The Fralin Life Science Research Institute and The Metabolic Phenotyping Core at Virginia Tech supported this work.

NOTA: Este protocolo começa depois de se ter isolado mitocôndrias de músculo esquelético vermelho. As mitocôndrias foram isoladas como descrito anteriormente a partir de ~ 75 - 100 mg de músculo esquelético vermelho 13. Entre 5 - 10 mg / mL de proteína mitocondrial vai ser atingido a partir desta quantidade de tecido por ressuspensão do sedimento final em mitocondrial ≤50 ul de tampão de isolamento para as mitocôndrias (IBM) 2 (Ver Frisard et ai 13). 1. Setup <ol><li> Preparar soluções de trabalho (Tabela 1) e uma solução de ensaio mitocondrial (MAS) misturas (Tabela 2) para os ensaios subsequentes. Nota: A maior parte da preparação para os ensaios pode ser efectuada previamente, como a maioria das soluções stocks e mas pode ser armazenado. </li><li> Hidratar um cartucho de ensaio respirométrico em 1 ml de solução de calibração a noite anterior à experiência numa incubadora sem CO 2 a 37 ° C. </li><li> No dia da experiência, take fora stocks congelados (substratos e moduladores mitocondriais, mistura MAS, MAS w / o BSA, a Tabela 1) e descongelamento em temperatura de 37 ° C banho ou incubadora. </li><li> Prepare todas as soluções de substrato (Tabela 3) e injeções (Tabela 4-5) e ajustar o pH como desejado (pH 7,4). Depois de o pH é ajustado, armazenar em gelo. </li><li> Programa a máquina multi-bem medição do consumo de oxigênio para mistura adequada, esperar, e parâmetros de medida (ver Tabela 6) e fundo do rótulo e poços grupo / condição por entrar pela primeira vez o software de análise, seguido do modo &quot;Standard&quot;. <ol><li> Entre no fórum &quot;Guest&quot; e clique em &quot;Ensaio Wizard&quot;. Uma vez no &quot;Ensaio Wizard&quot;, clique em &quot;Protocolo&quot; para alterar a mistura, espere, e medir parâmetros. Rotular os poços de fundo sob a &quot;Voltar. Correção &quot;guia e certifique-se de destacar&quot; Faça correcção de fundo &quot;. </li><li> Etiqueta conditions primeiro clicando na aba &quot;Grupos &amp; Labels&quot;, seguido do separador &quot;Info Grupo&quot;. Após esses parâmetros são inseridos, clique em &quot;Finalizar&quot;, seguido por &quot;Salvar modelo&quot;. </li></ol></li></ol> 2. O ensaio de Run <ol><li> Coloque as soluções para injecção em um cartucho de teste de ensaio e iniciar a calibração por entrar pela primeira vez o software de análise, seguido por entrar no modo &quot;Standard&quot;. Entre no fórum &quot;Convidado&quot;. Abra o modelo salvo na etapa 1.5 sob o drive &quot;XF&quot;, sob a guia &quot;Modelos&quot;. Uma vez aberta, clique em &quot;Start&quot; para iniciar a calibração. Nota: O cartucho de teste de ensaio deve ser introduzido na máquina com o canto marcado para o canto inferior esquerdo. Isso leva cerca de 30 min. Tome cuidado para injetar soluções nas portas apropriadas. Injeções na Tabela 4-5 são listados em ordem de carregamento. </li><li> Gentilmente, mas misture bem o mitochondestoque Ria por agitação da solução com uma pipeta de ponta de 200 ul, seguido por trituração do estoque suavemente com uma pipeta de ponta de 200 mL que tenha tido o seu orifício alargado cortando ~ 3 mm da extremidade da ponta com uma tesoura. </li><li> Realizar um ensaio de ácido bicinconínico (BCA) para determinar a concentração de proteína do estoque mitocondrial. </li><li> Usando a concentração de estoque adquirido a partir do passo 2.3, ressuspender 10 ug de proteína mitocondrial / 200 ul da mistura de substrato de succinato / rotenona (Tabela 3). Ressuspender 14 ug de proteína mitocondrial / 200 ul das misturas de substrato restantes (Isto deve ser feito para cada mistura de substrato) (Tabela 3). Coloque tudo mitocondrial proteína / substrato mistura em gelo. Nota: A quantidade óptima de proteína mitocondrial por poço para cada ensaio foi determinado como anteriormente descrito 9. Determinou-se que o piruvato / malato, palmitoil carnitina / malato, glutamato / malato de umd Os ensaios de fluxo de electrões utiliza 3,5 ug de proteína mitocondrial, enquanto o ensaio de succinato / rotenona utiliza 2,5 ug de proteína mitocondrial por poço. Portanto, o