Name: implementation of interference reflection microscopy for label-free, high-speed imaging of microtubules
Uploaded: 2019-08-08T11:30:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Implementation of Interference Reflection Microscopy for Label-free, High-speed Imaging of Microtubules at JoVE.com

Los Autores agradecen a Anna Luchniak y Yin-wei Kuo por la lectura crítica y comentarios sobre el protocolo.

1. Modificación del microscopio y lente objetivo
<ol><li>Inserte un espejo 50/50 en la rueda de filtro del microscopio fluorescente utilizando un cubo de filtro adecuado (Figura1). Manipule el espejo 50/50 con cuidado ya que a menudo tienen recubrimiento antirreflectante. NOTA: Usamos un espejo 50/50 en un cubo de filtro vacío del microscopio. El espejo 50/50 se inserta donde se encuentra el espejo dicroico.</li>
	<li>Utilice un objetivo de alto aumento/aceite de NA alto. NOTA: En este protocolo, utilizamos un objetivo de 100x/1.3 NA.</li>
</ol>2. Preparación de la cámara para adherir microtúbulos a la superficie
<ol><li>Limpie las diapositivas del microscopio y los cubreobjetos de 22 mm x 22 mm (para microscopio vertical) o los cubres de 22 mm x 22 mm y 18 mm x 18 mm (para microscopios invertidos). Modifique la superficie según sea necesario. Por ejemplo, limpie los cubreobjetos con un detergente alcalino (ver Tabla de Materiales)seguido de 100% de etanol con lavados de agua destilados entre y después de11.</li>
	<li>Corte tiras de 3 mm de ancho de película de parafina de plástico (ver Tabla de Materiales)utilizando una cuchilla de afeitar y otra diapositiva de microscopio como borde.</li>
	<li>Coloque dos tiras de película de parafina de plástico de 3 mm de separación en un resbalón de cubierta limpio de 22 x 22 mm. A continuación, coloque un cubreobjetos de 18 mm x 18 mm para formar un canal. Si utiliza un microscopio vertical, coloque las tiras encima de un portaobjetos limpio del microscopio y, a continuación, coloque una cubierta en la parte superior.</li>
	<li>Coloque el cubreobjetos (o deslice) en un bloque de calor a 100 oC durante 10-30 s para que la película de parafina forme un canal sellado.</li>
	<li>Flujo en 50 g/ml de anticuerpo (en Brinkley Buffer 1980 (BRB80)) por perfusión utilizando una pipeta. Incubar durante 10 min. NOTA: Utilizamos anticuerpos anti-rhodamina para unir las semillas de microtúbulos etiquetados con rodamina a la superficie. Alternativamente, la avidina se puede utilizar para unir semillas de microtúbulos etiquetados con biotina o para partículas de oro biotintida. Para simplemente mirar los microtúbulos en ausencia de tubulina en solución (es decir, un ensayo no dinámico), se puede utilizar un anticuerpo anti-tubulina.</li>
	<li>Lave cinco veces con el tampón BRB80. Se recomienda filtrar las soluciones utilizando un filtro de 0,22 m.</li>
	<li>Flujo en 1% poloxámero 407 (un copolímero tribloque) en BRB80 para bloquear la superficie contra la unión no específica. Incubar durante 10 min.</li>
	<li>Lave cinco veces con el tampón BRB80.</li>
	<li>La muestra está lista para ser colocada en el microscopio. Para evitar que la muestra se seque, agregue dos gotas de búfer BRB80 en los extremos del canal y reponga cuando sea necesario.</li>
</ol>3. Alineación del microscopio
<ol><li>Coloque la muestra en la etapa del microscopio. Encienda la fuente de luz epi-iluminación.</li>
	<li>Concéntrese en la superficie de la muestra. Observará múltiples superficies a medida que el objetivo se mueve hacia arriba y hacia abajo debido a la reflexión posterior de la luz de la óptica dentro de la trayectoria óptica. Un buen método para encontrar la superficie de la muestra es centrarse en el borde de la película de parafina. Una vez que se encuentra la superficie, establezca el campo de visión en el centro de la cámara.</li>
	<li>Centra el diafragma de campo en el campo de visión cerrándolo a mitad de camino y usando los tornillos de ajuste. Una vez alineado, vuelva a abrir el diafragma. NOTA: El ajuste del tornillo sólo debe hacerse esporádicamente, tal vez cada 3-6 meses o al solucionar problemas.</li>
	<li>Deslice en la lente Bertrand para ver la pupila de salida (plano focal posterior) del objetivo.</li>
	<li>Cierre el diafragma de apertura (AD) más allá de los bordes de la pupila de salida del objetivo.</li>
	<li>Utilice los tornillos de ajuste para centrar el AD con la pupila de salida. Compruebe dos veces abriendo el AD y haciendo coincidir sus bordes con los de la pupila de salida. NOTA: Este ajuste solo debe realizarse esporádicamente.</li>
	<li>Ajuste el diafragma de apertura a aproximadamente 2/3 de la NA del objetivo. Consulte la sección 7 para conocer los procedimientos detallados para optimizar el diafragma de apertura.</li>
</ol>4. Imágenes de microtúbulos estabilizados o partículas de oro de 40 nm
NOTA: Los microtúbulos estabilizados y las nanopartículas de oro sirven como buenas muestras de control. Se recomienda imágenes de microtúbulos conectados a la superficie o nanopartículas de oro como primer paso para evaluar el rendimiento de IRM y ayudar a establecer la apertura óptima del diafragma de apertura (sección 7).
<ol><li>Ajuste el tiempo de exposición de la cámara a 10 ms y ajuste la iluminación para saturar casi el rango dinámico de la cámara.</li>
	<li>Flujo en 10 l de guanylyl-(alfa, beta)-metileno-difosfonato (GMPCCP)- o microtúbulos estabilizados taxol en BRB804,12,13 (o partículas de oro de 40 nm) por perfusión utilizando una pipeta a una muestra fresca y monitorear unión mediante imágenes de la superficie. Una vez que 10-20 microtúbulos estén unidos dentro del campo de visión, lave la muestra 2x con BRB80. NOTA: Con un microscopio bien alineado, los microtúbulos deben ser visibles sin resta de fondo.</li>
