Name: genotyping of sea anemone during early development
Uploaded: 2019-05-13T14:30:00
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हम पांडुलिपि है, जो पांडुलिपि में सुधार के पिछले संस्करण पर टिप्पणी के लिए गुमनाम समीक्षक धन्यवाद. इस काम Arkansas विश्वविद्यालय से धन द्वारा समर्थित किया गया था.

1. अंडे देने का प्रेरण, इन विट्रो निषेचन, और डी-जेलिंग
<ol><li>समुद्र के पानी में नेमाटोस्टेला वेक्टेन्सिस बनाए रखें, जिसमें 16 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में प्रति हजार (ppt) 12 भागों की लवणता होती है, जिससे ...

<ol>
	<li>Medina, M., Collins, A. G., Silberman, J. D., Sogin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+hypotheses+of+basal+animal+phylogeny+using+complete+sequences+of+large+and+small+subunit+rRNA.">Evaluating hypotheses of basal animal phylogeny using complete sequences of large and small subunit rRNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9707-9712 (2001).</li><li>Erwin, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cambrian+Conundrum:+Early+Divergence+and+Later+Ecological+Success+in+the+Early+History+of+Animals.">The Cambrian Conundrum: Early Divergence and Later Ecological Success in the Early History of Animals.</a> Science. 334 (6059), 1091-1097 (2011).</li><li>Putnam, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sea+anemone+genome+reveals+ancestral+eumetazoan+gene+repertoire+and+genomic+organization.">Sea anemone genome reveals ancestral eumetazoan gene repertoire and genomic organization.</a> Science. 317 (5834), 86-94 (2007).</li><li>Magie, C. R., Daly, M., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrulation+in+the+cnidarian+Nematostella+vectensis+occurs+via+invagination+not+ingression.">Gastrulation in the cnidarian Nematostella vectensis occurs via invagination not ingression.</a> Developmental Biology. 305 (2), 483-497 (2007).</li><li>Nakanishi, N., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+knockouts+reveal+an+endogenous+role+for+ancient+neuropeptides+in+regulating+developmental+timing+in+a+sea+anemone.">CRISPR knockouts reveal an endogenous role for ancient neuropeptides in regulating developmental timing in a sea anemone.</a> eLife. 7, e39742 (2018).</li><li>He, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+axial+Hox+code+controls+tissue+segmentation+and+body+patterning+in+Nematostella+vectensis.">An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis.</a> Science. 361 (6409), 1377 (2018).</li><li>Ikmi, A., McKinney, S. A., Delventhal, K. M., Gibson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TALEN+and+CRISPR/Cas9-mediated+genome+editing+in+the+early-branching+metazoan+Nematostella+vectensis.">TALEN and CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the early-branching metazoan Nematostella vectensis.</a> Nature Communications. 5, 5486 (2014).</li><li>Servetnick, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9-mediated+excision+of+Nematostella+brachyury+disrupts+endoderm+development,+pharynx+formation+and+oral-aboral+patterning.">Cas9-mediated excision of Nematostella brachyury disrupts endoderm development, pharynx formation and oral-aboral patterning.</a> Development. 144 (16), 2951-2960 (2017).</li><li>Kraus, Y., Aman, A., Technau, U., Genikhovich, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-bilaterian+origin+of+the+blastoporal+axial+organizer.">Pre-bilaterian origin of the blastoporal axial organizer.</a> Nature Communications. 7, 11694 (2016).</li><li>Fritzenwanker, J. H., Genikhovich, G., Kraus, Y., Technau, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+development+and+axis+specification+in+the+sea+anemone+Nematostella+vectensis.">Early development and axis specification in the sea anemone Nematostella vectensis.</a> Developmental Biology. 310 (2), 264-279 (2007).</li><li>Lee, P. N., Kumburegama, S., Marlow, H. Q., Martindale, M. Q., Wikramanayake, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+developmental+potential+along+the+animal-vegetal+axis+in+the+anthozoan+cnidarian,+Nematostella+vectensis,+is+mediated+by+Dishevelled.">Asymmetric developmental potential along the animal-vegetal axis in the anthozoan cnidarian, Nematostella vectensis, is mediated by Dishevelled.</a> Developmental Biology. 310 (1), 169-186 (2007).</li><li>Shinzato, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+Acropora+digitifera+genome+to+understand+coral+responses+to+environmental+change.">Using the Acropora digitifera genome to understand coral responses to environmental change.</a> Nature (London). 476 (7360), 320-323 (2011).</li><li>Gold, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+the+jellyfish+Aurelia+and+the+evolution+of+animal+complexity.">The genome of the jellyfish Aurelia and the evolution of animal complexity.</a> Nature Ecology &#38; Evolution. 3 (1), 96-104 (2019).</li><li>Clevesa, P. A., Strader, M. E., Bay, L. K., Pringle, J. R., Matz, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+genome+editing+in+a+reef-building+coral.">CRISPR/Cas9-mediated genome editing in a reef-building coral.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (20), 5235-5240 (2018).</li><li>Momose, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+doses+of+CRISPR/Cas9+ribonucleoprotein+efficiently+induce+gene+knockout+with+low+mosaicism+in+the+hydrozoan+Clytia+hemisphaerica+through+microhomology-mediated+deletion.">High doses of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein efficiently induce gene knockout with low mosaicism in the hydrozoan Clytia hemisphaerica through microhomology-mediated deletion.</a> Scientific Reports. 8, 11734 (2018).</li><li>Artigas, G. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gonad-expressed+opsin+mediates+light-induced+spawning+in+the+jellyfish+Clytia.">A gonad-expressed opsin mediates light-induced spawning in the jellyfish Clytia.</a> eLife. 7, e29555 (2018).</li></ol>

