Name: genotyping of sea anemone during early development
Uploaded: 2019-05-13T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genotyping of Sea Anemone during Early Development at JoVE.com

Yazının önceki versiyonunda anonim yorumcular için teşekkür ederiz, bu da taslağı geliştirdi. Bu çalışma Arkansas Üniversitesi 'nden fon tarafından destekleniyordu.

1. yumurtlama indüksiyon, in vitro fertilizasyon, ve de-jellying
<ol><li>16 °C ' de karanlığın içinde bin başına 12 parça (PPT) tuzluluk ile deniz suyunda Nematostella vectensis koruyun, günlük Artemia besleme.</li>
	<li>Yumurtlama İndüksiyon öncesi gün, bir sıcaklık ve ışık kontrollü kuluçla hayvan yerleştirin. Böylece hayvanların 25 °C ' de 8 h ışığa maruz kalabilmesi için kuluçk programını programlamak. Opsiyonel: yumurtlama geliştirmek için küçük bir...

<ol>
	<li>Medina, M., Collins, A. G., Silberman, J. D., Sogin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+hypotheses+of+basal+animal+phylogeny+using+complete+sequences+of+large+and+small+subunit+rRNA.">Evaluating hypotheses of basal animal phylogeny using complete sequences of large and small subunit rRNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9707-9712 (2001).</li><li>Erwin, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cambrian+Conundrum:+Early+Divergence+and+Later+Ecological+Success+in+the+Early+History+of+Animals.">The Cambrian Conundrum: Early Divergence and Later Ecological Success in the Early History of Animals.</a> Science. 334 (6059), 1091-1097 (2011).</li><li>Putnam, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sea+anemone+genome+reveals+ancestral+eumetazoan+gene+repertoire+and+genomic+organization.">Sea anemone genome reveals ancestral eumetazoan gene repertoire and genomic organization.</a> Science. 317 (5834), 86-94 (2007).</li><li>Magie, C. R., Daly, M., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrulation+in+the+cnidarian+Nematostella+vectensis+occurs+via+invagination+not+ingression.">Gastrulation in the cnidarian Nematostella vectensis occurs via invagination not ingression.</a> Developmental Biology. 305 (2), 483-497 (2007).</li><li>Nakanishi, N., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+knockouts+reveal+an+endogenous+role+for+ancient+neuropeptides+in+regulating+developmental+timing+in+a+sea+anemone.">CRISPR knockouts reveal an endogenous role for ancient neuropeptides in regulating developmental timing in a sea anemone.</a> eLife. 7, e39742 (2018).</li><li>He, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+axial+Hox+code+controls+tissue+segmentation+and+body+patterning+in+Nematostella+vectensis.">An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis.</a> Science. 361 (6409), 1377 (2018).</li><li>Ikmi, A., McKinney, S. A., Delventhal, K. M., Gibson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TALEN+and+CRISPR/Cas9-mediated+genome+editing+in+the+early-branching+metazoan+Nematostella+vectensis.">TALEN and CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the early-branching metazoan Nematostella vectensis.</a> Nature Communications. 5, 5486 (2014).</li><li>Servetnick, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9-mediated+excision+of+Nematostella+brachyury+disrupts+endoderm+development,+pharynx+formation+and+oral-aboral+patterning.">Cas9-mediated excision of Nematostella brachyury disrupts endoderm development, pharynx formation and oral-aboral patterning.</a> Development. 144 (16), 2951-2960 (2017).</li><li>Kraus, Y., Aman, A., Technau, U., Genikhovich, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-bilaterian+origin+of+the+blastoporal+axial+organizer.">Pre-bilaterian origin of the blastoporal axial organizer.</a> Nature Communications. 7, 11694 (2016).</li><li>Fritzenwanker, J. H., Genikhovich, G., Kraus, Y., Technau, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+development+and+axis+specification+in+the+sea+anemone+Nematostella+vectensis.">Early development and axis specification in the sea anemone Nematostella vectensis.</a> Developmental Biology. 310 (2), 264-279 (2007).</li><li>Lee, P. N., Kumburegama, S., Marlow, H. Q., Martindale, M. Q., Wikramanayake, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+developmental+potential+along+the+animal-vegetal+axis+in+the+anthozoan+cnidarian,+Nematostella+vectensis,+is+mediated+by+Dishevelled.">Asymmetric developmental potential along the animal-vegetal axis in the anthozoan cnidarian, Nematostella vectensis, is mediated by Dishevelled.</a> Developmental Biology. 310 (1), 169-186 (2007).</li><li>Shinzato, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+Acropora+digitifera+genome+to+understand+coral+responses+to+environmental+change.">Using the Acropora digitifera genome to understand coral responses to environmental change.</a> Nature (London). 476 (7360), 320-323 (2011).</li><li>Gold, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+the+jellyfish+Aurelia+and+the+evolution+of+animal+complexity.">The genome of the jellyfish Aurelia and the evolution of animal complexity.</a> Nature Ecology &#38; Evolution. 3 (1), 96-104 (2019).</li><li>Clevesa, P. A., Strader, M. E., Bay, L. K., Pringle, J. R., Matz, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+genome+editing+in+a+reef-building+coral.">CRISPR/Cas9-mediated genome editing in a reef-building coral.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (20), 5235-5240 (2018).</li><li>Momose, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+doses+of+CRISPR/Cas9+ribonucleoprotein+efficiently+induce+gene+knockout+with+low+mosaicism+in+the+hydrozoan+Clytia+hemisphaerica+through+microhomology-mediated+deletion.">High doses of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein efficiently induce gene knockout with low mosaicism in the hydrozoan Clytia hemisphaerica through microhomology-mediated deletion.</a> Scientific Reports. 8, 11734 (2018).</li><li>Artigas, G. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gonad-expressed+opsin+mediates+light-induced+spawning+in+the+jellyfish+Clytia.">A gonad-expressed opsin mediates light-induced spawning in the jellyfish Clytia.</a> eLife. 7, e29555 (2018).</li></ol>

