Name: genotyping of sea anemone during early development
Uploaded: 2019-05-13T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genotyping of Sea Anemone during Early Development at JoVE.com

نشكر المراجعين المجهولين على تعليقاتهم على النسخة السابقة من المخطوطة، التي حسنت المخطوطة. وقد تم دعم هذا العمل بأموال من جامعة أركنساس.

1. تحريض التفريخ، والإخصاب في المختبر، وإزالة هلام
<ol><li>الحفاظ على vectensis Nematostella في مياه البحر مع ملوحة من 12 أجزاء في الألف (ppt) في الظلام في 16 درجة مئوية، وتغذية Artemia يوميا.</li>
	<li>في اليوم السابق للتفريخ التعريفي، ضع الحيوانات في حاضنة تعمل بدرجة الحرارة والضوء. برنامج الحاضنة ?...

<ol>
	<li>Medina, M., Collins, A. G., Silberman, J. D., Sogin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+hypotheses+of+basal+animal+phylogeny+using+complete+sequences+of+large+and+small+subunit+rRNA.">Evaluating hypotheses of basal animal phylogeny using complete sequences of large and small subunit rRNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9707-9712 (2001).</li><li>Erwin, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cambrian+Conundrum:+Early+Divergence+and+Later+Ecological+Success+in+the+Early+History+of+Animals.">The Cambrian Conundrum: Early Divergence and Later Ecological Success in the Early History of Animals.</a> Science. 334 (6059), 1091-1097 (2011).</li><li>Putnam, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sea+anemone+genome+reveals+ancestral+eumetazoan+gene+repertoire+and+genomic+organization.">Sea anemone genome reveals ancestral eumetazoan gene repertoire and genomic organization.</a> Science. 317 (5834), 86-94 (2007).</li><li>Magie, C. R., Daly, M., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrulation+in+the+cnidarian+Nematostella+vectensis+occurs+via+invagination+not+ingression.">Gastrulation in the cnidarian Nematostella vectensis occurs via invagination not ingression.</a> Developmental Biology. 305 (2), 483-497 (2007).</li><li>Nakanishi, N., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+knockouts+reveal+an+endogenous+role+for+ancient+neuropeptides+in+regulating+developmental+timing+in+a+sea+anemone.">CRISPR knockouts reveal an endogenous role for ancient neuropeptides in regulating developmental timing in a sea anemone.</a> eLife. 7, e39742 (2018).</li><li>He, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+axial+Hox+code+controls+tissue+segmentation+and+body+patterning+in+Nematostella+vectensis.">An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis.</a> Science. 361 (6409), 1377 (2018).</li><li>Ikmi, A., McKinney, S. A., Delventhal, K. M., Gibson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TALEN+and+CRISPR/Cas9-mediated+genome+editing+in+the+early-branching+metazoan+Nematostella+vectensis.">TALEN and CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the early-branching metazoan Nematostella vectensis.</a> Nature Communications. 5, 5486 (2014).</li><li>Servetnick, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9-mediated+excision+of+Nematostella+brachyury+disrupts+endoderm+development,+pharynx+formation+and+oral-aboral+patterning.">Cas9-mediated excision of Nematostella brachyury disrupts endoderm development, pharynx formation and oral-aboral patterning.</a> Development. 144 (16), 2951-2960 (2017).</li><li>Kraus, Y., Aman, A., Technau, U., Genikhovich, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-bilaterian+origin+of+the+blastoporal+axial+organizer.">Pre-bilaterian origin of the blastoporal axial organizer.</a> Nature Communications. 7, 11694 (2016).</li><li>Fritzenwanker, J. H., Genikhovich, G., Kraus, Y., Technau, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+development+and+axis+specification+in+the+sea+anemone+Nematostella+vectensis.">Early development and axis specification in the sea anemone Nematostella vectensis.</a> Developmental Biology. 310 (2), 264-279 (2007).</li><li>Lee, P. N., Kumburegama, S., Marlow, H. Q., Martindale, M. Q., Wikramanayake, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+developmental+potential+along+the+animal-vegetal+axis+in+the+anthozoan+cnidarian,+Nematostella+vectensis,+is+mediated+by+Dishevelled.">Asymmetric developmental potential along the animal-vegetal axis in the anthozoan cnidarian, Nematostella vectensis, is mediated by Dishevelled.</a> Developmental Biology. 310 (1), 169-186 (2007).</li><li>Shinzato, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+Acropora+digitifera+genome+to+understand+coral+responses+to+environmental+change.">Using the Acropora digitifera genome to understand coral responses to environmental change.</a> Nature (London). 476 (7360), 320-323 (2011).</li><li>Gold, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+the+jellyfish+Aurelia+and+the+evolution+of+animal+complexity.">The genome of the jellyfish Aurelia and the evolution of animal complexity.</a> Nature Ecology &#38; Evolution. 3 (1), 96-104 (2019).</li><li>Clevesa, P. A., Strader, M. E., Bay, L. K., Pringle, J. R., Matz, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+genome+editing+in+a+reef-building+coral.">CRISPR/Cas9-mediated genome editing in a reef-building coral.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (20), 5235-5240 (2018).</li><li>Momose, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+doses+of+CRISPR/Cas9+ribonucleoprotein+efficiently+induce+gene+knockout+with+low+mosaicism+in+the+hydrozoan+Clytia+hemisphaerica+through+microhomology-mediated+deletion.">High doses of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein efficiently induce gene knockout with low mosaicism in the hydrozoan Clytia hemisphaerica through microhomology-mediated deletion.</a> Scientific Reports. 8, 11734 (2018).</li><li>Artigas, G. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gonad-expressed+opsin+mediates+light-induced+spawning+in+the+jellyfish+Clytia.">A gonad-expressed opsin mediates light-induced spawning in the jellyfish Clytia.</a> eLife. 7, e29555 (2018).</li></ol>

