Name: x-ray diffraction of intact murine skeletal muscle as a tool for studying the structural basis of muscle disease
Uploaded: 2019-07-18T12:30:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about X-ray Diffraction of Intact Murine Skeletal Muscle as a Tool for Studying the Structural Basis of Muscle Disease at JoVE.com

Esta pesquisa utilizou recursos da Advanced Photon Source, um departamento de energia dos EUA (DOE) Office of Science User Facility operado para o escritório de ciência da DOE pelo laboratório nacional de Argonne contrato no. DE-AC02-06CH11357. Este projeto foi apoiado pela subvenção P41 GM103622 do Instituto Nacional de ciências médicas gerais dos institutos nacionais de saúde. O uso do detetor de Pilatus 3 1M foi fornecido pela concessão 1S10OD018090-01 de NIGMS. O conteúdo é unicamente da responsabilidade dos autores e não reflete necessariamente os pontos de vista oficiais do Instituto Nacional de ciências médicas gerais ou dos institutos nacionais de saúde.

Todos os protocolos de experimentos com animais foram aprovados pelo Instituto de tecnologia de cuidados e uso de animais institucionais de Illinois (protocolo 2015-001, data de aprovação: 3 de novembro de 2015) e seguiram o "guia para o cuidado e uso de animais de laboratório" da NIH9 .
1. pré-experimento de preparação
<ol><li>Prepare 500 mL de solução de Ringer (contém: 145 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,0 mM MgSO4, 1,0 mm CAcl2, 10,0 mm HEPES, 11 mM glucose, pH 7,4) recentemente para cada dia do experimento.</li>
	<li>Encha 200 mL da solução de Ringer em um frasco do pulverizador e armazene-o no refrigerador de 4 ° c. Encha uma placa de Petri (10 cm no diâmetro) com solução e perfuse de Ringer com oxigênio de 100% conectando o tubo de um cilindro de oxigênio a uma pedra do ar do aquário. Os pratos de Petri ("pratos de dissecação") foram previamente revestidos com um composto de elastômero para permitir a inserção de pinos durante a dissecção.</li>
	<li>Prepare ganchos de montagem metálicos. Corte dois pedaços de arame de aço inoxidável, 0,5 mm de diâmetro, até o comprimento apropriado e dobre o fio em ambas as extremidades para formar ganchos. Organize todas as ferramentas de dissecação, tesouras, sutura que amarra o fórceps, Microtesoura acessível para o uso. Nota: A parte do gancho deve ser de cerca de 3 mm de comprimento. O fio mais longo (terminando em um gancho) deve ser cerca de 5 cm de comprimento, e o fio mais curto (também terminando em um gancho) deve ser cerca de 1 cm de comprimento, a fim de caber as câmaras personalizadas utilizadas na Biocat e permitir uma gama suficiente de movimento para o braço do transdutor.</li>
	<li>
Ligue e ligue todos os equipamentos. Isto inclui um transdutor combinado do motor/força, controlador do transdutor do motor/força um stimulator atual bi-fálico de alta potência, e um sistema controlado computador da aquisição/controle de dados.
	<ol>
<li>Ative o sistema de aquisição de dados e calibre-o antes de iniciar o experimento10. Resumidamente, calibrando a força adicionando um conjunto de pesos conhecidos, cobrindo até 50% da força máxima medida pelo transdutor de força em uma progressão linear, no transdutor de força e gravando as mudanças de tensão de saída. Calibre o comprimento aplicando um jogo da tensão conhecida da saída ao braço de alavanca e meça a mudança do comprimento do braço.</li>
		<li>Conecte as mangueiras do bloco térmico no suporte da amostra a um banho de circulação refrigerado e ajuste a temperatura para manter a temperatura desejada na câmara entre 10 ° c e 40 ° c. Determine isto empiricamente antes do tempo ajustando o banho de circulação a uma escala das temperaturas e medindo a temperatura na câmara com um par termoeléctrico.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparação do músculo
<ol><li>
Eutanizar o rato
	<ol>
<li>Eutanizar o rato por inalação de dióxido de carbono seguido de luxação cervical.</li>
		<li>Pulverize a pele no membro traseiro com a solução fria de Ringer para impedir que o cabelo sopre na preparação. Retire a pele cortando-a ao redor da coxa usando uma tesoura de dissecção fina e puxe rapidamente a pele para baixo usando #5 fórceps para expor os músculos.</li>
		<li>Amputar o membro traseiro e transferi-lo para um prato de dissecação que foi preenchido com solução de Ringer oxigenada e, em seguida, colocar um microscópio de dissecação binocular.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparando um músculo sóleo
	<ol>
<li>Fixe o membro traseiro no prato de dissecação com o músculo gastrocnêmio voltado para cima. Corte o tendão distal do grupo músculo gastrocnêmio/sóleo e levante os músculos suavemente e lentamente cortando a fáscia em ambos os lados do músculo gastrocnêmio usando tesouras finas. Isolar o grupo músculo gastrocnêmio/sóleo do membro após libertar o tendão proximal do músculo sóleo.</li>
		<li>Fixe o grupo muscular que contém o músculo gastrocnêmio e o tendão distal no prato de dissecação. Levante o músculo sóleo suavemente através do tendão proximal e separe-o do músculo gastrocnêmio deixando tanto do tendão distal do sóleo intacto quanto possível.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparando um músculo extensor longo (EDL) do digitorium
	<ol>
<li>Fixar o membro traseiro no prato de dissecação com o músculo tibial anterior voltado para cima. Corte a fáscia ao longo do músculo tibial anterior (ta) e puxe-o claro usando fórceps. Identifique e corte o tendão distal do músculo TA. Levante o músculo TA e corte-o cuidadosamente sem puxar o músculo EDL.</li>