pesquisador precisa para voltar a suspender proteína mitocondrial suficiente para 4 repetições nesta etapa já que qualquer um de 2,5 mg ou 3,5 mg por 50 ul é carregado por poço (Veja o passo 2.6). </li><li> Misturar as soluções de mitocôndrias / substrato suavemente, mas completamente por agitação da solução com uma pipeta de ponta de 200 ul, seguido por trituração do estoque suavemente com uma pipeta 200 uL da ponta que tem tido ~ 3 mm da sua extremidade cortada. </li><li> Colocar uma placa de cultura de células em gelo e em triplicado, carga de 50 ul / poço de cada uma das misturas de mitocôndrias / substrato. Os desenvolvedores do microplacas ensaio respirométrico recomendável deixar um mínimo de dois em branco (sem mitocôndrias) poços, de preferência em ambos os lados na placa de cultura de células. </li><li> Girar a placa de cultura de células a 2000 g durante 20 min a 4 ° C. Enquanto a placa é Sfixar, aquecer as soluções de substrato num banho de água a 37 ° C. </li><li> Após a centrifugação é completa, carregar cuidadosamente 450 ul de cada solução de substracto em cima dos respectivos poços (isto é, carregar o piruvato / malato de substrato para os poços que têm mitocôndrias inicialmente ressuspensas nesta solução substrato). Certifique-se de carregar a placa à temperatura ambiente. Nota: poços do branco deve ser carregado com 500 ul de substrato. Poços designados em branco para o ensaio de fluxo de electrões devem ser carregados com o fluxo de electrões do substrato (Piruvato / Malato + FCCP), enquanto que o ensaio em branco juntamente poços podem ser carregados com qualquer substrato de ensaio de acoplamento. Nota: Se a realização dos ensaios de fluxo acoplados e eletrônica na mesma placa, o pesquisador deve realocar poços de fundo para os respectivos ensaios após o ensaio de funcionamento está completo utilizando a plataforma &quot;XF Reader&quot; por meio da guia &quot;Instrumento&quot;. Uma vez dentro do ambiente &quot;Instrumento&quot;, clique em &quot;Administração&quot;guia, seguido por &quot;correcção de fundo&quot;. Hit &quot;End Modo Configuração do Instrumento&quot; quando completa. Isto é porque a combinação de ascorbato / TMPD pode consumir O2, assim, é necessária uma correcção de fundo separada para cada tipo de ensaio. </li><li> Após a 450 ul de substrato é adicionada a cada poço, ver a camada de mitocôndrias no poço para assegurar as mitocôndrias são dispersos uniformemente em uma única monocamada (ampliação de 20X [Ver Rogers 9, Figura 4]). Wells que não aparecem para ter uma monocamada distribuído uniformemente pode ser removido post hoc. </li><li> Depois de verificar a aderência mitocondrial, insira a microplaca no instrumento ensaio respirométrico e iniciar o ensaio executado, clicando em &quot;OK&quot;. Nota: A calibração do passo 2.1 deve ser concluída antes do prazo começará. Uma vez que o pesquisador clica em &quot;OK&quot;, a máquina irá ejetar a placa utilitário que foi utilizado para a calibragem. <ol> &lt;li&gt; Remova a placa de utilidade e colocar a placa de cultura celular que contém a mitocôndria na bandeja. O entalhe azul na placa de cultura celular deve ser colocado no canto inferior esquerdo da bandeja. Clique em &quot;continuar&quot; para iniciar o ensaio de execução. </li></ol></li><li> Após a corrida é completa, retire a placa de cultura de células e cartucho pressionando &quot;Eject&quot; na tela. <ol><li> Uma vez que a placa é ejetado, retire e descarte a placa de cultura de células e cartucho e clique em &quot;Continuar&quot; na tela. A corrida será automaticamente salva como um arquivo .xls no arquivo &quot;Dados&quot;. </li></ol></li><li> Abra esse arquivo e alterar a exibição de &quot;O2&quot; para &quot;OCR&quot; batendo na seta para baixo sob a &quot;Y1:&quot; marcador. <ol><li> Próxima mudança &quot;Middle Point&quot; para &quot;Point-to-Point Rates&quot; sob a &quot;Data Rate exibido como:&quot; opção. Clique em &quot;OK&quot; para aplicar estas mudanças. </li></ol&gt; </li><li> Clique na guia &quot;Modo Grupo Bem&quot; na parte inferior esquerda da tela para poços grupo de condições semelhantes. Por fim, clique no botão &quot;Amostra Média Standard / Error&quot; guia em direção ao centro da tela, à esquerda. Alternativamente, esses comandos podem ser configurado antes do ensaio começa no ajuste &quot;Assistente de Ensaio&quot;. Nota: Cada condição terá uma média ± desvio padrão para cada taxa exibida e cada condição. Existem medidas tomadas taxa por condição (estado 2 [Coupling] / State3u [Electron Fluxo] respiração seguido por quatro injeções). Use a média da taxa de estado 2 da segunda medição, determinar Estado 4o no ponto mínimo após oligomicina injecção, utilize o ponto máximo de Estado 3 e 3U Estado após ADP e injeção FCCP, respectivamente, e usar o ponto mínimo para Antimicina A respiração induzida Para os ensaios de ligação. Use o ponto máximo para o piruvato / malato induzida respiração 3U Estado, use o mínimoponto para rotenone induzida respiração, usar o ponto máximo para succinato induzida 3U Estado respiração e usar o ponto mínimo para Antimicina A respiração induzida para o ensaio Electron Flow. Todas as experiências foram realizadas 3 vezes e os dados são mostrados os resultados de um traçado representativo. </li></ol>

<ol>
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George W. Rogers é um funcionário da Seahorse Bioscience que fabrica o instrumento para que se desenvolveram nestes ensaios.

Os métodos apresentados neste artigo fornecem instruções passo-a-passo para a realização de uma coleção de ensaios em microplacas respirométricos utilizando mitocôndrias isoladas 75-100 mg de rato músculo esquelético. Estes ensaios podem ser realizados com grande precisão como evidenciado pelo desvio padrão apertado entre poços em triplicado. É importante ressaltar que estes ensaios permitem identificar respirométricos de onde anomalias e / ou adaptações podem estar ocorrendo na ETC, ciclo TCA, via β-oxidação, transportadores de substrato, etc. em um modelo animal comumente usados. É importante destacar a justificativa para o uso vários combustíveis e inibidores utilizados neste protocolo. O piruvato / malato e glutamato / malato respirométricos ensaios permitem a avaliação de respiração mediada Complexo I, bem como a avaliação dos respectivos transportadores, e, no caso de o glutamato, a desaminase 15. Alternativamente, a combinação desuccinato / rotenone permite a avaliação de fluxo respiratória mitocondrial através Complexo II da ETC desde rotenone inibe complexo I e succinato fornece elétrons para Complex II através da redução da flavina adenina dinucleotídeo (FADH 2) 15. Estes ensaios fornecem informações específicas de substrato como a eficiência de acoplamento e respiração máxima. O ensaio de fluxo de electrões é único na medida em que a combinação dos substratos e inibidores permite a avaliação de complexos de múltiplas durante o fluxo respiratório mitocondrial 9. A mistura de substrato inicial de piruvato / malato + FCCP permite a avaliação da respiração máxima impulsionado por Complexo I, enquanto que a injecção de rotenona seguido por succinato permite a respiração para a avaliação máxima impulsionado por complexo II. A injecção de antimicina A, um inibidor do complexo III, seguindo-se a injecção de ascorbato / TMPD permitir que o para a avaliação da respiração impulsionado por complexo IV uma vez que o ascorbato / TMPD é umdoador de elétrons para citocromo C / Complexo IV. Embora nenhuma informação sobre a eficiência de acoplamento é obtido, o método é ideal para amostras muito pequenas que impedem a execução de vários substratos de forma independente. Finalmente, a utilização de palmitoil carnitina / malato permite a avaliação da coordenação entre β-oxidação e a etc desde o equivalente reduzindo produzido a partir da oxidação do ácido palmítico (β-oxidação) alimentar o ETC através do electrão transferência flavoproteína 15. Deve notar-se que os ensaios de fluxo de acoplamento de electrões e também poderiam ser usados ​​em conjunto para identificar alterações na função mitocondrial devido a alguma intervenção (tratamento da toxicodependência, manipulação genética). A elevada precisão alcançadas para estes ensaios é principalmente devido a uma mistura completa das mitocôndrias, quer seja antes da determinação da proteína, ou com as soluções de