وصف هنا بروتوكول يستند إلى PCR إلى النمط الجيني لجنين النعمان البحر واحد دون التضحية الحيوان. بعد التفريخ وإزالة هلام، يسمح للبيض المخصبة أن تتطور إلى gastrulae. تتم إزالة المنطقة الأبالة لكل جنين غازيولا جراحيا، ويستخدم الأنسجة الأبوروفال المعزولة لاستخراج الحمض النووي الجيني اللاحقة، في حي?...

يمثل الكنيداريون مجموعة متنوعة من الحيوانات التي تشمل قنديل البحر والشعاب المرجانية وشاطئ النعمان البحري. وهي ثنائية الخلايا، تتكون من ectoderm وendoderm التي يتم فصلها بواسطة مصفوفة خارج الخلية (mesoglea). Cnidaria هي مجموعة شقيقة لspeciose Bilateria، والتي نماذج الحيوانات التقليدية مثل دروسوفيلا وموس تنتمي1. بالإضافة إلى ذلك، يعتقد أن الاختلاف Cnidaria-Bilateria قد حدث في فترة ما قبل الكمبري2. وعلى هذا النحو، فإن الدراسات المقارنة للسكانيين والبلاتيريين ضرورية للحصول على رؤى في بيولوجيا أسلافهم المشتركين الأحدث. في الآونة الأخيرة، كشفت علم الجينوم المقارن أن cnidarians وbilaterians حصة العديد من الجينات مجموعة أدوات التنمية مثل الشق وbHLH، مما يعني أن أسلافهم المشتركة لديها بالفعل هذه الجينات3. ومع ذلك، فإن دور هذه الجينات مجموعة أدوات التنمية في السلف المشترك الأخير من Cnidaria وBilateria هو أقل فهما بالمقارنة جيدا. ولمعالجة هذه المشكلة، من الأهمية بمكان دراسة كيفية عمل هذه الجينات المحفوظة بعمق في الكنيداريين.
واحدة من النماذج الوراثية cnidarian الناشئة هو الأنثوزون نيماتوستيلا vectensis. وقد تم تسلسل الجينوم3، ومجموعة متنوعة من الأدوات الوراثية ، بما في ذلك المورفولينول بوساطة الجينات بالضربة القاضية ، وtransgenesuclease بوساطة transgenes ، وكريسبر-Cas9 بوساطة الجينات knockins وخروج المغلوب ، متاحة الآن للاستخدام في هذا الحيوان. وبالإضافة إلى ذلك، فإن تطوير نيماتوستيلا مفهوم بشكل جيد نسبيا. أثناء تكوين الجنين، يحدث التطفل عن طريق المهبل4، ويتطور الجنين إلى يرقة بلنبولا السباحة الحرة. وتتحول البلنة في وقت لاحق إلى ورم مسيل مع الفم والمخالب المحيطة. ثم ينمو ورم ويصل إلى النضج الجنسي.
كريسبر-Cas9 بوساطة الطفرات المستهدفة يستخدم الآن بشكل روتيني لدراسة وظيفة الجينات في نيماتوستيلا vectensis5,6,7,8,9. لتوليد متحولين بالضربة القاضية في Nematostella، يتم حقن كوكتيل يحتوي على locus محددة واحدة دليل RNAs والبروتين Cas9 endonuclease لأول مرة في البيض غير المخصبة أو المخصبة لإنتاج الحيوانات مؤسس F0 التي تظهر عادة الفسيفساء. يتم رفع الحيوانات F0 في وقت لاحق إلى النضج الجنسي وعبرت مع بعضها البعض لإنتاج السكان F1، مجموعة فرعية منها قد تكون متحولة بالضربة القاضية6. بدلا من ذلك، يمكن عبور الحيوانات F0 ناضجة جنسيا مع الحيوانات البرية من نوع لتوليد الحيوانات Heterozygous F1، وF1 heterozygotes التي تحمل أليل بالضربة القاضية في موضع الاهتمام يمكن بعد ذلك أن عبرت مع بعضها البعض لإنتاج ذرية F2، ربع منها من المتوقع أن تكون متحولة بالضربة القاضية5. ويتطلب كلا النهجين طريقة لتحديد المتحولين بالضربة القاضية من السكان غير المتجانسين وراثيا. يمكن استخدام مخالب البولي لاستخراج الحمض النووي الجينيللكتابة الجينية 6،7. ومع ذلك، في الحالات التي يتم فيها التحقيق في الوظيفة التنموية لجين الاهتمام ولا تصل الأجنة المتحولة إلى مرحلة البول (أي بسبب فتك اليرقات المرتبطة بالطفرة)، يجب تحديد المتحولين بالضربة القاضية في وقت مبكر من الأنطوجيني. يوصف هنا هو بروتوكول يستند إلى PCR للالحيوانات الفردية النمط الجيني في مرحلة gastrula دون التضحية الحيوان، والتي تمكن من تحديد المتحولين بالضربة القاضية من مجموعة غير متجانسة وراثيا من الأجنة. تعتمد مدة عملية الكتابة الجينية بأكملها على عدد الأجنة التي سيتم فحصها، ولكنها تتطلب الحد الأدنى 4-5 ساعة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Drosophila Peltier Refrigerated Incubator</td>
			<td>Shellab</td>
			<td>SRI6PF</td>
			<td>Used for spawning induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant ocean sea salt</td>
			<td>Instant ocean</td>
			<td>138510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brine shrimp cysts</td>
			<td>Aquatic Eco-Systems, Inc.</td>
			<td>BS90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine Hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Orbital Shaker, Model 3500</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS-HCl, 1M, pH8.0</td>
			<td>QUALITY BIOLOGICAL</td>
			<td>351-007-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, 0.5M pH8</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7830-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet-P40 Substitute</td>
			<td>US Biological</td>
			<td>N3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K solution (20 mg/mL), RNA grade</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25530049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting needle holder</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten dissecting needle</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Eppendorf Mastercycler Thermal Cyclers</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>E6336000024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N0447L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLWamide universal forward primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse primer specific to glw-a</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-CCAGATGCCTGGTGATAC-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse primer specific to glw-c </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;- CGGCCGGCGCATATATAG-3&#8217;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genotyping of sea anemone during early development