		<li>Corte abrir o lado lateral do joelho e expor os dois tendões. Corte o tendão proximal, deixando tanto do tendão quanto possível ainda ligado ao músculo, e levante o músculo EDL (músculo medial), puxando suavemente o tendão. Corte o tendão distal uma vez exposto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montagem do músculo
	<ol>
<li>Fixar o músculo através dos tendões, e aparar toda a gordura extra, fáscia e tendão afastado, tanto quanto possível. Inserir um tendão em um nó pré-amarrado e amarrar a sutura firmemente com sutura amarrando fórceps. Amarrar o segundo nó em torno do gancho de metal.</li>
		<li>Repita o mesmo procedimento com o gancho longo na outra extremidade do tendão. Certifique-se de que nenhum do corpo do músculo é contatado pelas suturas. Isto danificará a preparação.</li>
		<li>Prenda o gancho curto à parte inferior da câmara experimental e o gancho longo ao transdutor/motor da força do modo duplo. Borbulhe a solução na câmara experimental com 100% de oxigénio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Otimizando protocolos de estimulação e comprimento muscular
	<ol>
<li>Esticar o músculo ajustando os Micromanipuladores acoplados ao transdutor/motor para gerar uma tensão da linha de base entre 15 a 20 mN antes de encontrar os melhores parâmetros do estímulo. Ajuste a tensão da estimulação a 40 V. A corrente da estimulação é aumentada sistematicamente até que não haja nenhum aumento adicional na força do Twitch. A mais alta corrente encontrada é aumentada em cerca de 50% para garantir a ativação supra-máxima.</li>
		<li>Encontre o comprimento ideal, L0, definido como o comprimento muscular que dão força máxima de contração, aumentando o comprimento muscular e ativando o músculo com um único contração até que a força ativa (força de pico menos força basal) pára de aumentar.</li>
		<li>Realize uma contração tetânica curta (1 s ativação) para testar a montagem e esticar o músculo de volta para a força basal ideal, se necessário. Registre o comprimento muscular em mm com um paquímetro digital.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. difração de raios-X
Nota: A seguinte descrição é para experimentos de difração de raios x feitos usando o instrumento de difração de raios x de pequeno ângulo na beamline 18id da Biocat na fonte avançada de fótons, laboratório nacional de Argonne, mas métodos semelhantes poderiam ser empregados em outras linhas de linhas luz como o ID 02 na ESRF (França) e BL40XU em SPring8 (Japão). Beamline 18ID é operado em uma energia fixa do feixe de raio X de 12 keV (comprimento de onda de 0,1033 nanômetro) com um fluxo do incidente de ~ 1013 fótons por o segundo no feixe cheio.
<ol><li>Escolha uma amostra para a distância do detector (comprimento da câmera). Use um comprimento de câmera de 1,8 m para experimentos examinando a actina de 2,7 nm e reflexões de miosina de ordem alta, como reflexos meridional de 2,8 nm. Use uma câmera de 4-6 m para outros experimentos, onde um está principalmente interessado em detalhes finos no meridiano e linhas de camada</li>
	<li>
Otimizando a posição da amostra em feixe
	<ol>
<li>Determine a posição do feixe usando uma parte de papel sensível do raio X que produza um ponto escuro em resposta aos raios X ("uma queimadura"). Em seguida, use um gerador de cabelo cruzado de vídeo para criar um cross-Hair alinhado com a marca de queimadura no papel ou simplesmente fazer uma marca na tela de vídeo com uma caneta marcador.</li>
		<li>Use a interface gráfica do usuário fornecida pela BioCAT para o posicionador de amostra para mover o músculo para ser centrado na posição do feixe. Oscilar a câmara da amostra em ~ 10-20 mm/s movendo o estágio da amostra a fim espalhar a dose do raio X sobre o músculo durante a exposição. Observe a amostra como ele se move para evitar grandes regiões de fáscia (contém colágeno que irá poluir os padrões de Difração) e para garantir que ele permanece iluminado durante todo o caminho de sua viagem. Nota: As etapas exatas exigidas nas seções 3,3 e 3,4 para fazer as configurações e as ações exigidas usando a interface de usuário gráfica beamline-fornecida serão beamline e detector específico. Pergunte ao pessoal da beamline como realizar essas operações.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Configurando o detector CCD (dispositivo de carga acoplada) para padrões de alta resolução do músculo em Estados estáticos definidos (descansando, ou durante a contração isométrica)
	<ol>
<li>Configure o tempo de exposição e o período de exposição na interface gráfica do usuário para o software de controle. Tome uma imagem de fundo escura antes de tomar a exposição e repita este procedimento cada 2 horas ou após a mudança do tempo da exposição para corrigir toda a tração na eletrônica do leitura do detector.</li>
		<li>Atenuam o feixe de raios-X para o valor desejado para a exposição. Então pegue uma imagem. Não é possível tirar sequências de imagens com este detector. O detector CCD também precisa de vários segundos para ler uma imagem individual.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Configurando o detector de pixel array para um experimento de tempo resolvido
	<ol>
<li>Configure o número de imagens, o tempo de exposição, o período de exposição na interface gráfica do usuário. O detector de pixel array usado aqui precisa de pelo menos 1 ms para leitura. A frequência máxima do quadro para o detector de contagem de fótons é 500 Hz. Use o sinal de saída do detector de contagem de fótons para controlar o obturador de raios X.</li>