यहाँ एक पीसीआर आधारित प्रोटोकॉल के लिए पशु त्याग के बिना एक एकल समुद्र anemone भ्रूण जीनोटाइप वर्णित. अंडे देने और डी-जेलिंग के बाद, निषेचित अंडे को गैस्ट्रूले में विकसित करने की अनुमति है। प्रत्येक gastrula भ्र?...

Cnidarians जेलीफ़िश, कोरल, और समुद्री anemones शामिल हैं कि जानवरों की एक विविध समूह का प्रतिनिधित्व करते हैं। वे डिप्लोब्लास्ट, बहिर्चर्म और एंडोडर्म से बना है जो एक extracellular मैट्रिक्स (mesoglea) द्वारा अलग कर रहे हैं। Cnidaria एक बहन समूह के लिए कल्पना Bilateria है, जो इस तरह के Drosophila और Mus के रूप में पारंपरिक पशु मॉडल1से संबंधित है. इसके अतिरिक्त, Cnidaria-Bilateria विचलन पूर्व Cambrian अवधि2में हुई है माना जाता है. इस तरह के रूप में, उनके सबसे हाल ही में आम पूर्वज के जीव विज्ञान में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए nidarians और bilaterians के तुलनात्मक अध्ययन आवश्यक हैं. हाल ही में, तुलनात्मक जीनोमिक्स से पता चला है कि cnidarians और bilaterians पायदान और BHLH जैसे कई विकासात्मक टूलकिट जीन साझा करते हैं, जिसका अर्थ है कि उनके सामान्य पूर्वज में पहले से ही ये जीन3थे। हालांकि, Cnidaria और Bilateria के अंतिम आम पूर्वज में इन विकास Toolkit जीन की भूमिका तुलनात्मक रूप से कम अच्छी तरह से समझा जाता है. इस समस्या का समाधान करने के लिए, यह अध्ययन करना महत्वपूर्ण है कि ये गहराई से संरक्षित जीन कैसे निडरियन्स में कार्य करते हैं।
उभरते निडनेरियन आनुवंशिक मॉडलों में से एक एंथोजोअन नेमाटोस्टेला वेक्टेन्सिस है। इसके जीनोम3अनुक्रम किया गया है, और आनुवंशिक उपकरणों की एक किस्म है, morpholino-मध्यस्थ जीन knockdown सहित, meganuclease-मध्यस्थ transgenesis, और CRISPR-Cas9-मध्यस्थ जीन knockins और knockouts, अब इस जानवर में उपयोग के लिए उपलब्ध हैं. इसके अलावा, नेमाटोस्टेला विकास अपेक्षाकृत अच्छी तरह से समझा जाता है। भ्रूणजनन के दौरान, गैस्ट्रेशन 4 के सेवन से होता है, और भ्रूण एक मुक्त-स्वीमिंग प्लैनुला लार्वा में विकसित होता है। planula बाद में एक मुंह और परिमुख जाल के साथ एक सेसाइल पॉलीप में बदल देती है। पॉलीप तो बढ़ता है और यौन परिपक्वता तक पहुँचता है.
CRISPR-Cas9-मध्यस्थ लक्षित मटजनन अब नियमित रूप से नेमाटोस्टेला वेक्टेन्सिस5,6,7,8,9में जीन फंक्शन का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है। Nematostellaमें नॉकआउट म्यूटेंट उत्पन्न करने के लिए, एक कॉकटेल जिसमें टिड्डी-विशिष्ट एकल-गाइड आरएनए और एंडोनुकेलेस Cas9 प्रोटीन शामिल हैं, को पहले F0 संस्थापक जानवरों का उत्पादन करने के लिए अनफर्टिलाइज्ड या निषेचित अंडे में इंजेक्ट किया जाता है जो आम तौर पर दिखाते हैं मोज़ेकवाद. F0 जानवरों बाद में यौन परिपक्वता के लिए उठाया और एक दूसरे के साथ पार कर रहे हैं एक F1 जनसंख्या का उत्पादन, जिनमें से एक सबसेट नॉकआउट उत्परिवर्ती6हो सकता है . वैकल्पिक रूप से, यौन परिपक्व F0 जानवरों जंगली प्रकार जानवरों के साथ पार किया जा सकता है F1 विषमयुग्मज जानवरों उत्पन्न करने के लिए, और F1 heterozygotes कि ब्याज की टिड्डी में एक नॉकआउट allele ले तो एक दूसरे के साथ पार किया जा सकता है F2 वंश का उत्पादन करने के