يوصف هنا بروتوكول يستند إلى PCR للنمط الجيني للجنين مرحلة gastrula من الأنثوزون نيماتوستيلا vectensis دون التضحية بحياة الحيوان. بعد الإخصاب في المختبر وإزالة هلام، يسمح zygotes لتطوير لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة للوصول إلى مرحلة مبكرة إلى منتصف gastrula. ثم توضع أجنة غازترولا على سرير جل أغاروز في طبق بيتري يحتوي على مياه البحر. تحت المجهر تشريح، يتم استخدام إبرة التنغستن لفصل جراحيا جزء من الأنسجة الأبال من كل جنين. ثم يسمح للأجنة بعد الجراحة بالشفاء ومواصلة النمو. يتم استخراج الحمض النووي الجينومي من جزء الأنسجة المعزولة واستخدامه كقالب لPCR خاص بالموقع. ويمكن تحديد النمط الجيني على أساس حجم منتجات PCR أو وجود/عدم وجود منتجات PCR الخاصة بالأليل. ثم يتم فرز الأجنة بعد الجراحة وفقا للنمط الجيني. تعتمد مدة عملية الكتابة الجينية بأكملها على عدد الأجنة التي سيتم فحصها، ولكنها تتطلب الحد الأدنى 4-5 ساعة. ويمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد المتحولين بالضربة القاضية من مجموعة غير متجانسة وراثيا من الأجنة وتمكن من تحليل الأنماط الظاهرية أثناء التنمية.

جينوم نيماتوسلا لديه موضع واحد أن ترميز بروتين السلائف لGLWamide neuropeptide. وقد تم الإبلاغ عن ثلاثة أليليس متحولة بالضربة القاضية في هذا المكان(glw-a,glw-b,وglw-c) سابقا5. أربعة ذكور heterozygous تحمل أليل البرية من نوع (+) وخروج المغلوب أليل GLW<s...

Watch this Scientific Journal Video about Genotyping of Sea Anemone during Early Development at JoVE.com

Genotyping of Sea Anemone during Early Development

الكتابة الجينية لعنابة النعمان البحرية خلال التنمية المبكرة

والهدف من هذا البروتوكول هو النمط الجيني لداء النعمان البحر نيماتوستيلا vectensis أثناء التطفل دون التضحية بالجنين.

Described here is a PCR-based protocol to genotype the gastrula stage embryo of the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis without sacrificing the ...