	<li>Adquiera 10 imágenes estableciendo un lapso de tiempo con 1 segundo de retraso durante 10 segundos (a 10 ms de exposición).</li>
	<li>Adquirir una imagen de fondo. Para ello, mueva el escenario utilizando el controlador de escenario o el software informático a lo largo del eje largo del canal mientras adquiere 100 imágenes sin demora (es decir, streaming cerca de 100 fps a 10 ms de exposición). NOTA: El fondo es la mediana de las 100 imágenes. Al tomar la mediana, el perfil de iluminación y otras características estacionarias como la suciedad en la óptica se conservan mientras todo lo demás se filtra. No debe haber ninguna inclinación en la muestra, ya que esto conducirá a cambios en la posición axial a medida que se mueve la etapa y, en última instancia, degradará la imagen de fondo. Si no se puede evitar la inclinación, entonces un método alternativo es adquirir imágenes de fondo promediadas antes de fluir las semillas.</li>
	<li>Para procesar y analizar las imágenes, vaya al paso 6.</li>
</ol>5. Dinámica de microtúbulos de imágenes
<ol><li>Para la dinámica de microtúbulos utilizando tubulina cerebral, ajuste la temperatura del calentador de muestra a 37 oC.</li>
	<li>Flujo en 10 l de semillas de microtúbulos estabilizadas por GMPCCP en BRB8011 por perfusión utilizando una pipeta a una muestra fresca y monitoreelas uniéndose a la superficie mediante imágenes de la superficie en vivo (es decir, mientras se transmite). Una vez que 10-20 semillas estén unidas con campo de visión, lave la muestra utilizando el volumen de canal 2x con BRB80 (BRB80 debe estar precalentado a 37 oC o al menos a temperatura ambiente). NOTA: Con un microscopio bien alineado, las semillas deben ser visibles sin resta de fondo.</li>
	<li>Flujo en la mezcla de polimerización (7,5 m de tubulina sin etiquetar + trifosfato de guanosina de 1 mM (GTP) + 1 mM de ditiothreitol (TDT) en tampón BRB80). Para medir el crecimiento de microtúbulos, establezca un lapso de tiempo utilizando el software de adquisición para adquirir una imagen cada 5 segundos (0,2 fotogramas por segundo (fps)) durante 15 minutos.</li>
	<li>Para mejorar el contraste, adquiera 10 imágenes (en lugar de una) en cada punto de tiempo y promediarlas. Para la contracción del microtúbulo, adquiera imágenes a 100 fps estableciendo el retardo de tiempo en 0 y un tiempo de exposición de 10 ms (es posible fps más altos con regiones de interés más pequeñas dependiendo de la cámara utilizada).</li>
	<li>Adquiera una imagen de fondo como en el paso 4.4.</li>
</ol>6. Procesamiento y análisis de imágenes
NOTA: Para el análisis, este protocolo utiliza Fiji14, pero el lector es libre de utilizar cualquier software que encuentre adecuado.
<ol><li>Abra imágenes de fondo guardadas.</li>
	<li>Calcule la imagen mediana (es decir, fondo) utilizando Imagen > Pila > Proyecto Z > Mediana.</li>
	<li>Abra la película dinámica de microtúbulos como una pila (igual para microtúbulos no dinámicos) utilizando Archivo > Abrir.</li>
	<li>Reste la imagen de fondo de la pila usando Proceso > Calculadorade imagen . Asegúrese de comprobar la opción "32bit (float) result".</li>
	<li>Para microtúbulos dinámicos, utilizando la herramienta de línea dibuje una línea a lo largo del microtúbulo de interés y agréguela al administrador de la región de interés pulsando "t". Repita el procedimiento para todos los microtúbulos de interés.</li>
	<li>Para microtúbulos dinámicos, ejecute la macro Multi-Kymo (Archivocomplementario 1). La macro generará un vídeo y un kymograph para cada microtúbulo en el gestor de ROI. Cada microtúbulo obtendrá un identificador único.</li>
	<li>Para microtúbulos dinámicos, ejecute la macro Kymo-Analysis (Archivocomplementario2) y siga sus pasos para medir las tasas de crecimiento y las tasas de contracción de los microtúbulos.</li>
</ol>7. Tamaño del diafragma de apertura
NOTA: Un factor importante para adquirir imágenes de alto contraste de microtúbulos utilizando IRM es ajustar la apertura numérica de iluminación (INA) correctamente10,15. El INA se puede cambiar cambiando el tamaño del haz de iluminación entrante en la pupila de salida del objetivo que está controlada por el tamaño del AD (el AD se encuentra en un plano conjugado con la pupila de salida (plano focal posterior) del objetivo , Figura 1): <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59520/59520eq1.jpg"> donde DAD es el diámetro del diafragma de apertura, fobjetivo es la longitud focal del objetivo y Dep es el diámetro de la pupila de salida del objetivo. Típicamente, el AD se deja completamente abierto para la imagen de fluorescencia, por lo que el INA es igual a NAdel objetivo. En un microscopio de fluorescencia, la escala AD no indica su diámetro, por lo que el INA no se puede calcular. Es posible calibrar el tamaño de AD con la ayuda de un objetivo. Sin embargo, no es necesario ya que el tamaño de AD se fijaría al tamaño que produce el contraste más alto.
<ol><li>Preparar una muestra de microtúbulos estabilizados etiquetados fluorescentemente pegados a la superficie (pasos 4.1-4.2). NOTA: Utilizamos microtúbulos etiquetados con tetrametilrhodamina16 (Por ejemplo: 550 nm, Em: 580 nm).</li>
	<li>Enfoque microtúbulos utilizando la perilla de enfoque del microscopio mientras los toma imágenes fluorescentes (silos microtúbulos no están etiquetados, infórmelos con IRM15 o DIC 5).</li>
	<li>Establezca la exposición de la cámara a 10 ms utilizando el software de la cámara. NOTA: Esta exposición es arbitraria y una exposición de 100 ms también funcionaría.</li>