Burada tanımlanan bir PCR tabanlı protokol genotip tek bir deniz anemone embriyo hayvan ödün vermeden. Yumurtlama ve de-jellying takiben, döllenmiş yumurtaların gastrulae içine gelişmesine izin verilir. Her gastrula embriyo aboral bölge cerrahi olarak kaldırılır ve izole aboral doku sonraki genomik DNA ekstraksiyon için kullanılır, kalan cerrahi sonrası embriyolar iyileşmek ve gelişmeye devam ederken. GDNA ekstraları daha sonra her embriyonun genotipini belirlemek için bir PCR tahlil için kullanıl?...

Cnidarians denizanası, mercanlar ve deniz anemonlar içeren hayvanların çeşitli bir grup temsil eder. Bunlar, ekstrasellüler matris (mesoglea) ile ayrılan ektoderm ve endoderm 'den oluşan diploblastlar. Cnidaria, Drosophila ve mus gibi geleneksel hayvan modellerinin1' e ait olduğu Bilateria için bir kardeş grubudur. Ayrıca, Cnidaria-Bilateria sapma pre-Cambrian döneminde oluştuğu düşünülmektedir2. Bu nedenle, cnidarians ve bilatyalılar karşılaştırmalı çalışmalar en son ortak atalarının biyoloji içine anlayış kazanmak için önemlidir. Son zamanlarda, karşılaştırmalı genomikler, cnidarians ve bilatozların notch ve bhlh gibi birçok gelişimsel araç genlerini paylaşımının, ortak atalarının zaten bu genler olduğunu ima ettiğini açıkladı3. Ancak, Cnidaria ve Bilateria 'nın son ortak atalarında bu gelişimsel araç genlerinin rolü göreceli olarak daha az iyi anlaşılmaktadır. Bu sorunu gidermek için, cnidarians içinde bu derinden uyumlu genlerin nasıl işledik çalışması önemlidir.
Gelişen Genus genetik modellerinden biri anthozoan nematostella vectensis 'dir. Genomu3sıralanmıştır ve morpholino-aracılı gen taklası, meganuclease-aracılı Transgenesis ve Crispr-Cas9-aracılı gen tokmağı ve knockouts dahil olmak üzere çeşitli genetik araçlar, şimdi bu hayvanın kullanımı için kullanılabilir. Buna ek olarak, Nematostella gelişimi nispeten iyi anlaşılır. Embriyogenyon sırasında, gastrasyon invaginasyon tarafından oluşur4, ve embriyo serbest yüzme Planula larva içine gelişir. Planula daha sonra bir ağız ve circumoral dokunacles ile bir sapsız polip dönüşür. Polip sonra büyür ve cinsel olgunluğa ulaşır.
Crispr-Cas9-aracılı hedeflenen Mutagenezi artık rutin olarak nematostella vectensis5,6,7,8,9' da gen fonksiyonunu incelemek için kullanılmıştır. Nematostella'da nakavt mutantlar oluşturmak için, Locus 'a özgü tek kılavuzluk Rnas ve endonükleaz Cas9 proteini içeren bir kokteyl, ilk olarak gösteren F0 kurucusu hayvanları üretmek için döllenmez veya döllenmiş yumurtalara enjekte edilir Mozaik. F0 hayvanlar daha sonra cinsel olgunluğa yükseltilmiş ve bir F1 nüfus üretmek için birbirleri ile geçti, bir alt kümesi hangi nakavt mutantlar6olabilir. Alternatif olarak, cinsel olgun F0 hayvanlar F1 heterozigot hayvanlar oluşturmak için vahşi tip hayvanlar ile geçilebilir ve faiz Locus içinde bir nakavt allel taşımak F1 heterozigotlar daha sonra F2 yavru üretmek için birbirleri ile kesişebilir, bir çeyrek Hangi nakavt mutantlar5bekleniyor. Her iki yaklaşım da genetik heterojen bir nüfusun nakavt mutantları tanımlamak için bir yöntem gerektirir. Polyp tentacles Genotipleme için genomik DNA ayıklamak için kullanılabilir6,7. Bununla birlikte, ilgi geninin gelişimsel fonksiyonunun incelendiği ve mutant embriyoların polip aşamasına ulaşamayacağı durumlarda (yani, mutasyona bağlı larva saflığı nedeniyle), nakavt mutantların ontojende erken tespit edilmesi gerekir. Burada açıklandığı gibi, hayvan ödün vermeden gastrula aşamasında genotip bireysel hayvanlar için PCR tabanlı bir protokoldür, bu embriyo genetiği heterojen bir nüfusun nakavt mutantların tanımlanması sağlar. Tüm Genotipleme sürecinin süresi, taramalı embriyo sayısına bağlıdır, ancak minimal 4-5 h gerektirir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Drosophila Peltier Refrigerated Incubator</td>