लिए, एक चौथाई जिनमें से नॉकआउट म्यूटेंट5होने की संभावना है. दोनों दृष्टिकोण एक आनुवंशिक रूप से विषम आबादी से नॉकआउट उत्परिवर्ती की पहचान करने के लिए एक विधि की आवश्यकता है. पॉलीप स्पर्शक का उपयोग जीनोटाइपिंग6,7के लिए जीनोमिक डीएनए निकालने के लिए किया जा सकता है . हालांकि, मामलों में जहां ब्याज के जीन के विकास समारोह की जांच की जा रही है और उत्परिवर्ती भ्रूण पॉलीप चरण तक नहीं पहुंचते हैं (यानी, उत्परिवर्तन के साथ जुड़े लार्वा घातकता के कारण), नॉकआउट म्यूटेंट की पहचान जल्दी में करने की आवश्यकता है। यहाँ वर्णित एक पीसीआर आधारित प्रोटोकॉल जानवर का त्याग किए बिना gastrula चरण में जीनोटाइप व्यक्तिगत जानवरों के लिए है, जो भ्रूण की आनुवंशिक रूप से विषम आबादी से नॉकआउट उत्परिवर्ती की पहचान सक्षम बनाता है. पूरे जीनोटाइपिंग प्रक्रिया की अवधि जांच की जाने वाली भ्रूणों की संख्या पर निर्भर करती है, लेकिन इसके लिए न्यूनतम 4-5 ज की आवश्यकता होती है।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Drosophila Peltier Refrigerated Incubator</td>
			<td>Shellab</td>
			<td>SRI6PF</td>
			<td>Used for spawning induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant ocean sea salt</td>
			<td>Instant ocean</td>
			<td>138510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brine shrimp cysts</td>
			<td>Aquatic Eco-Systems, Inc.</td>
			<td>BS90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine Hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Orbital Shaker, Model 3500</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS-HCl, 1M, pH8.0</td>
			<td>QUALITY BIOLOGICAL</td>
			<td>351-007-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, 0.5M pH8</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7830-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet-P40 Substitute</td>
			<td>US Biological</td>
			<td>N3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K solution (20 mg/mL), RNA grade</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25530049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting needle holder</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten dissecting needle</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Eppendorf Mastercycler Thermal Cyclers</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>E6336000024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N0447L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLWamide universal forward primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse primer specific to glw-a</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-CCAGATGCCTGGTGATAC-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse primer specific to glw-c </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;- CGGCCGGCGCATATATAG-3&#8217;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genotyping of sea anemone during early development