	<li>Cierre el AD hasta su abertura más pequeña. Ajuste la iluminación para saturar casi el rango dinámico de la cámara o al máximo posible. NOTA: Como guía, utilice la tabla de búsqueda normalmente proporcionada por el software de adquisición.</li>
	<li>Adquiere 10 imágenes (mediante streaming o toma una imagen cada segundo) de un campo de visión que contiene más de 10 microtúbulos.</li>
	<li>Adquiera una imagen de fondo como en el paso 4.4.</li>
	<li>Cambie el tamaño del AD y repita los pasos 7.5-7.6 para todo el rango de apertura de AD (de cerrado al tamaño de la pupila de salida, Figura 2). Cada vez que se cambia el tamaño de AD, ajuste la intensidad de la iluminación para que coincida con la del paso 7.4.</li>
	<li>Para cada campo de visión adquirido, reste el fondo correspondiente utilizando el proceso > calculadora de imágenes y eligiendo "restar" en el menú desplegable. Asegúrese de que la opción "32bit (float) result" está marcada. A continuación, promedia las imágenes resultantes utilizando imagen > pila > Proyecto Z > promedio.</li>
	<li>Mida la relación señal-ruido de fondo (SBR) de los microtúbulos definidos como la intensidad media de la señal de microtúbulos (intensidad del microtúbulo menos la intensidad del fondo) dividida por la desviación estándar del fondo ( Figura 3).</li>
	<li>Determine el tamaño óptimo de AD (es decir, el INA óptimo) calculando el SBR promedio de los microtúbulos para cada tamaño de apertura y establezca el tamaño AD en el que produce el SBR más alto (Figura2). Es posible que haya una gama de tamaños AD que producen un contraste comparable15.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Widlund, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+purification+of+assembly-competent+tubulin+from+diverse+eukaryotic+sources.">One-step purification of assembly-competent tubulin from diverse eukaryotic sources.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (22), 4393-4401 (2012).</li><li>Walker, R. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+an+optical+microscope+to+0.1+nm+in+three+dimensions.">Stabilization of an optical microscope to 0.1 nm in three dimensions.</a> Appl Opt. 46 (3), 421-427 (2007).</li><li>Limozin, L., Sengupta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Reflection+Interference+Contrast+Microscopy+(RICM)+in+Soft+Matter+and+Cell+Adhesion.">Quantitative Reflection Interference Contrast Microscopy (RICM) in Soft Matter and Cell Adhesion.</a> ChemPhysChem. 10 (16), 2752-2768 (2009).</li></ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Este protocolo demostró el uso exitoso de IRM para la toma de imágenes y la medición de la dinámica de microtúbulos. Se debe tener cuidado de establecer correctamente la apertura numérica de la iluminación, ya que tiene el mayor impacto en el contraste de la imagen. Además, el uso de objetivos de alta apertura numérica (NA) es importante para obtener imágenes de alta resolución/alto contraste, ya que los objetivos NA más altos tienen mayor potencia de recolección de luz en comparación con los objetivos bajos de NA. Cuanto más limpia la superficie y las soluciones utilizaban cuanto menor era el ruido, ya que la suciedad termina adendiendo a la superficie y añadiendo (en el transcurso del experimento) motas como ruido a las imágenes. La adquisición de una imagen de fondo es importante, así como elimina las inhomogeneidades de la iluminación, el ruido estático y las irregularidades superficiales.
Una modificación recomendada es introducir un filtro de paso largo (>600 nm) en la trayectoria de iluminación. El espectro de fuentes de luz blanca normalmente contiene longitudes de onda en los rayos UV que pueden dañar los microtúbulos. Además, el uso de la longitud de onda larga para IRM es útil cuando se combina IRM con fluorescencia (por ejemplo, cuando se estudia el efecto de las proteínas asociadas a microtúbulos (MAPAS) en la dinámica de microtúbulos). Tenga en cuenta que cuando la toma de imágenes para el período de tiempo gastado, la deriva de la muestra (especialmente a lo largo del eje óptico) disminuye el contraste de la imagen debido a la desviación del plano de imagen del plano de fondo. Los microscopios modernos a menudo están equipados con mecanismos de estabilización (por ejemplo, enfoque perfecto (Nikon), Enfoque definitivo.2 (Zeiss), IX3-ZDC2 (Olympus)). Una solución alternativa es estabilizar térmicamente la configuración ya sea pasiva o activamente18 o mediante la corrección para la deriva19,20,21. Por último, el contraste de microtúbulos se puede aumentar reduciendo el tamaño del diafragma de campo (una apertura del 70% es una buena opción, ya que es un equilibrio entre el aumento del contraste y el tamaño del campo de visión)15.
Mientras que IRM es adecuado para la toma de imágenes de microtúbulos no es lo suficientemente sensible para detectar proteínas individuales. Para esta aplicación, iSCAT es una técnica más adecuada. Del mismo modo, la fluorescencia y el iSCAT son más adecuados si se necesita una precisión de seguimiento inferior a 10 nm. Para IRM, la precisión de seguimiento de la longitud medida es de 20 nm, como se muestra en la Figura7.
El uso de IRM en ensayos de superficie puede ir más allá de los microtúbulos; por ejemplo, los motores moleculares pueden etiquetarse con nanopartículas de oro y realizar un seguimiento a medida que interactúan con los microtúbulos. Además, una forma más avanzada de IRM conocida como microscopía de contraste de interferencia reflectante (RICM)22 puede, en principio, utilizarse para mejorar aún más el contraste de microtúbulos y obtener una mayor precisión de seguimiento.