		<li>Atenuar o feixe para a intensidade desejada. Armar o detector e aguardar o gatilho do sistema de aquisição de dados. Sincronize os dados mecânicos e de raio X ao acioná-los ao mesmo tempo. Os padrões de raios-X são coletados continuamente ao longo do protocolo a com um tempo de exposição de 1 ms e um período de exposição de 2 ms. Nota: O tempo exato de exposição e o período de exposição devem ser determinados caso a caso para as informações desejadas e a vida útil observada da amostra no feixe. Atenuar o feixe, a fim de não usar mais raio-X do que é necessário para fornecer dados analisáveis no período de exposição escolhido.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. pós-experimento de tratamento muscular
<ol><li>Recupere e pese o músculo após cada experimento mecânico e de raios-X. Calcule a área transversal do músculo usando o comprimento do músculo medido e a massa muscular11 assumindo uma densidade muscular de 1, 6 g/ml12.</li>
	<li>Esticar o músculo para o comprimento experimental e fixar o músculo em formalina 10% por 10 min. Separe o músculo fixo em uma série de feixes de fibra selecionados a partir de locais ao longo de toda a seção transversal muscular3.</li>
	<li>Meça o comprimento do sarcômero usando um sistema de medição do comprimento do sarcômero video.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ma, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thick-Filament+Extensibility+in+Intact+Skeletal+Muscle.">Thick-Filament Extensibility in Intact Skeletal Muscle.</a> Biophysical Journal. 115 (8), 1580-1588 (2018).</li><li>Ma, W., Gong, H., Irving, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+Head+Configurations+in+Resting+and+Contracting+Murine+Skeletal+Muscle.">Myosin Head Configurations in Resting and Contracting Murine Skeletal Muscle.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (9), (2018).</li><li>Kiss, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nebulin+stiffens+the+thin+filament+and+augments+cross-bridge+interaction+in+skeletal+muscle.">Nebulin stiffens the thin filament and augments cross-bridge interaction in skeletal muscle.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (41), 10369-10374 (2018).</li><li>Ochala, J., Gokhin, D. S., Iwamoto, H., Fowler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pointed-end+capping+by+tropomodulin+modulates+actomyosin+crossbridge+formation+in+skeletal+muscle+fibers.">Pointed-end capping by tropomodulin modulates actomyosin crossbridge formation in skeletal muscle fibers.</a> Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 28 (1), 408-415 (2014).</li><li>Lindqvist, J., Iwamoto, H., Blanco, G., Ochala, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fraction+of+strongly+bound+cross-bridges+is+increased+in+mice+that+carry+the+myopathy-linked+myosin+heavy+chain+mutation+MYH4(L342Q).">The fraction of strongly bound cross-bridges is increased in mice that carry the myopathy-linked myosin heavy chain mutation MYH4(L342Q).</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 6 (3), 834-840 (2013).</li><li>Huxley, H. E., Stewart, A., Sosa, H., Irving, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+diffraction+measurements+of+the+extensibility+of+actin+and+myosin+filaments+in+contracting+muscle.">X-ray diffraction measurements of the extensibility of actin and myosin filaments in contracting muscle.</a> Biophysical Journal. 67 (6), 2411-2421 (1994).</li><li>Wakabayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+diffraction+evidence+for+the+extensibility+of+actin+and+myosin+filaments+during+muscle+contraction.">X-ray diffraction evidence for the extensibility of actin and myosin filaments during muscle contraction.</a> Biophysical Journal. 67 (6), 2422-2435 (1994).</li><li>Anderson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mavacamten+stabilizes+a+folded-back+sequestered+super-relaxed+state+of+&#946;-cardiac+myosin.">Mavacamten stabilizes a folded-back sequestered super-relaxed state of &#946;-cardiac myosin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2018).</li><li>National Research Council. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guide+for+the+care+and+use+of+laboratory+animals.">Guide for the care and use of laboratory animals.</a> Institute for Laboratory Animal Research (U.S.) &amp; National Academies Press (U.S.). , (2011).</li><li>. How to Calibrate Your Dual-Mode Lever System Using DMC Available from: <a target="_blank" href="https://aurorascientific.com/how-to-calibrate-your-dual-mode-lever-system-using-dmc/">https://aurorascientific.com/how-to-calibrate-your-dual-mode-lever-system-using-dmc/</a> (2017)</li><li>Alexander, R. M. V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dimensions+of+knee+and+ankle+muscles+and+the+forces+they+exert.">The dimensions of knee and ankle muscles and the forces they exert.</a> Journal of Human Movement Studies. 1, 115-123 (1975).</li><li>Burkholder, T. J., Fingado, B., Baron, S., Lieber, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+Muscle-Fiber+Types+and+Sizes+and+Muscle+Architectural+Properties+in+the+Mouse+Hindlimb.">Relationship between Muscle-Fiber Types and Sizes and Muscle Architectural Properties in the Mouse Hindlimb.</a> Journal of Morphology. 221 (2), 177-190 (1994).</li><li>Jiratrakanvong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> MuscleX: software suite for diffraction X-ray imaging V1.13.1. , (2018).</li><li>Reconditi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+filament+activation+in+the+heart+is+tuned+to+the+mechanical+task.">Myosin filament activation in the heart is tuned to the mechanical task.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 3240-3245 (2017).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