यहाँ वर्णित एक पीसीआर आधारित प्रोटोकॉल है जो जानवर के जीवन का त्याग किए बिना एंथोजोआन निडरियन नेमाटोस्टेला वेक्टेन्सिस के गैस्ट्रुला चरण भ्रूण को जीनोटाइप करने के लिए है। इन विट्रो निषेचन और डी-जेलिंग के बाद, युग्मनज को कमरे के तापमान पर 24 एच के लिए विकसित करने की अनुमति दी जाती है ताकि मध्य-गैस्ट्रुला चरण तक पहुंच सके। गैस्ट्रुला भ्रूण तो समुद्री जल युक्त एक पेट्री डिश में एक agarose जेल बिस्तर पर रखा जाता है. विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, एक टंगस्टन सुई शल्य चिकित्सा प्रत्येक भ्रूण से एक aboral ऊतक टुकड़ा अलग करने के लिए प्रयोग किया जाता है। सर्जरी के बाद भ्रूण तो चंगा और विकास जारी रखने के लिए अनुमति दी जाती है. जीनोमिक डीएनए अलग ऊतक टुकड़ा से निकाला जाता है और टिड्डी विशेष पीसीआर के लिए एक टेम्पलेट के रूप में इस्तेमाल किया। जीनोटाइप पीसीआर उत्पादों या उपस्थिति /विशिष्ट पीसीआर उत्पादों की उपस्थिति/अभाव के आकार के आधार पर निर्धारित किया जा सकता है। सर्जरी के बाद भ्रूण तो जीनोटाइप के अनुसार हल कर रहे हैं. पूरे जीनोटाइपिंग प्रक्रिया की अवधि जांच की जाने वाली भ्रूणों की संख्या पर निर्भर करती है, लेकिन इसके लिए न्यूनतम 4-5 ज की आवश्यकता होती है। इस विधि भ्रूण की एक आनुवंशिक रूप से विषम आबादी से नॉकआउट उत्परिवर्ती की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और विकास के दौरान phenotypes के विश्लेषण में सक्षम बनाता है.

नेमाटोस्टेला जीनोम में एक एकल स्थान है जो न्यूरोपेप्टाइड ग्लोवामाइड के लिए एक अग्रदूत प्रोटीन को एन्कोड करता है। इस लोकस (ग्लवा- ए, ग्लवा- बी, और ग्लडब्ल्यू-सी) में ती?...

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Genotyping of Sea Anemone during Early Development

प्रारंभिक विकास के दौरान सागर एनमोन का जनन

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य भ्रूण का त्याग किए बिना समुद्र एनामोने नेमाटोस्टेला वेक्टेन्सिस को गैसट्रेशन के दौरान जीनोटाइप करना है.

Described here is a PCR-based protocol to genotype the gastrula stage embryo of the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis without sacrificing the ...