يمكّن هذا البروتوكول الباحث من تحديد النيمونات البحرية المتحولة أثناء تولد الأجنة المبكر بحيث يمكن تحليل النمط الظاهري التنموي بعد الجنين. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن استخدامها لأسلوب الحياة البحرية الفردية في وقت مبكر من التناضح دون التضحية بحياة الحيوان. ومن خلال هذا الإجراء، سيكون ميغيل سيلفا، وهو طالب دراسات عليا من مختبري.في اليوم السابق لتفريخ الحث ، ضع نزعة النعمة الخيطية في vectenella في حاضنة درجة الحرارة والضوء ، وبرمجة الحاضنة بحيث تتعرض الحيوانات لثماني ساعات من الضوء عند 25 درجة مئوية. في اليوم التالي، إزالة الحيوانات من الحاضنة وتركها على مقاعد البدلاء في درجة حرارة الغرفة مع الضوء على للسماح بالتفريخ، والتي سوف تحدث في غضون ساعة ونصف إلى ساعتين التالية. استخدم ماصة نقل يتم قطع طرف لتكبير الفتحة لوضع حزم البويضات من حاوية الإناث إلى حاوية ذكور تحتوي على الحيوانات المنوية وتركها في حاوية الذكور لمدة 15 دقيقة على الأقل للسماح بالتخصيب.بعد الإخصاب ، إلى dejelly حزم البيض ، ووضعها في مياه البحر التي تحتوي على 3 ٪ السيستين على طبق بيتري الزجاج والتحريض بلطف على شاكر لمدة 12 دقيقة. ثم تفريق كتل مع ماصة بلاستيكية والاستمرار في التحريض لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق أخرى حتى dejellied تماما. الحفاظ على البيض المخصب على نفس الطبق في 16 درجة مئوية أو في درجة حرارة الغرفة.في اليوم التالي، قم بإعداد العازلة استخراج الحمض النووي كما هو موضح في المخطوطة، وخلط جيدا من قبل دوامة، و aliquot ذلك في أنابيب PCR عن طريق إضافة 20 ميكرولترات لكل أنبوب. تذوب 1٪ agarose في مياه البحر، وتصب في طبق بيتري لتغطية الجزء السفلي، وتبرد على أعلى مقاعد البدلاء لجعل سرير هلام. غطي سرير الجل بمياه البحر العذبة.نقل الأجنة ما بعد الإخصاب على مدار 24 ساعة باستخدام ماصة في طبق بيتري الذي يحتوي على هلام agarose. إدراج إبرة التنغستن في حامل الحاجة وتعقيم عن طريق غمس طرف في الكحول ووضعه في اللهب لحرق الكحول. تحت مجهر تشريح، وجعل الاكتئاب على agarose باستخدام إبرة التنغستن لإزالة قطعة من أغاروز السطح حول حجم الجنين ليتم التلاعب بها.ثم، باستخدام إبرة التنغستن، وضع الجنين في الاكتئاب مع الجانب الجانبي التي تواجه لأسفل من أجل تقييد حركة الجنين لجراحة الميكروستور. من أجل إجراء جراحة ناجحة ، من المهم تقييد حركة الجنين. مع إبرة التنغستن ، قم بإزالة قطعة من الأنسجة البورال جراحيًا على طول محور البورال الفموي ، وتقع مقابل فتحة blastoporal الفموية.مع ماصة P20، نقل الأنسجة المعزولة إلى أنبوب PCR تحتوي على 20 ميكرولترات من العازلة استخراج الحمض النووي. نقل الجنين بعد الجراحة إلى بئر من 24 بئر لوحة تحتوي على ما لا يقل عن 500 ميكرولترات من مياه البحر الطازجة. ووضع لوحة تحتوي على الأجنة بعد الجراحة في حاضنة في 16 درجة مئوية حتى يتم الانتهاء من جينوتوبينغ.