La toma de imágenes sin etiquetas de microtúbulos es de interés, ya que elude la necesidad de etiquetado fluorescente de la tubulina para generar contraste en las imágenes. El etiquetado fluorescente tiene varios inconvenientes: no es factible si la concentración de proteína es baja1 y el fotoblanqueo y el fotodaño limitan el tiempo de observación. Se han utilizado varias técnicas para crear imágenes de microtúbulos sin etiquetas,como la microscopía de contraste de interferencia diferencial mejorada por vídeo (DIC) y la microscopía de campo oscuro 2,3,4,5. Recientemente, también se han utilizado microscopíade dispersión interferométrica (iSCAT) 6, microscopía de dispersión giratoria coherente (ROCS)7 y microscopía de interferencia de luz espacial (SLIM)8. Todas estas técnicas son capaces de tomar imágenes de microtúbulos y han demostrado ser valiosas para estudiar la dinámica de los microtúbulos. Sin embargo, cada uno tiene sus propias limitaciones. En DIC el contraste depende del ángulo entre el microtúbulo y el eje prisma Nomarski.  En el campo oscuro, la señal de microtúbulos se degrada por la luz dispersa de las impurezas o defectos de las superficies. Aunque iSCAT presenta una sensibilidad extraordinaria (hasta proteínas individuales) y ROCS puede crear imágenes de microtúbulos más profundamente en la muestra, ambos métodos son técnicamente exigentes, lo que requiere escáneres láser.
Este protocolo demuestra cómo la microscopía de reflexión de interferencia (IRM)9,10 se puede configurar como una técnica alternativa para la creación de imágenes sin etiquetas de microtúbulos. IRM es fácil de implementar, ya que sólo requiere la adición de un espejo de bajo costo 50/50 a un microscopio fluorescente estándar. Cuando se utiliza junto con el software descrito aquí, IRM produce imágenes de microtúbulos de alto contraste, puede crear imágenes de grandes campos de visión a alta velocidad, requiere una alineación única y se puede combinar fácilmente con otras técnicas como la imagen de fluorescencia.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti-Eclipse</td>
			<td>An inverted microscope used for perfoming the expriments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50/50 beam splitter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>21000</td>
			<td>When buying make sure to choose the splitter dimensions that fit the cube used in the microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIKON PLAN FLUOR 100X/0.5-1.3 Iris objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRH02902</td>
			<td>Imaging objective. This objective has a NA adjusting iris that was opened to NA 1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mucasol universal detergent</td>
			<td>Sigma-aAldrich</td>
			<td>Z637181-2L</td>
			<td>Used for cleaning coverslips and slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic paraffin film (commerical name Parafilm M)</td>
			<td>Sigma-aAldrich</td>
			<td>P7793</td>
			<td>Used for constructing flow channels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TAMRA antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-6397</td>
			<td>Used to bind TAMRA labeled molecules (e.g. microtubules) to the sample surface. RRID (AB_2536196)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poloxamer 407 (commercial name Pluronic F-127)</td>
			<td>Sigma-aAldrich</td>
			<td></td>
			<td>Used for blocking the channel surface to prevent nonspecific binding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 nm gold nanoparticles</td>
			<td>Sigma-aAldrich</td>
			<td>753637</td>
			<td>Used as a control sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 nm gold nanoparticles</td>
			<td>Sigma-aAldrich</td>
			<td>753610</td>
			<td>Used as a control sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zyla 4.2 Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Zyla 4.2</td>
			<td>2048x2048 pixles (6.5&#181;m pixel size) with quantum efficiency of 72% and 16bit dynamic range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feista tracking software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://www.bcube-dresden.de/fiesta/wiki/FIESTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stabilized microtubles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>prepared in house (see references in text)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implementation of interference reflection microscopy for label-free, high-speed imaging of microtubules