यह प्रोटोकॉल एक शोधकर्ता को प्रारंभिक भ्रूणजेनेसिस के दौरान उत्परिवर्ती समुद्री एनीमोन की पहचान करने में सक्षम बनाता है ताकि भ्रूण के बाद विकास णोटाइप का विश्लेषण किया जा सके। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि इसका उपयोग जानवर के जीवन का त्याग किए बिना ओन्गेनी में जल्दी व्यक्तिगत समुद्री एनीमोन जीनोटाइप करने के लिए किया जा सकता है। इस प्रक्रिया का प्रदर्शन मिगुएल सिल्वा, मेरी प्रयोगशाला से एक स्नातक छात्र होगा ।इंडक्शन पैदा करने से पहले दिन, एनेवन नेमाटोस्टेला वेक्टेन्सिस को तापमान और हल्के नियंत्रित इनक्यूबेटर में रखें, इनक्यूबेटर प्रोग्रामिंग करें ताकि जानवरों को 25 डिग्री सेल्सियस पर आठ घंटे की रोशनी के संपर्क में लाया जा सके। अगले दिन, इनक्यूबेटर से जानवरों को हटा दें और उन्हें कमरे के तापमान पर एक बेंच टॉप पर छोड़ दें, जिस पर प्रकाश के साथ स्पॉन की अनुमति दी जाती है, जो निम्नलिखित डेढ़ से दो घंटे के भीतर हो जाएगी। एक स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करें जो टिप को मादा कंटेनर से अंडे के पैकेज को शुक्राणु युक्त पुरुष कंटेनर में रखने के लिए खोलने को बड़ा करने के लिए काटा जाता है और निषेचन के लिए अनुमति देने के लिए उन्हें कम से कम 15 मिनट के लिए पुरुष कंटेनर में छोड़ देते हैं।निषेचन के बाद, अंडे के पैकेजों को अलग करने के लिए, उन्हें एक ग्लास पेट्री डिश पर 3% सिस्टीन युक्त समुद्री जल में रखें और धीरे-धीरे 12 मिनट के लिए एक शेखर पर आंदोलन करें। फिर एक प्लास्टिक पिपेट के साथ झुरमुट तोड़ और पूरी तरह से dejellied जब तक एक और दो से तीन मिनट के लिए आंदोलन जारी है । एक ही डिश पर 16 डिग्री सेल्सियस या कमरे के तापमान पर निषेचित अंडे रखें।अगले दिन, पांडुलिपि में वर्णित डीएनए निष्कर्षण बफर तैयार करें, भंवर से अच्छी तरह से मिलाएं, और प्रत्येक ट्यूब में 20 माइक्रोलीटर जोड़कर इसे पीसीआर ट्यूबों में अलीकोट करें। समुद्री जल में 1% agarose भंग, यह एक पेट्री पकवान में डालना नीचे कवर करने के लिए, और एक बेंच शीर्ष पर शांत करने के लिए एक जेल बिस्तर बनाते हैं । जेल बिस्तर को ताजे समुद्री जल से ढक दें।एगर उठे जेल बिस्तर युक्त पेट्री डिश में एक पिपेट का उपयोग करके 24 घंटे के बाद निषेचन भ्रूण स्थानांतरित करें। एक जरूरत धारक में एक टंगस्टन सुई डालें और शराब में अपनी नोक सूई और यह लौ में रखने के लिए बंद शराब जला द्वारा निष्फल । एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, टंगस्टन सुई का उपयोग करके एक भ्रूण के आकार के बारे में सतह agarose को हटाने के लिए एक अवसाद बनाने के लिए हेरफेर किया जाएगा ।फिर, टंगस्टन सुई का उपयोग करके, भ्रूण को अवसाद में अपने पार्श्व पक्ष के साथ नीचे की ओर रखें ताकि माइक्रोसर्जरी के लिए भ्रूण के आंदोलन को प्रतिबंधित किया जा सके। सफल सर्जरी करने के लिए, भ्रूण के आंदोलन को प्रतिबंधित करना महत्वपूर्ण है। टंगस्टन सुई के साथ, शल्य चिकित्सा मौखिक एबोरल धुरी के साथ एबोरल ऊतक का एक टुकड़ा हटा दें, जो मौखिक ब्लास्टोपोरल खोलने के विपरीत स्थित है।एक P20 पिपेट के साथ, डीएनए निष्कर्षण बफर के 20 माइक्रोलीटर युक्त पीसीआर ट्यूब में अलग-थलग एबोरल ऊतक स्थानांतरित करें। सर्जरी के बाद के भ्रूण को 24-अच्छी तरह से प्लेट के कुएं में स्थानांतरित करें जिसमें ताजे समुद्री जल के कम से ५०० माइक्रोलीटर होते हैं । और एक इनक्यूबेटर में सर्जरी के बाद भ्रूण युक्त थाली 16 डिग्री सेल्सियस पर जगह जब तक जीनोटाइपिंग पूरा हो गया है ।