещая сцену с помощью сценического контроллера вдоль длинной оси канала, приобретая 100 изображений без задержек.Для изображения динамики микротрубочек с помощью трубулина мозга начните с установки температуры нагревателя до 37 градусов по Цельсию. Используя пипетку, поток в 10 микролитров GMPCPP стабилизированных семян микротрубочек и контролировать их связывания с поверхностью путем изображения поверхности жить. После того, как от 10 до 20 семян связаны в поле зрения, мыть образец, используя в два раза объем канала предварительно разогретых и фильтрованных BRB80.Далее, поток в 10 микролитров полимеризации смеси. Для измерения роста микротрубочек найте промежуток времени, используя программное обеспечение для приобретения, чтобы получить изображение каждые пять секунд в течение 15 минут. Увеличь контраст, приобретая усредное изображение 10 в каждой точке времени.Приобретайте фоновые изображения, как показано в предыдущем разделе. Рассчитайте медиану, переехав на изображение, выбрав стек, затем проект, затем медиану. Вычесть соответствующий фон, переходя к обработке, собирается изображение калькулятор, и выбор вычитать из меню высадки.Убедитесь, что 32-битный вариант результата поплавка проверяется. Для усадки микротрубочек приобретайте изображения со 100 кадров в секунду, устанавливая задержку времени до нуля и сохраняя время экспозиции на уровне 10 миллисекунд. Важным фактором для получения высококонтрастных изображений с помощью микроскопии индукции помех является правильное настройка численного отверстия освещения.Это можно сделать, направляя размер луча освещения на выходе зрачка цели, который контролируется размером диафрагмы. Используя образец флуоресцентно помеченных стабилизированных микротрубочек, принесите микротрубоконы в фокус с помощью фокусировки ручки микроскопа в то время как флуоресцентно изображения их. Установите экспозицию камеры до 10 миллисекунд и закройте диафрагму диафрагмы до ее малейшего открытия.Кроме того, отрегулируйте освещение, чтобы почти насытить динамический диапазон камеры или до тех пор, пока не будет достигнут максимум. Приобрети 10 изображений, потоковое поле зрения, содержащее 10 или более микротрубочек. Затем приобрети фоновое изображение.Измените размер диафрагмы и отрегулируйте интенсивность освещения, чтобы соответствовать тем, что было определено ранее. Приобрети 10 новых изображений и новый фон. Повторите этот процесс до тех пор, пока весь диапазон диафрагмы не будет завершен.Для каждого приобретенного поля зрения вычесть соответствующий фон и усредить полученные фоновые вычитаемые изображения, как показано ранее. Затем вычислите среднее отношение сигнала к фоновому шуму микротрубочек для каждого размера отверстия. Установите размер диафрагмы на тот, который производит самый высокий коэффициент шума сигнала к фону.Вполне возможно, что существует целый ряд размеров, которые производят сопоставимый контраст, как показано здесь. С хорошо выровненным микроскопом, микротрубоконы должны быть видны без фонового вычитания. Вычитание фона, однако, повышает контраст микротрубокон.Для дальнейшего повышения контрастности можно использовать фильтрацию в среднем, фильтрацию 4a или их комбинацию. Показанные здесь сканы линии описывают постепенное улучшение качества изображения. Они описывают заметное снижение фонового шума с каждым этапом обработки.Динамика микротрубочек может быть зарегистрирована в кинографах, которые генерируются из фильмов с промежуток времени. Здесь показан пример кинографа, приобретенного со скоростью кадра 0,2 кадра в секунду. Разбитые линии отмечают семена.При выполнении этой процедуры важно работать с высокими целями численной диафрагмы. Также важно правильно выровнять и установить размер каркаса диаметра диафрагмы. Легко сочетать IRM с флуоресцентной визуализацией для изучения, например, микробубульных связывающих белков и того, как они изменяют динамику микротрубочек.Техника значительно снижает урон от фотографий и позволяет получить более высокую частоту кадров, что облегчает изучение помеченных биополимов, таких как микротрубочные устройства в течение длительных периодов времени с высоким временным разрешением и хорошей точностью отслеживания.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Bioengineering

Unit 1

The Cytoskeleton II: Microtubules and Intermediate Filaments

SCIENTISTS IN ACTION

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Бесконтактная, этикетки без мониторинга клеток и внеклеточного матрикса использованием спектроскопии комбинационного

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Визуализация Cortex организация и динамика у микроорганизмов, с помощью микроскопии полного внутреннего отражения флуоресценции

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Микрожидкостных основе Электрохимический Биочип для этикеток без анализа ДНК-гибридизации

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Метку без Методика пространственно-временных изображений из одной клетки секрета

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Этикетка без одной молекулы обнаружения, используя Microtoroid оптических резонаторов

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

High Speed Sub-GHz Spectrometer for Brillouin Scattering Analysis

Высокоскоростной югу ГГц спектрометр для анализа рассеяния Бриллюэна

The goal of this protocol is to build a parallel high-extinction and high-resolution optical Brillouin spectrometer. Brillouin spectroscopy is a ...

A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors

Руководство по Structured Illumination TIRF микроскопией на высокой скорости с несколькими цветами

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular ...

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

PIP-on-a-chip: безвредное исследование взаимодействия протеин-фосфоинозитид

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy

Оценка коллаген и эластин схемотехнические зависящих от давления в артериях живой, человеческий сопротивления по микроскопии флуоресцирования Label бесплатно

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Визуализация адгезии образование в клетках посредством передовых спиннинг диска всего внутреннего отражения микроскопии флуоресцирования

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...