Existen varios métodos para visualizar biomoléculas purificadas cerca de superficies. La microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) es un método comúnmente utilizado, pero tiene el inconveniente de que requiere etiquetado fluorescente, que puede interferir con la actividad de las moléculas. Además, el fotoblanqueo y el fotodaño son preocupaciones. En el caso de los microtúbulos, hemos descubierto que se pueden obtener imágenes de calidad similar a TIRF utilizando microscopía de reflexión de interferencia (IRM). Esto sugiere que IRM podría ser una técnica general para visualizar la dinámica de grandes biomoléculas y oligómeros in vitro. En este artículo, mostramos cómo se puede modificar un microscopio de fluorescencia simplemente para obtener imágenes IRM. IRM es más fácil y considerablemente más barato de implementar que otras técnicas de contraste como la microcopia de contraste de interferencia diferencial o la microscopía de dispersión interferométrica. También es menos susceptible a defectos superficiales y impurezas de la solución que la microscopía de campo oscuro. Utilizando IRM, junto con el software de análisis de imágenes descrito en este documento, el campo de visión y la velocidad de fotogramas están limitados únicamente por la cámara; con una cámara sCMOS y una longitud de microtúbulo de iluminación de campo ancho se puede medir con una precisión de hasta 20 nm con un ancho de banda de 10 Hz.