As publicações recentes de nosso grupo mostraram que os testes padrões do raio X do músculo esqueletal do rato podem ser usados para derramar a luz na informação estrutural sarcomérica do músculo na saúde e na doença1,2,3 especial com a disponibilidade aumentada de modelos genéticos modificados do rato para vários myopathies. Estudos mecânicos de alta resolução em fibras únicas ou pequenos feixes combinados com difração de raios-X é melhor feito por especialistas. Se, entretanto, a informação mecânica mais modesta bastará para seus propósitos, a preparação inteira do músculo permite a coleção de testes padrões detalhados do raio X de uma preparação simples.
Uma dissecção limpa é a chave para uma experiência combinada bem-sucedida de raio-X e mecânica. É muito importante não puxar o músculo alvo, bem como outros músculos associados com os músculos sóleo ou EDL durante a dissecção, uma vez que isso poderia rasgar partes do músculo e levar à força reduzida. Pode igualmente conduzir à estrutura interna danificada que degradará os testes padrões do raio X. Uma vez que tudo vai se espalhar no feixe de raios-X, é importante para limpar qualquer gordura extra, o colágeno na fáscia, bem como todos os pêlos ou pedaços soltos de tecido ao fazer o seguinte protocolo. Para reduzir a conformidade adicional na preparação do músculo, é igualmente importante amarrar firmemente os tendões aos ganchos, tão perto como possível ao corpo do músculo sem danificá-lo.
Os tempos de exposição diferentes do raio X podem fornecer tipos diferentes da informação do mesmo músculo. Usando o feixe completo em 18id, um teste padrão Equatorial analisáveis pode ser obtido em uma exposição de 1 senhora (veja Figura 2D). Para uma primeira reflexão de linha de camada de miosina analisáveis, um tempo de exposição total de 10 ms é normalmente necessário. Para coletar reflexões meridianos de ordem superior, como a M15 (reflexão meridional de miosina de 2,8 nm) e a reflexão meridional da actina 2,7 nm, normalmente é necessária uma exposição total de pelo menos 1 s, mas é recomendada uma exposição total de mais de 2 s para alta precisão Medidas.
A escolha do detector de raios-X ideal para o experimento é importante. Para os padrões de raios-X mais detalhados um detector CCD personalizado, como o da BioCAT com ca. 40 μm pixels e ~ 65 μm ponto spread funções no fósforo, pode fornecer padrões com alta gama dinâmica e boa resolução espacial, mas só pode tomar um quadro de cada vez. Para experimentos com tempo resolvido, o detector de pixel array de contagem de fótons na BioCAT pode coletar padrões de raios-X em 500 Hz. O tamanho do pixel de 172 μm com este detector, entretanto, não fornece a suficiente definição espacial para estudos detalhados da parte interna do meridiano mas é adequado para a maioria outros de finalidades. A Biocat adquiriu um detector de contagem de fótons de alta resolução proporcionando 75 μm de resolução real a uma taxa de quadros máxima de 9.000 Hz. detectores semelhantes deste tipo são esperados para suplantar detectores de corrente para estudos musculares ao longo dos próximos anos.
Com os fluxos muito elevados de raios-X em síncrotrons de terceira geração, o dano de radiação é uma preocupação séria. É sempre uma boa escolha para atenuar o feixe para entregar não mais feixe do que é necessário para observar as características de difração desejada. A mesma exposição total do raio X pode ser conseguida prolongando o tempo da exposição de um feixe atenuado. Uma vantagem do fóton contando detectores de pixel array é que os quadros individuais podem ser somados juntamente com nenhuma penalidade de ruído. Mesmo assim, o dano de radiação é possível. Sinais de dano de radiação inclui gota de força máxima de contração, manchas de reflexos de linha de camada, até mesmo a mudança de cor muscular.
Uma das limitações da preparação do músculo esquelético do rato intacto é a dificuldade em obter o comprimento do sarcômero do músculo intacto durante os experimentos. Os músculos são muito grossos para microscopia de vídeo e difração de laser. Quando com desenvolvimentos futuros pode ser possível estimar o comprimento do sarcômero diretamente dos testes padrões da difração14, no termo próximo a única opção é medi-la após o experimento como descrito aqui.