एकल भ्रूण से जीनोमिक डीएनए निकालने के लिए, पहले संक्षेप में एक मिनी अपकेंद्रित्र का उपयोग कर डीएनए निष्कर्षण बफर और अलग भ्रूण ऊतकों युक्त पीसीआर ट्यूबों नीचे स्पिन । फिर ट्यूबों को तीन घंटे के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, जबकि सेल झुरमुटों के गोलमाल को सुनिश्चित करने और सेल लाइसिस को बढ़ाने के लिए हर 30 सेकंड के लिए 30 सेकंड के लिए भंवर। चार मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर प्रोटीन के निष्क्रिय करने के बाद, ब्याज की लोकस बढ़ाना करने के लिए एक टेम्पलेट के रूप में निकाले गए जीनोमिक डीएनए का उपयोग करके एक पीसीआर प्रतिक्रिया स्थापित करें।पांडुलिपि में वर्णित वांछित प्राइमर डिजाइन करें। 20 माइक्रोलिटर पीसीआर रिएक्शन सेट करें। पीसीआर पूरी होने के बाद, पीसीआर उत्पादों के आकार और उपस्थिति या अनुपस्थिति को निर्धारित करने के लिए एगर उठे जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस चलाएं, जिससे पीसीआर उत्पादों के अपेक्षित आकार के आधार पर एग्राजॉल्ड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस की स्थिति को समायोजित करना सुनिश्चित किया जा सके।प्रत्येक के बाद सर्जिकल भ्रूण के लिए एक जीनोटाइप आवंटित करने के लिए आकार और उपस्थिति या अनुपस्थिति या पीसीआर उत्पादों के बारे में पीसीआर परिणामों का उपयोग करें और फिर उनके जीनोटाइप के अनुसार भ्रूण सॉर्ट करें। नेमाटोस्टेला जीनोम में एक ही लोकस होता है जो न्यूरोपेप्टाइड, GLWamide के लिए एक अग्रदूत प्रोटीन को एन्कोड करता है। लोकस में तीन नॉकआउट उत्परिवर्ती alleles पहले सूचित किया गया है ।एक विषम महिला के बीच एक F1 क्रॉस की संतान के बीच बेतरतीब ढंग से नमूना भ्रूण से पीसीआर परिणाम एक नॉकआउट allele और विषम पुरुषों एक सी नॉकआउट एलील ले जाने के अलग जीनोटाइप दिखाते हैं । भ्रूण एक और दो एक नॉकआउट allele के अपेक्षित आकार इसी एक पीसीआर बैंड दिखाओ । भ्रूण तीन और छह नॉकआउट alleles ए और सी भ्रूण चार, सात के लिए अपेक्षित आकार के साथ दो पीसीआर बैंड दिखाने के लिए, और आठ सी नॉकआउट allele के अपेक्षित आकार के अनुरूप एक पीसीआर बैंड दिखाओ ।भ्रूण 5 कोई बैंड से पता चलता है, प्राइमर बाध्यकारी की कमी का सुझाव । जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण विफलता की संभावना से इंकार करने के लिए, एक और पीसीआर एक रिवर्स प्राइमर का उपयोग करके चलाया गया था जो जंगली प्रकार के अनुक्रम को बांध सकता है। जहां अपेक्षित आकार के पीसीआर उत्पाद का पता चला, जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण सफल रहा ।जबकि किसी भी उत्पाद ने निकालने में असफलता का सुझाव नहीं दिया। हालांकि यह प्रोटोकॉल समुद्री एनेवन भ्रूण के लिए डिज़ाइन किया गया है, यह सुनिश्चित रूप से इस विधि को कोरल और जेलीफ़िश जैसे अन्य cnidarians पर लागू करना संभव है, जहां जीनोमिक जानकारी और भ्रूण सुलभ हैं। इस प्रक्रिया के बाद, पहचाने गए म्यूटेंट का उपयोग विकासात्मक फेनोटाइप का आकलन करने के लिए किया जाता है।उदाहरण के लिए, इम्यूनोस्टेपिंग जैसी हिस्टोलॉजिकल तकनीकों का उपयोग आकृति विज्ञान में दोषों का आकलन करने के लिए किया जा सकता है, जबकि सीटू संकरण में, रीयलटाइम मात्रात्मक आरटी-पीसीआर, और आरएनए-एसईक्यू का उपयोग जीन अभिव्यक्ति में दोषों का आकलन करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, लाइव इमेजिंग का उपयोग भ्रूण के बाद के विकास के दौरान व्यवहार में दोषों का आकलन करने के लिए किया जा सकता है, जैसे लार्वा में या शुरुआती जंतु में।