لاستخراج الحمض النووي الجينومي من أجنة واحدة، تدور أولا لفترة وجيزة أسفل أنابيب PCR التي تحتوي على العازلة استخراج الحمض النووي والأنسجة الجنينية المعزولة باستخدام جهاز طرد مركزي صغير. ثم احتضان الأنابيب في 55 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات في حين دوامة لمدة 30 ثانية كل 30 دقيقة لضمان تفكك كتل الخلية وتعزيز تحلل الخلية. بعد تعطيل البروتينات K في 95 درجة مئوية لمدة أربع دقائق، وإعداد تفاعل PCR باستخدام الحمض النووي الجينوم المستخرج كقالب لتضخيم موضع الاهتمام.التصميم المطلوب التمهيدي كما هو موضح في المخطوطة. إعداد 20 ميكرولتر تفاعل PCR. بعد اكتمال PCR، تشغيل agarose هلام electrophoresis لتحديد حجم ووجود أو غياب منتجات PCR، مع التأكد من ضبط حالة agarose جل electrophoresis اعتمادا على الحجم المتوقع من منتجات PCR.استخدم نتائج PCR فيما يتعلق بالحجم والوجود أو الغياب أو منتجات PCR لتعيين نمط جيني لكل جنين بعد الجراحة ثم فرز الأجنة وفقًا للنمط الجيني الخاص بها. يحتوي جينوم نيماتوستيلا على موضع واحد يقوم بترميز بروتين السلائف لـ neuropeptide، GLWamide. ثلاثة أليل متحولة بالضربة القاضية في مركز الغفران تم الإبلاغ عنها سابقاًنتائج PCR من الأجنة عينة عشوائيا بين ذرية من الصليب F1 بين أنثى واحدة heterozygous تحمل أ أليل بالضربة القاضية والذكور heterozygous تحمل أليل C بالضربة القاضية تظهر أنواع جينية مختلفة. الأجنة واحد واثنين تظهر فرقة PCR واحدة المقابلة للحجم المتوقع من أ أليل بالضربة القاضية. الأجنة ثلاثة وستة تظهر اثنين من العصابات PCR مع الأحجام المتوقعة للضوضاء المغلوب أ وC.Embryos أربعة، سبعة، وثمانية تظهر فرقة PCR واحد المقابلة لحجم المتوقع من أليل خروج المغلوب C.يظهر الجنين 5 لا عصابات، مما يشير إلى عدم وجود ربط التمهيدي. لاستبعاد إمكانية فشل استخراج الحمض النووي الجينومي ، تم تشغيل PCR آخر باستخدام التمهيدي العكسي الذي يمكن أن يرتبط تسلسل نوع البرية. وفي حالة اكتشاف منتج من الـ PCR بحجم متوقع، كان استخراج الحمض النووي الجيني ناجحاً.في حين أن أي منتج يشير إلى فشل في الاستخراج. وعلى الرغم من أن هذا البروتوكول مصمم لأجنة شقوق البحر، فمن المؤكد أنه من الممكن تطبيق هذه الطريقة على الـ cnidarians الآخرين، مثل الشعاب المرجانية وقناديل البحر، حيث يمكن الوصول إلى المعلومات الجينية والأجنة. بعد هذا الإجراء، يتم استخدام المسوخ المحددة لتقييم النمط الظاهري التنموي.على سبيل المثال، يمكن استخدام تقنيات الأنسجة مثل الكبت المناعي لتقييم العيوب في مورفولوجيا، في حين يمكن استخدام التهجين في الموقع، والتكرار الكمي في الوقت الحقيقي RT-PCR، و RNA-seq لتقييم العيوب في التعبير الجيني. كما يمكن استخدام التصوير الحي لتقييم العيوب في السلوك أثناء التطور الجنيني، كما هو الحال في اليرقات أو في الاورام الحميدة المبكرة.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