A difração de raio X de pequeno ângulo de síncrotron é o método de escolha para estudar a estrutura da nm-escala de contratar ativamente preparações musculares condições fisiológicas. É importante ressaltar que as informações estruturais de preparações musculares vivas ou esfoladas podem ser obtidas em sincronia com dados fisiológicos, como alterações da força muscular e do comprimento. Tem havido crescente interesse em aplicar esta técnica para estudar a base estrutural de doenças musculares hereditárias que têm a sua base em mutações pontuais em proteínas sarcomericas. A comunidade de Biofísica muscular tem sido muito ativa na geração de modelos de camundongo transgênicos para essas condições de doenças humanas que poderiam fornecer leitos de teste ideais para estudos estruturais. Publicações recentes do nosso grupo1,2,3 e outros4,5 indicaram que os padrões de raios-X dos músculos extensor de rato digitorum longo (EDL) e sóleo podem fornecer todos os difração de informação disponível a partir de mais tradicionais organismos modelo, como sapo e coelho do psoas músculo esquelético. Uma vantagem da preparação do músculo esqueletal do rato é a facilidade da dissecção e de executar experimentos fisiológicos básicos membrana-intactos, inteiros do músculo. As dimensões do músculo dissecado têm massa suficiente para produzir padrões musculares altamente detalhados em tempos de exposição de raios-X muito curtos (~ milissegundo por quadro) em beamlines de raios-X de terceira geração.
Os padrões de difração do raio X do músculo consistem nas reflexões Equatorial, nas reflexões meridional assim como nas reflexões da linha de camada. A razão de intensidade Equatorial (razão da intensidade das reflexões Equatorial 1, 1 e 1,0, I11/i10), está intimamente correlacionada com o número de pontes cruzadas anexas, que é proporcional à força gerada no músculo esquelético do rato 2. as reflexões meridianos que relatam periodidades dentro dos filamentos grossos e finos podem ser utilizadas para estimar a extensibilidade do filamento1,3,6,7. As características da difração não no meridiano e no Equador são chamadas linhas da camada, que se levantam das cabeças aproximadamente helicoidalmente ordenadas da miosina na superfície da espinha dorsal grossa do filamento assim como os filamentos finos aproximadamente helicoidalmente requisitados. A intensidade das linhas de camada de miosina está intimamente relacionada ao grau de ordenação das cabeças de miosina várias condições2,8. Todas essas informações podem ser utilizadas para estudar os comportamentos das proteínas sarcomericas in situ na saúde e na doença.
A difração de raios X de síncrotron do músculo tem sido historicamente feita por equipes de especialistas altamente especializados, mas os avanços tecnológicos e a disponibilidade de novas ferramentas de redução de dados indicam que isso não precisa ser sempre o caso. O BioCAT beamline 18ID na fonte avançada do fóton, laboratório nacional de Argonne dedicou a equipe de funcionários e facilidades da sustentação para executar experiências do difraction do raio X do músculo que podem ajudar novatos ao campo começ começado em usar estas técnicas. Muitos usuários optam por colaborar formalmente com a equipe da BioCAT, mas um número crescente de usuários descobre que eles podem fazer os experimentos e analisar-se reduzindo a carga sobre a equipe beamline. O objetivo principal deste artigo é fornecer treinamento que forneça experimentadores potenciais com as informações necessárias para planejar e executar experimentos no sistema de músculo esquelético do mouse na linha de beamline Biocat ou em outros linhas luz de alto fluxo em torno do mundo onde esses experimentos seriam possíveis.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:793px;" width="793">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;">#5 forceps</td>
			<td style="width:131px;">WPI</td>
			<td style="width:87px;">500342</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;">4/0 surgical suture</td>
			<td style="width:131px;">Braintree Sci</td>
			<td>SUT-S 108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">aquarium air stone</td>
			<td>uxcell</td>
			<td></td>
			<td>a regular air stone from a pet store would be fine</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CCD detector</td>
			<td>Rayonix Inc</td>
			<td>MAR 165 CCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">data accquisition system</td>
			<td>Aurora Scientific Inc</td>
			<td>610A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;">elastomer compound</td>
			<td style="width:131px;">Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:240px;">High resolution photon counting detector</td>
			<td>Dectris Inc</td>
			<td>EIGER X 500K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">high-power bi-phasic current stimulator</td>
			<td>Aurora Scientific Inc</td>
			<td>701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iris Scissors</td>
			<td style="width:131px;">WPI</td>
			<td>501263-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;">micro scissor</td>
			<td style="width:131px;">WPI</td>
			<td>503365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">motor/force transducer</td>
			<td>Aurora Scientific Inc</td>
			<td>300C-LR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;">petri-dish</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">photon counting detector</td>
			<td>Dectris Inc</td>
			<td>Pilatus 3 1M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless Steel wire</td>
			<td style="width:131px;">McMaster-carr</td>
			<td>8908K21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Suture Tying Forceps</td>
			<td style="width:131px;">WPI</td>
			<td>504498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Video sarcomere length measuring system</td>
			<td>Aurora Scientific Inc</td>
			<td>900B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