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

मॉडल फली में जल्दी भ्रूण के विकास के नियमन के अध्ययन के लिए युग्मज और दैहिक भ्रूणों प्राप्त करने के लिए प्रोटोकॉल<em&gt; Medicago truncatula</em

Early embryogenesis starting from a single cell zygote goes through rapid cell division and morphogenesis, and is morphologically characterized by ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

के Transcriptome प्रोफाइलिंग<em&gt; इन विवो</em&gt; उत्पादित गोजातीय पूर्व आरोपण भ्रूण दो रंग माइक्रोएरे प्लेटफार्म का उपयोग

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Studying Wnt Signaling During Patterning of Conducting Airways

WNT सिगनल का अध्ययन का आयोजन एयरवेज के patterning के दौरान

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis ...

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

स्टारलेट समुद्री एनीमोन की एबोरल Physa से पूरा नाकड़ा पुनर्जनन उत्प्रेरण<em&gt; Nematostella vectensis</em

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched ...

The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

सादगी की शक्ति: के रूप में समुद्री साही भ्रूण<em&gt; Vivo</em&gt; जटिल सेल करने वाली कोशिका संकेतन नेटवर्क अध्ययन बातचीत के लिए विकास मॉडल

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and ...

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

सेल भेदभाव के दौरान मिटोजेन-सक्रिय प्रोटीन किनेस पाथवे के प्रकाश-मध्यस्थतापूर्ण प्रतिवर्ती मॉडुलन और<em&gt; Xenopus</em&gt; भ्रूण विकास

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Zebrafish जल्दी भ्रूण और ट्यूमर में सेलुलर विद्युत गतिविधि के दृश्य

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

पूरे माउंट Epifluorescence का उपयोग कर माउस Embryogenesis के दौरान कार्डिएक चैंबर विकास का विश्लेषण

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

जेब्राफिश में सीटू संकरण धुंधला में जेनोटीपिंग और क्वांटिफिकेशन

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

प्रारंभिक माउस भ्रूण से अनुक्रमण के लिए छोटे आरएनए पुस्तकालयों की तैयारी

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...