			<td>Shellab</td>
			<td>SRI6PF</td>
			<td>Used for spawning induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant ocean sea salt</td>
			<td>Instant ocean</td>
			<td>138510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brine shrimp cysts</td>
			<td>Aquatic Eco-Systems, Inc.</td>
			<td>BS90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine Hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Orbital Shaker, Model 3500</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS-HCl, 1M, pH8.0</td>
			<td>QUALITY BIOLOGICAL</td>
			<td>351-007-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, 0.5M pH8</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7830-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet-P40 Substitute</td>
			<td>US Biological</td>
			<td>N3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K solution (20 mg/mL), RNA grade</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>25530049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting needle holder</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten dissecting needle</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-6063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Eppendorf Mastercycler Thermal Cyclers</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>E6336000024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N0447L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLWamide universal forward primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse primer specific to glw-a</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-CCAGATGCCTGGTGATAC-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse primer specific to glw-c </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;- CGGCCGGCGCATATATAG-3&#8217;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genotyping of sea anemone during early development

Burada açıklanan, hayvan hayatından ödün vermeden anthozoan Genus nematostella vectensis gastrula sahne embriyo genotip için PCR tabanlı bir protokoldür. İn vitro fertilizasyon ve de-jellying takipte, zygotların erken-orta gastrula aşamasına ulaşmak için oda sıcaklığında 24 saat gelişmesine izin verilir. Gastrula embriyoları daha sonra deniz suyu içeren bir petri çanak agaroz jel yatağa yerleştirilir. Diseksiyon mikroskop altında, bir tungsten iğne cerrahi olarak her embriyonun bir aboral doku parçası ayırmak için kullanılır. Cerrahi sonrası embriyolar daha sonra iyileşmeye ve gelişmeye devam etmesine izin verilir. Genomik DNA izole doku parçasından çıkarılır ve Locus özel PCR için bir şablon olarak kullanılır. Genotip, PCR ürünlerinin boyutuna göre veya ALLELE özel PCR ürünlerinin varlığı/yokluğunda tespit edilebilir. Cerrahi sonrası embriyolar daha sonra genottipe göre sıralanır. Tüm Genotipleme sürecinin süresi, taramalı embriyo sayısına bağlıdır, ancak minimal 4 – 5 h gerektirir. Bu yöntem embriyoların genetik olarak heterojen bir nüfusundan nakavt mutantları tanımlamak için kullanılabilir ve gelişim sırasında fenotiplerin analizlerini sağlar.

Nematostella genomunun, Nörofobide glwamıde için bir preürot proteini kodlayan tek bir Locası vardır. Bu Locus 'ta üç Knockout mutant alelleri (GLW-a, GLW-bve GLW-c) daha önce5bildirildi. Glwamide Locus (Genotype: +/GLW-c) ile vahşi tip allel (+) ve nakavt allel GLW-ctaşıyan dört heterozigot erkek, vahşi tip allel ve farklı nakavt taşıyan bir heteroz...