x-ray diffraction of intact murine skeletal muscle as a tool for studying the structural basis of muscle disease

Os modelos transgênicos do rato têm sido ferramentas importantes para estudar a relação do genótipo ao phenotype para doenças humanas que incluem aquelas do músculo esqueletal. O músculo esquelético do rato demonstrou produzir padrões de difração de raios-X de alta qualidade em linhas luz de síncrotron de terceira geração, proporcionando uma oportunidade de vincular alterações ao nível do genótipo a fenótipos funcionais em saúde e doença, determinando as consequências estruturais das alterações genéticas. Apresentamos protocolos detalhados para a preparação de espécimes, coletando os padrões de raios-X e extraindo parâmetros estruturais relevantes dos padrões de raios-X que podem ajudar a orientar os experimentadores que desejam realizar tais experimentos para si mesmos.

Contração tetânica isométrica. Qualquer tipo de experimento mecânico muscular clássico, como contrações isométricas ou isotônicas, pode ser realizado com a aquisição simultânea de padrões de raios-X. Figura 1 A mostra a configuração experimental para experimentos mecânicos e de raios-X. Um traço de força de exemplo para uma contração tetânica isométrica é mostrado na Figura 1B. O músculo foi mantido em repouso por 0,5 s antes de ser ativado por 1 s. A gravação mecânica pára 1 s após o estímulo. Os testes padrões do raio X foram coletados continuamente durante todo o protocolo no tempo de exposição de 1 ms em 500 hertz.
Padrões de difração de raios-X. O padrão de difração de raios X do músculo pode dar informações estruturais de resolução de nanômetros de estruturas dentro do sarcômero. Os padrões de difração de raios X do músculo são compostos por quatro quadrantes equivalentes divididos pelo Equador e pelo meridiano. O padrão Equatorial surge da embalagem do miofilament dentro do sarcômero perpendicular ao eixo da fibra, enquanto os padrões meridiais relatam informações estruturais dos miofilamentos ao longo do eixo muscular. As reflexões restantes não no Equador ou no meridiano são chamadas de linhas de camada. As linhas de camada (por exemplo, características rotuladas MLL4 e ALL6 na Figura 2a) surgem do arranjo aproximadamente-helicoidal de subunidades moleculares dentro da miosina contendo filamentos grossos e a actina contendo filamentos finos. As linhas de camada com base em miosina são fortes e afiadas nos padrões do músculo em repouso (Figura 2a), enquanto as linhagens de camada actina são mais proeminentes nos padrões de contração muscular (Figura 2B). Os padrões de diferença obtidos subtraindo o padrão de repouso do padrão de contratação (Figura 2C) podem lançar luz sobre as mudanças estruturais durante o desenvolvimento da força em músculo saudável e doente. Ao seguir essas mudanças estruturais na escala de tempo de milissegundos dos eventos moleculares durante a contração muscular, os padrões de difração de raios X podem revelar informações estruturais substanciais (Figura 2D).
Análise de dados usando o MuscleX. Aqui está um exemplo de análise de reflexos equatoriais utilizando a rotina "Equador" no pacote MuscleX (Figura 3). O MuscleX é um pacote de software de análise de código aberto desenvolvido na BioCAT13. A razão de intensidade Equatorial (I1,1/i1,0) é um indicador da proximidade da miosina à actina no músculo de repouso (Figura 3a), enquanto ele está intimamente correlacionado com o número de pontes cruzadas anexas na contratação ( Figura 3B) músculo esquelético murino2. A razão de intensidade, I1,1/i1,0, é de cerca de 0,47 no músculo em repouso e cerca de 1,2 no músculo contratante. A distância entre os dois 1,0 reflexão (2 * S1, 0) é inversamente relacionada ao espaçamento entre filamentos. Documentações detalhadas e manuais para MuscleX estão disponíveis on-line13.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59559/59559fig1.jpg"> Figura 1 : Instalação e protocolo mecânicos e do experimento do raio X. (A) o músculo é montado em uma extremidade a um gancho dentro da câmara experimental e a outra extremidade a um transdutor do motor/força do modo duplo. É realizada entre duas janelas de filme Kapton para permitir que os raios-X para passar. A câmara é preenchida com solução de Ringer perfundidos com 100% de oxigénio durante todo o experimento. (B) o protocolo mecânico para experimentos de raios-X em um músculo durante a contração tetânica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59559/59559fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59559/59559fig2.jpg"> Figura 2 : Padrões de difração de raios X EDL. Padrão de difração de raios X do músculo EDL de repouso (a) e contração (B) muscular. (C) o padrão de diferença entre o padrão de repouso e de contratação. A região azul indica alta intensidade no padrão de repouso, enquanto a região amarela representa alta intensidade no padrão de contratação. (D) padrão de difração de raios X de uma exposição de 1 ms com músculo EDL. MLL1 = linha de camada de miosina de primeira ordem; MLL4 = quarta linha de camada de miosina de ordem; ALL1 = linha de camada de actina de primeira ordem ALL6 = sexta linha de camada de actina de ordem; ALL7 = sétima linha de camada de actina da ordem; TM = reflexo da tropomiosina (indicada por uma caixa branca); M3 = reflexão meridional da terceira ordem; M6 = sexto pedido de reflexão meridional. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59559/59559fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59559/59559fig3.jpg"> Figura 3 : Análise de dados de padrões equatoriais utilizando MuscleX. O fundo subtraído o perfil da relação da intensidade Equatorial (quando a área) e as primeiras cinco ordens (linhas verdes) eram cabidas para calcular a intensidade de cada pico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59559/59559fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about X-ray Diffraction of Intact Murine Skeletal Muscle as a Tool for Studying the Structural Basis of Muscle Disease at JoVE.com