بروتوكولات الحصول اقحي والجسدية الأجنة لدراسة تنظيم تطور الجنين في وقت مبكر من البقول نموذج<em&gt; Medicago truncatula</em

Early embryogenesis starting from a single cell zygote goes through rapid cell division and morphogenesis, and is morphologically characterized by ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome على من التنميط<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; إنتاج الأبقار الأجنة قبل الزرع عن طريق اللونين ميكروأري منصة

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Studying Wnt Signaling During Patterning of Conducting Airways

دراسة إشارات Wnt خلال الزخرفة من إجراء الخطوط الجوية

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis ...

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

حمل كاملة ورم التجديد من مجافي الفم المنفخة من البحر شقائق النعمان النجيم<em&gt; Nematostella vectensis</em

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched ...

The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

قوة البساطة: قنفذ البحر الأجنة كما<em&gt; في فيفو</em&gt; نماذج التنموية لدراسة مجمع خلية الى خلية اشارة شبكة التفاعلات

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and ...

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

الضوء بوساطة تعديل عكسها من الميتوجين تنشيط كيناز مسار البروتين خلال تمايز الخلايا و<em&gt; القيطم</em&gt; التنمية الجنينية

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

التصور للنشاط الكهربائي الخلوية في الزرد الأجنة في وقت مبكر، والأورام

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

تحليل لتطوير دائرة القلب أثناء Embryogenesis الماوس باستخدام كامل جبل ابيفلوريسسينسي

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

الجينوبة والقياس الكمي للتهجين في الموقع تلطيخ في حمار وحشي

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

إعداد مكتبات RNA الصغيرة لتسلسل من أجنة الماوس المبكر

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...