Watch this Scientific Journal Video about Genotyping of Sea Anemone during Early Development at JoVE.com

Genotyping of Sea Anemone during Early Development

Erken gelişim sırasında deniz anemon Genotipleme

Bu protokolün amacı, embriyo ödün vermeden gastrasyon sırasında deniz anemone nematostella vectensis genotip etmektir.

Described here is a PCR-based protocol to genotype the gastrula stage embryo of the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis without sacrificing the ...

Bu protokol, bir araştırmacının erken embriyogenez sırasında mutant deniz anemonları tespit etmesini sağlar, böylece post-embriyonik gelişimsel fenotip analiz edilebilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, hayvanın hayatından ödün vermeden tek tek deniz anemonları genotipli olarak ontojenin erken dönemlerinde kullanılabilmesidir. Bu prosedürü gösteren Miguel Silva, benim laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olacak.Indüksiyon yumurtlamadan bir gün önce, anemon nematostella vectensis'i sıcaklık ve ışık kontrollü bir kuluçka makinesine yerleştirin, böylece hayvanlar 25 santigrat derecede sekiz saatlik ışığa maruz kalmıştır. Ertesi gün, kuvöz hayvanları çıkarın ve aşağıdaki bir buçuk ila iki saat içinde meydana gelecek yumurtlama izin vermek için ışık açık oda sıcaklığında bir bank üst üzerinde bırakın. İpucu bir transfer pipet kullanın bir sperm içeren erkek konteyner içine kadın konteyner yumurta paketleri yerleştirmek için açılış büyütmek için kesilir ve döllenme için izin vermek için en az 15 dakika erkek kabında bırakın.Döllenmeden sonra, yumurta paketlerini dejelly için, bir cam Petri kabına % 3 sistein içeren deniz suyuna yerleştirin ve hafifçe 12 dakika çalkalayıcı üzerinde çalkalayın. Sonra plastik bir pipet ile kümeleri kırmak ve tamamen dejellied kadar başka bir 2-3 dakika boyunca ajitasyon devam. Döllenmiş yumurtaları aynı çanakta 16 derecede veya oda sıcaklığında saklayın.Ertesi gün, el yazmasıaçıklandığı gibi DNA çıkarma tamponu hazırlayın, girdap ile iyice karıştırın ve her tüpe 20 mikrolitre ekleyerek PCR tüpleri içine aliquot. Deniz suyunda % 1 agarose çözün, alt kapsayacak şekilde bir Petri kabına dökün, ve bir jel yatak yapmak için bir tezgah üst üzerinde serin. Jel yatağını tatlı deniz suyuyla kaplayın.24 saatlik döllenme sonrası embriyoları bir pipet kullanarak agarose jel yatak içeren Petri kabına aktarın. Bir ihtiyaç tutucu içine bir tungsten iğne takın ve alkol onun ucunu daldırma ve alkol yakmak için alev yerleştirerek sterilize. Bir diseksiyon mikroskop altında, manipüle edilecek bir embriyo büyüklüğünde yüzey agarose bir parça kaldırmak için tungsten iğne kullanarak agarose bir depresyon yapmak.Sonra, tungsten iğne kullanarak, mikrocerrahi için embriyo hareketini kısıtlamak için aşağı bakan lateral tarafı ile depresyon içine embriyo yerleştirin. Başarılı bir ameliyat yapabilmek için embriyonun hareketini kısıtlamak çok önemlidir. Tungsten iğne ile, cerrahi oral aboral ekseni boyunca aboral doku bir parça kaldırmak, oral blastoporal açılış karşısında bulunan.P20 pipetile izole aboral dokuyu 20 mikrolitre DNA ekstraksiyon tamponu içeren bir PCR tüpüne aktarın. Ameliyat sonrası embriyoyu en az 500 mikrolitre tatlı deniz suyu içeren 24 kuyuluk bir kuyuya aktarın. Ve ameliyat sonrası embriyoiçeren plakayı genotipleme tamamlanana kadar 16 derecede bir kuvöze yerleştirin.Tek embriyolardan genomik DNA elde etmek için, ilk olarak dna çıkarma tamponu ve izole embriyonik dokuları içeren PCR tüplerini mini bir santrifüj kullanarak aşağı doğru döndürün. Daha sonra tüpleri 55 derecede üç saat kuluçkaya yatırın ve hücre kümelerinin dağılmasıve hücre liklerinin arttırılması için her 30 dakikada bir 30 saniye girdap atın. Proteinaz K'yi 4 dakika boyunca 95 santigrat derecede etkisiz hale getirmekten sonra, çıkarı alan çekirgeyi güçlendirmek için şablon olarak çıkarılan genomik DNA'yı kullanarak bir PCR reaksiyonu ayarlayın.Tasarım el yazması açıklandığı gibi astar lar. 20 mikrolitre PCR reaksiyonu ayarlayın. PCR tamamlandıktan sonra, PCR ürünlerinin boyutunu ve varlığını veya yokluğunu belirlemek için agarose jel elektroforezçalıştırın, PCR ürünlerinin beklenen boyutuna bağlı olarak agarose jel elektroforezdurumunu ayarlamak için emin olun.Her ameliyat sonrası embriyoya bir genotip atamak ve embriyoları genotiplerine göre sıralamak için boyutu ve varlığı veya yokluğu veya PCR ürünleri yle ilgili PCR sonuçlarını kullanın. Nematostella genomunda nöropeptid, GLWamide için öncüprotein kodlayan tek bir lokus vardır. Locus'ta üç nakavt mutant alel daha önce bildirilmiştir.A nakavt alel taşıyan heterozigot bir kadın ile C nakavt alel taşıyan heterozigot erkekler arasında f1 çaprazının soyundan gelen rastgele örneklenmiş embriyolardan elde edilen PCR sonuçları farklı genotipler gösterir. Embriyolar bir ve iki a nakavt alel beklenen boyutu karşılık gelen tek bir PCR bant göstermektedir. Embriyolar üç ve altı nakavt aleller A ve C.Embriyolar dört, yedi ve sekiz için beklenen boyutlarda iki PCR bantları göstermek tek bir PCR bant C nakavt alel beklenen boyutuna karşılık gelen gösterir.Embriyo 5 hiçbir bant gösterir, astar bağlama eksikliği düşündüren. Genomik DNA çıkarma arızası olasılığını ekarte etmek için, başka bir PCR vahşi tip diziye bağlanabilen bir ters astar kullanılarak çalıştırıldı. Beklenen boyutta bir PCR ürünü tespit edildiği yerde genomik DNA ekstraksiyonu başarılı oldu.Oysa hiçbir ürün çıkarma da bir hata önerdi. Bu protokol deniz anemon embriyoları için tasarlanmış olsa da, bu yöntemi genomik bilgi ve embriyoların erişebildiği mercanlar ve denizanaları gibi diğer cnidarians'a uygulamak mümkün olabilir. Bu prosedürütaki gelişimsel fenotipi değerlendirmek için tanımlanan mutantlar kullanılır.Örneğin, immünboyama gibi histolojik teknikler morfolojideki kusurları değerlendirmek için kullanılabilirken, yerinde hibridizasyonda, gerçek zamanlı kantitatif RT-PCR ve RNA-seq gen ekspresyonundaki kusurları değerlendirmek için kullanılabilir. Ayrıca, canlı görüntüleme larvalar veya erken polipler gibi post-embriyonik gelişim sırasında davranış kusurları değerlendirmek için kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