Como se mencionó anteriormente, con un microscopio bien alineado, los microtúbulos deben ser visibles sin resta de fondo (Figura4A). Restar el fondo (Figura4B) mejora el contraste del microtúbulo (Figura4C). Para mejorar aún más el contraste, se puede utilizar un promedio o un filtrado de Fourier o una combinación de ambos (Figura 4D, F,E). Los escaneos de línea en la Figura 4G muestran la mejora incremental de la calidad de imagen. Observe la reducción del ruido de fondo con cada paso de procesamiento.
En la Figura 5se muestran ejemplos de kymographs de dinámica de microtúbulos generados a partir de películas de lapso de tiempo. Los vídeos fueron adquiridos a dos velocidades de fotogramas: 0,2 fps (lento) y 100 fps (rápido). El primero es adecuado para medir las tasas de crecimiento, mientras que el segundo es más adecuado para medir la tasa de contracción que es un orden de magnitud más rápido que la tasa de crecimiento.
Para el caso en el que se utilizan nanopartículas de oro para configurar el microscopio, se muestra una imagen de ejemplo en la Figura6. Las nanopartículas de oro estaban pasivamente unidas a la superficie. Mientras que se recomiendan partículas de 40 nm, también es posible crear imágenes de partículas de 20 nm, pero con un contraste más bajo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59520/59520fig1.jpg"> Figura 1. Representación esquemática de IRM. (A) La epi-iluminación de la fuente de luz pasa a través del diafragma de apertura antes de llegar al espejo 50/50. El diafragma de apertura establece el ancho del haz por lo tanto la iluminación NA. El espejo 50/50 refleja parcialmente la luz hasta el objetivo de iluminar la muestra. La luz reflejada de la muestra se recoge y luego se proyecta sobre el chip de la cámara (por la lente del tubo) donde interfiere para generar la imagen. El contraste de imagen es el resultado de la interferencia entre la luz reflejada desde la interfaz de vidrio/agua (I1) y la luz reflejada desde la interfaz agua/microtúbulos (I2). Dependiendo del microtúbulo/distancia superficial (h), la diferencia de trayectoria óptica entre I1 e I2 dará como resultado una señal constructiva (señal brillante) o destructiva (señal oscura) o cualquier cosa en el medio. Por ejemplo, si se utiliza luz con una longitud de onda de 600 nm para la toma de imágenes, el contraste cambiará entre oscuro y brillante cuando la altura del microtúbulo cambie en aproximadamente 100 nm. El asterisco indica planos conjugados (modificados a partir de15). (B) Ejemplo de la instalación del espejo 50/50. Se abrió un cubo de filtro adecuado y se insertó el espejo donde normalmente se sienta un espejo dicroico. El espejo estaba orientado según las instrucciones del fabricante. A continuación, se insertó el cubo en la rueda del filtro que se insertó de nuevo en el microscopio (no se muestra). Durante la instalación, se utilizaron guantes, y el espejo sólo se sostuvo por los bordes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/59520fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59520/59520fig2.jpg"> Figura 2. Ajuste óptimo del diafragma de apertura. (A) El mismo campo de visión se imageó en diferentes aberturas de diafragma de apertura sin resta de fondo. Visualmente, el contraste aumentó a medida que el tamaño del diafragma de apertura aumentaba hasta llegar a una meseta y comenzaba a degradarse después. Esto fue confirmado por mediciones (B) SBR de imágenes restadas de fondo. Las barras de error son desviación estándar.  Las barras de escala son de 500 m (AD) y 3 m (microtúbulos). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/59520fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59520/59520fig3.jpg"> Figura 3. Medición de la relación señal-fondo de ruido. Los microtúbulos estaban aislados en regiones de interés. Cada región de interés fue umbral para separar el microtúbulo del fondo. La señal media de microtúbulos se obtuvo de una exploración de línea a través del microtúbulo. El ancho de la línea de escaneado se estableció para ser igual a la longitud del microtúbulo. De esta manera, cada punto en el escaneo es un promedio de las señales de todos los píxeles a lo largo del eje del microtúbulo que son paralelas a ese punto. El ruido de fondo es la desviación estándar de todos los píxeles por debajo del umbral cortado.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/59520fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59520/59520fig4.jpg"> Figura 4. Procesamiento de imágenes. Después de adquirir imágenes en bruto (A),se restó el fondo (B) (C) para mejorar el contraste del microtúbulo. Para mejorar aún más el contraste, las imágenes se promediaron (D) o Cuatromás se filtraron (E) o ambas (F). Los escaneos de línea (G),cuya ubicación se indica mediante la línea roja discontinua en (A) coinciden con el color de las distintas imágenes de (A) a (F). Los números en la esquina inferior son SBÁR promedio medidos para todo el campo de visión. La barra de escala es de 5 m (modificada a partir de15) . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/59520fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59520/59520fig5.jpg"> Figura 5. Ejemplos de kymographs. (A) Ejemplos de Kymograph de dinámica de microtúbulos generados a partir de películas de lapso de tiempo adquiridas a 0,2 fps. (B) Kymograph que representa un ejemplo de un evento de contracción generado a partir de una película adquirida a 100 fps. Las líneas discontinuas marcan las semillas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/59520fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59520/59520fig6.jpg"> Figura 6. Ejemplo de nanopartículas de oro con IRM. Las nanopartículas de oro de los tamaños 20 y 40 nm se unieron pasivamente a la superficie. Se adquirieron 10 imágenes. Después de la resta de fondo, las imágenes se promediaron para mejorar el contraste. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/59520fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59520/59520fig7.jpg"> Figura 7. Longitud del microtúbulo Precisión de seguimiento en imágenes IRM. Los microtúbulos estabilizados (es decir, longitudes fijas) fueron representados 200 veces a 100 fps y luego promediados a 10 fps para mejorar el contraste. A continuación, las longitudes de los microtúbulos se midieron utilizando el software de seguimiento Fiesta17. Para cada microtúbulo, la longitud media y la desviación estándar se calcularon como se muestra en la figura (la línea discontinua representa la media y las líneas rojas sólidas representan la desviación estándar, la longitud a 3971 a 20 nm. La precisión de seguimiento general fue el promedio de la desviación estándar de todos los microtúbulos rastreados (n a 6 microtúbulos x 20 puntos de datos a 120 puntos de datos). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/59520fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Archivo Suplementario 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/Multi_Kymo.ijm" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a> 
Archivo Suplementario 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59520/Kymo_Analysis.ijm" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