X-ray Diffraction of Intact Murine Skeletal Muscle as a Tool for Studying the Structural Basis of Muscle Disease

Difração de raios X do músculo esquelético murino intacto como uma ferramenta para estudar a base estrutural da doença muscular

Nós apresentamos protocolos detalhados para executar experimentos do difraction do raio X do pequeno-ângulo usando os músculos esqueletais do rato intact. Com a ampla disponibilidade de modelos de camundongo transgênicos para doenças humanas, esta plataforma experimental pode formar um leito de teste útil para elucidar a base estrutural de doenças musculares genéticas

Transgenic mouse models have been important tools for studying the relationship of genotype to phenotype for human diseases including those of skeletal ...

O músculo esquelético fisiologicamente intacto do camundongo pode produzir padrões de difração de raios-X de alta qualidade contendo muitas informações estruturais que podem fornecer insights sobre processos fisiológicos. A difração de raios-X é a única técnica que permite a aquisição de informações estruturais de alta resolução do tecido muscular vivo em condições fisiológicas reais em tempo fisiológico real. Muitas doenças musculares são herdadas.Com o aumento da disponibilidade para modificar geneticamente a maioria dos modelos de miopatias, a difração de raios-X pode fornecer insights estruturais em mecanismos de doença e indicar estratégias terapêuticas. A maioria dos músculos extensor digitorum longus e soleus são particularmente convenientes para este fim. Mas muitos outros músculos em animais pequenos podem ser dissecados intactos e manuseados de forma semelhante.Antes de iniciar o procedimento, ligue o transdutor combinado de força motora, o controlador transdutor de força motor com um estimulador de corrente bifásica de alta potência, e um sistema de controle de aquisição de dados de controle de computador. Em seguida, pulverize a pele no membro traseiro do mouse com solução fria de Ringer e use uma tesoura de dissecção fina para cortar a pele ao redor da coxa. Usando fórceps número cinco, puxe rapidamente a pele para baixo para expor os músculos e amputar o membro traseiro.Coloque o membro em um prato de dissecação revestido de elastômero contendo a solução de Ringer oxigenado e coloque o prato sob um microscópio de dissecação binóculo. Para colher o músculo soleus, fixe o membro traseiro com o músculo gastrocnemius voltado para cima. Use uma tesoura fina para cortar o tendão distal do grupo muscular gastrocnemius/soleus.Corte a fáscia de ambos os lados do músculo gastrocnemius para permitir que os músculos sejam levantados suavemente e lentamente longe do osso. Em seguida, liberte o tendão proximal do músculo soleus. Fixar o grupo muscular contendo o músculo gastrocnemius e o tendão distal no prato.Levante o músculo soleus suavemente através do tendão proximal para separá-lo do músculo gastrocnemius, deixando o máximo do tendão distal soleus intacto possível. Para colher o extensor digitorum longus ou músculo EDL, fixe o membro traseiro no prato com o músculo tíibal anterior voltado para cima e corte a fáscia ao longo do músculo tibialis anterior. Use fórceps para puxar a fáscia clara e cortar o tendão distal do músculo tibialis anterior.Levante o músculo anterior tibialis e corte-o cuidadosamente sem puxar o músculo EDL, e corte o lado lateral do joelho para expor os dois tendões. Corte o tendão proximal, deixando-nos muito do tendão possível ainda ligado ao músculo e puxe suavemente o tendão para levantar o músculo EDL. Em seguida, corte o tendão distal uma vez que ele é exposto.Para montar o músculo colhido, fixe o músculo através dos tendões e corte o máximo possível de gordura extra, fáscia e tendão. Insira um tendão em um nó pré-amarrado e use fórceps de amarrar sutura para amarrar a sutura firmemente. Amarre o segundo nó ao redor do gancho de metal e repita o procedimento na outra extremidade do tendão.Em seguida, conecte o gancho curto à parte inferior da câmara experimental, e o gancho longo ao motor transdutor de força de modo duplo. Bolha a solução na câmara experimental com 100% de oxigênio. Para otimizar o protocolo de estimulação e o comprimento muscular ajuste os micro manipuladores ligados ao motor transdutor para gerar uma tensão de linha de base entre 15 a 20 milnewtons para encontrar os melhores parâmetros de estímulo para esticar o músculo.Coloque a tensão de estimulação em 40 volts. A corrente de estimulação será sistematicamente aumentada até que não haja aumento adicional na força do contração. Para encontrar o comprimento ideal, aumente o comprimento muscular e ative o músculo com uma única contração até que a força ativa pare de aumentar.Realize uma contração tetanica de um segundo para testar a montagem e esticar o músculo de volta para a força de base ideal, conforme necessário. Em seguida, registo o comprimento muscular em milímetros com uma pinça digital. Para determinar a posição do feixe, use um pedaço de papel sensível