Model Baklagil Erken Embriyo Geliştirme Yönetmeliği incelenmesi için zigotik ve somatik embriyolar Elde protokolleri<em&gt; Medicago truncatula</em

Early embryogenesis starting from a single cell zygote goes through rapid cell division and morphogenesis, and is morphologically characterized by ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profil<em&gt; In-vivo</emİki renkli Mikroarray Platformu Kullanma&gt; Üretilen Sığır pre-implantasyon Embriyolar

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Studying Wnt Signaling During Patterning of Conducting Airways

İletken Airways Desenlendirme sırasında Wnt Sinyalizasyonu incelenmesi

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis ...

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Starlet Deniz Anemone Aboral physa Tam Polip Regeneration uyaran<em&gt; Nematostella vectensis</em

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched ...

The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

Sadelik Gücü: olarak deniz kestanesi Embriyolar<em&gt; Vivo</em&gt; Karmaşık Hücre-hücre Sinyal Ağ Etkileşimleri incelenmesi için Gelişim Modelleri

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and ...

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

Hücre Farklılaştırması Sırasında Mitojenle Aktive Edilen Protein Kinaz Yolunun Hafif-Uyumlu Geri Dönüşümlü Modülasyonu ve<em&gt; Xenopus</em&gt; Embriyonik Gelişim

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Zebra balığı erken embriyo ve tümör hücresel elektrik aktivitesinin görselleştirme

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

Bütün Mount Epifluorescence kullanarak fare embriyogenez sırasında kalp odası gelişimin analizi

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

Zebrabalığında Situ Hibridizasyon Boyamada Genotibrasyon ve Nicelik

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Erken Fare Embriyolarından Sıralama için Küçük RNA Kütüphanelerinin Hazırlanması

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...