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Implementation of Interference Reflection Microscopy for Label-free, High-speed Imaging of Microtubules

Este protocolo es una guía para implementar microscopía de reflexión de interferencia en un microscopio de fluorescencia estándar para imágenes de alta velocidad, sin etiquetas y de alto contraste de microtúbulos mediante ensayos de superficies in vitro.

Implementación de microscopía de reflexión de interferencias para imágenes de microtúbulos sin etiquetas y de alta velocidad

There are several methods for visualizing purified biomolecules near surfaces. Total-internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a commonly used ...

La importancia de este protocolo es que introduce una técnica de imagen sin etiquetas capaz de adquirir imágenes de alto contraste a altas velocidades de fotogramas que es más simple y más barata que otras técnicas como DIC y campo oscuro. La principal ventaja de esta técnica es que es fácil de implementar y es fácil de usar. Es barato y se puede combinar con microscopios de fluorescencia fácilmente.El método fue desarrollado para visualizar microtúbulos individuales. Tiene el potencial de ser utilizado para visualizar grandes complejos proteicos y nanopartículas. La principal dificultad es la energía de activación necesaria para jugar con el cubo de filtro para añadir el espejo de media plata.Mi consejo a alguien que está probando la técnica por primera vez es simplemente hacerlo. Para empezar, inserte un espejo 50/50 en la rueda de filtro de un microscopio fluorescente utilizando un cubo de filtro adecuado. Manipule el espejo con cuidado, ya que a menudo tienen una codificación antirreflejo.Gire a un objetivo de gran magnificación que también tiene una alta apertura numérica. El que se muestra aquí es un objetivo de aceite 100x con una apertura numérica de 1.3. A continuación, utilice una cuchilla de afeitar y un portaobjetos de microscopio como borde recto para cortar tiras de tres milímetros de ancho de película de parafina de plástico.Coloque dos de las tiras de película de parafina de plástico de tres milímetros de separación en un resbalón de cubierta limpio de 22 por 22 milímetros, luego coloque un resbalón de cubierta de 18 por 18 milímetros en la parte superior de las tiras para formar un canal. Transfiera el resbalón de la cubierta a un bloque de calor a 100 grados centígrados durante 10 a 30 segundos para que la película de parafina forme un canal sellado. Con una pipeta, fluya en 50 microgramos por mililitro de un anticuerpo anti-rhodamina por perfusión e incubar el portaobjetos durante 10 minutos.Después de la incubación, lave el canal cinco veces usando BRB80 filtrado, luego fluya en 1%Poloxamer 407 en el BRB80 filtrado para bloquear la superficie contra la unión no específica e incubar el portaobjetos durante 10 minutos. Una vez más, lave el canal cinco veces utilizando BRB80 filtrado. Para evitar que la muestra se seque, agregue dos gotas del BRB80 filtrado en los extremos del canal y agregue más búfer según sea necesario.Coloque la muestra en la etapa del microscopio y encienda la fuente de luz de epiiluminación. Concéntrese en el borde de la película de parafina para encontrar la superficie de la muestra y, a continuación, mueva el campo para establecer la vista en el centro de la cámara. Observará varias superficies a medida que el objetivo se mueve hacia arriba y hacia abajo debido a la reflexión posterior de la luz de la óptica dentro de la trayectoria óptica.A continuación, centra el diafragma de campo en el campo de visión cerrándolo hasta la mitad y usando los tornillos de ajuste. Una vez que el diafragma esté correctamente alineado, vuelva a abrirlo. A continuación, deslice en la lente Bertrand para ver el plano focal posterior, también conocido como el pupilo de salida del objetivo.Cierre el diafragma de apertura más allá de los bordes de la pupila de salida y utilice los tornillos de ajuste para centrar el diafragma de apertura con respecto a la pupila de salida. Compruebe dos veces abriendo el diafragma de apertura y combinando sus bordes con los de la pupila de salida. A continuación, establezca el diafragma de apertura en aproximadamente dos tercios de la apertura numérica del objetivo.Para comenzar, ajuste el tiempo de exposición de la cámara a 10 milisegundos y ajuste la iluminación para que casi satura el rango dinámico de la cámara. A continuación, utilice una pipeta para fluir en 10 microlitros de microtúbulos estabilizados con GMPCPP en 0,22 micrómetros filtrados BRB80. Supervise la unión de microtúbulos en la toma de imágenes de la superficie.Una vez que se atado de 10 a 20 microtúbulos dentro del campo de visión, lave la muestra dos veces con el BRB80 filtrado. Adquiera 10 imágenes de los microtúbulos configurando un lapso de tiempo con una exposición de 10 milisegundos y un segundo de retardo para un total de 10 segundos. A continuación, adquiera imágenes de fondo moviendo el escenario utilizando el controlador de escenario a lo largo del eje largo del canal mientras adquiere 100 imágenes sin demora.Para tomar imágenes de la dinámica de los microtúbulos utilizando la tubulina cerebral, comience por ajustar la temperatura del calentador de muestra a 37 grados centígrados. Con una pipeta, fluya en 10 microlitros de semillas de microtúbulos estabilizadas por GMPCPP y monitoríelos uniéndose a la superficie mediante imágenes de la superficie en vivo. Una vez que