ao raio-X que produz uma mancha escura em resposta aos raios-X e um gerador de mira de vídeo para criar uma mira alinhada com a marca de queimadura no papel.Usando a interface gráfica de usuário fornecida pelo BioCAT para o posicionador de amostra, centralizar o músculo na posição do feixe e mover o estágio da amostra para oscilar a câmara amostral a 10 a 20 milímetros por segundo para espalhar a dose de raios-X por todo o músculo durante a exposição. Observe a amostra enquanto se move para evitar grandes regiões de fáscia que contêm colágeno e para garantir que ela permaneça iluminada durante todo o trajeto de sua viagem. Armar o detector e esperar o gatilho do sistema de aquisição de dados.Em seguida, acione os dados mecânicos e de raios-X ao mesmo tempo para sincronizá-los. Os padrões de raios-X serão coletados continuamente ao longo do protocolo com um tempo de exposição de 10 milissegundos e um período de exposição de 50 milissegundos. Nesta contração tetanica isométrica representativa, o músculo EDL ficou em repouso por 0,5 segundos antes de ser ativado por um segundo, seguido por um relaxamento de 1,5 segundos.O padrão de difração de raios-X muscular pode dar informações estruturais de resolução de nanômetros de estruturas dentro do sarcomere. Linhas de camada baseadas em miosina contendo filamentos grossos são fortes e afiadas em padrões de músculo de repouso, enquanto linhas de camada baseadas em actina contendo filamentos finos são mais proeminentes em padrões de contrair músculos. Padrões de diferença obtidos subtraindo o padrão de repouso do padrão de contração podem lançar luz sobre mudanças estruturais durante o desenvolvimento da força em músculos saudáveis e doentes.Seguindo essas mudanças estruturais na escala de tempo de milissegundos dos eventos moleculares durante a contração muscular e relaxamento, os padrões de difração de raios-X podem revelar informações estruturais substanciais. Nesta análise representativa de reflexões equatoriais utilizando a rotina do Equador no pacote MuscleX de código aberto, a razão de intensidade equatorial indica a proximidade da mosina para atuar no músculo de repouso e está intimamente correlacionada com o número de pontes cruzadas anexadas na contração do músculo esquelético murino. A distância entre os dois 1,0 reflexo está inversamente relacionada ao espaçamento do cruzamento.Uma dissecção limpa é a chave para um experimento de raio-X muscular intacto bem sucedido, então tente evitar qualquer dano mecânico durante a preparação muscular. Qualquer protocolo fisiológico padrão com músculos inteiros pode ser implementado nesses experimentos e pode ser usado para estudar a ativação muscular, relaxamento e comportamento de ponte cruzada durante a transitoriedade mecânica rápida. A manipulação genética de ratos está se tornando cada vez mais sofisticada.Novos modelos de camundongos transgênicos permitirão que experimentos mais específicos e perspicazes sejam projetados para indicar novas direções terapêuticas para miopatias humanas.

Education

Research

JoVE Core

JoVE Journal

Cell Biology

Developmental Biology

Unit 1

The Cytoskeleton I: Actin and Microfilaments

Analyzing Cells and Proteins

SCIENTISTS IN ACTION

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Análise de Zebrafish larvas Músculo Esquelético Integrity com Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Biologia do Desenvolvimento

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Usando mitocôndrias isoladas de quantidades mínimas de Rato Músculo Esquelético para alta taxa de transferência de microplacas respiratórias Medições

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Indução da Aguda Skeletal regeneração muscular por cardiotoxina Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Preparação e cultivo de células precursoras Miogênica / mioblastos primárias de músculo esquelético de Adulto e Idoso Humanos

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Avaliação da senescência induzida por lesão e na Vivo reprogramação no músculo esquelético

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Aplicação da estimulação crônica para estudar ratos induzida pela atividade contrátil adaptações fenotípica de músculo esquelético

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Identificação de células satélite de músculo esquelético por imunofluorescência com anticorpos de laminina e Pax7

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Na Vivo Imagem latente da morfogênese músculo-tendão em pupas de Drosophila

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

Isolamento, cultura, caracterização e diferenciação de células progenitoras do músculo humano do procedimento de biópsia do músculo esquelético

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle ...

Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice

Realizando xenoenxertos de músculo esquelético humano em camundongos imunodeficientes

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this ...