se atado de 10 a 20 semillas dentro del campo de visión, lave la muestra utilizando el doble del volumen del canal de BRB80 precalegado y filtrado.A continuación, fluya en 10 microlitros de la mezcla de polimerización. Para medir el crecimiento de los microtúbulos, configure un lapso de tiempo utilizando el software de adquisición para adquirir una imagen cada cinco segundos durante 15 minutos. Mejore el contraste adquiriendo una imagen promediada de 10 en cada punto de tiempo.Adquiera imágenes de fondo como se muestra en la sección anterior. Calcule la mediana yendo a la imagen, seleccionando stack, luego el proyecto Z y, a continuación, mediana. Restar el fondo correspondiente yendo a procesar, yendo a la calculadora de imágenes, y eligiendo restar del menú desplegable.Asegúrese de que la opción de resultado flotante de 32 bits esté marcada. Para la contracción de microtúbulos, adquiera imágenes a 100 fotogramas por segundo ajustando el retardo de tiempo a cero y manteniendo el tiempo de exposición en 10 milisegundos. Un factor importante para adquirir imágenes de alto contraste con la microscopía de inducción de interferencia es ajustar correctamente la apertura numérica de la iluminación.Esto se puede hacer guiando el tamaño del haz de iluminación en la pupila de salida del objetivo, que es controlado por el tamaño del diafragma de apertura. Usando una muestra de microtúbulos estabilizados con etiqueta florescente, ponga los microtúbulos en foco usando la perilla de enfoque del microscopio mientras los toma imágenes fluorescentes. Establezca la exposición de la cámara en 10 milisegundos y cierre el diafragma de apertura a su abertura más pequeña.Además, ajuste la iluminación para casi saturar el rango dinámico de la cámara o hasta que se alcance el máximo. Adquiera 10 imágenes transmitiendo un campo de visión que contenga 10 o más microtúbulos. A continuación, adquiera una imagen de fondo.Cambie el tamaño del diafragma y ajuste la intensidad de la iluminación para que coincida con la que se determinó anteriormente. Adquiere 10 nuevas imágenes y un nuevo fondo. Repita este proceso hasta que se complete todo el rango del diafragma.Para cada campo de visión adquirido, reste el fondo correspondiente y promediar el fondo resultante restado imágenes como se muestra anteriormente. A continuación, calcule la relación señal media a ruido de fondo de los microtúbulos para cada tamaño de apertura. Ajuste el tamaño del diafragma a la que produce la relación señal-ruido de fondo más alta.Es posible que haya una gama de tamaños que produzcan un contraste comparable como se muestra aquí. Con un microscopio bien alineado, los microtúbulos deben ser visibles sin resta de fondo. La restación del fondo, sin embargo, mejora el contraste del microtúbulo.Para mejorar aún más el contraste, se puede utilizar un promedio, un filtrado de 4a o una combinación de ambos. Los escaneos de línea que se muestran aquí describen la mejora incremental de la calidad de la imagen. Estos describen una reducción notable del ruido de fondo con cada paso de procesamiento.La dinámica de los microtúbulos se puede notificar en los quirógrafos, que se generan a partir de películas de lapso de tiempo. Aquí se muestra un metógrafo de ejemplo adquirido a una velocidad de fotogramas de 0,2 fotogramas por segundo. Las líneas discontinuas marcan las semillas.Al realizar este procedimiento, es importante trabajar con objetivos de apertura numérica alta. También es importante alinear y establecer el tamaño del marco del diámetro de la abertura correctamente. Es fácil combinar IRM con imágenes de fluorescencia para estudiar, por ejemplo, proteínas de unión a microtúbulos y cómo modifican la dinámica de microtúbulos.La técnica reduce considerablemente el daño fotográfico y permite una mayor adquisición de la velocidad de fotogramas, lo que facilita el estudio de biopolímeros etiquetados como microtúbulos durante largos períodos de tiempo con alta resolución temporal y buena precisión de seguimiento.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Bioengineering

Unit 1

The Cytoskeleton II: Microtubules and Intermediate Filaments

SCIENTISTS IN ACTION

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Sin contacto, libre de marca Seguimiento de células y matriz extracelular utilizando espectroscopia Raman

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Investigación

Bioingeniería

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

La visualización de la corteza organización y dinámica de los microorganismos, con total Microscopía de fluorescencia de reflexión interna

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A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Un biochip electroquímico basado en microfluidos para el análisis de hibridación ADN-Label libre

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Una técnica-Label libre para el Imaging espacio-temporal de las secreciones sola célula

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Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Individual Detección Molecule-Label gratis con Microtoroid ópticos Resonadores

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Alta velocidad Espectrómetro Sub-GHz para el Análisis de Dispersión de Brillouin

The goal of this protocol is to build a parallel high-extinction and high-resolution optical Brillouin spectrometer. Brillouin spectroscopy is a ...

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