substrato. Ao longo destas linhas, uma vez que a mitocôndria é resuspendend no solutio substratoNS, que é crítico para misturar esta solução cuidadosamente antes de carregar a placa de cultura celular tal como descrito na etapa 2.2, com uma ponta de pipeta de orifício alargado. A falha em misturar cuidadosamente as mitocôndrias irá conduzir a grande variação dentro do ensaio. Além disso, usando uma pipeta de orifício de ponta estreita vai criar forças de cisalhamento durante a mistura a mitocôndria e aumenta o potencial para danificar as membranas mitocondriais e libertação do citocromo C. O passo de aderência (2.7) é também um passo crítico neste protocolo. A falha para girar a placa de cultura celular carregado longa / suficientemente rápido resultará na adesão incompleta das mitocôndrias para o poço, levando, assim, aumentada a variabilidade entre poços e medições. O protocolo descrito foi otimizado para incluir: carregar uma quantidade ideal de proteína mitocondrial por poço, utilizando as concentrações / métodos de preparação corretos para fazer soluções de reserva e de substrato, alterando o ensaio de execução para garantir pla estado mitocondrialteaus, ea mistura adequada das ações e mitocondrial / substrato mitocondriais misturas. Antes destes esforços de otimização, os autores encontraram armadilhas no ensaio de execução. A seguir discute métodos de resolução de problemas / modificações que foram úteis na otimização deste protocolo. Com relação à carga ideal, carregamento muito pouco mitocôndrias não vai provocar uma resposta robusta, ao carregar demais mitocôndrias irá esgotar o oxigênio dentro do microcï¿½ara e levar a medições imprecisas. Rogers et al 9 fornece exemplos de determinação dos montantes de carregamento ideais de mitocôndrias por poço para microplacas ensaios respirométricos. Mais frequentemente, demasiado mitocôndria é carregado por poço como evidenciado pelo estado 2 taxas sobre 100-200 pmol / min / bem e estado 3 Taxas&gt; 1500 pmol / min / poço. Se ocorre ao longo de carregamento, realizar uma experiência com concentrações variáveis ​​de proteína mitocondrial (por exemplo, entre 1 -. 10 ^ g) para induzir OCRs dentro do r dinâmicaange da máquina de medição do consumo de oxigênio. Preparação e colocação das concentrações corretas de substratos e estoques é de extrema importância. Sempre utilizar a forma de ácido de substratos / injecções e ajustar o pH com hidróxido de potássio ou HCl; buffers de sódio / soluções não são recomendados. Além disso, substratos ressuspensão / stocks em DMSO ou etanol 100% resultará em falha de medição ou erro. Certifique-se de usar etanol a 95% onde indicado. É comum para palmitoil carnitina para precipitar para fora do etanol a 95% após o descongelamento do lote congelado, causando, assim, uma grande variabilidade. Certifique-se de aquecer o estoque palmitoyl carnitina e vortex bem antes de usar. Além disso, uma altamente variável piruvato / malato resultado do ensaio pode ser devido ao ser da piruvato&gt; 2 semanas de idade. Certifique-se de refazer alíquotas congeladas de piruvato a cada 2 semanas. A corrida ensaio foi modificado para 2 mínimo de medidas para assegurar planaltos estaduais mitocondriais. Se a observação de exaustão de ADP é desejado, o pesquisador podeestender o tempo de medição sob a guia &quot;Protocolo&quot; no âmbito do fórum &quot;Assistente de Ensaio&quot;. Finalmente, uma grande variabilidade ocorre quando o banco de soluções e mitocôndrias mitocondrial mais substrato não são homogeneizadas totalmente antes do carregamento. Se variabilidade entre os poços é alta após o ensaio de funcionamento, certifique-se misturar completamente a solução de substrato antes do próximo experimento. Nunca vortex as soluções mitocôndrias / substrato, em vez agitar, mash, e triturar delicadamente com uma pipeta de ponta orifício alargado. Existem algumas limitações desta técnica que são dignos de nota. Em primeiro lugar, o número de poços na placa de cultura de células utilizado para estes ensaios é relativamente baixa (isto é., De 24 poços e, pelo menos, 2 designado para poços em branco). Se for desejado para executar todos os 5 desses ensaios sobre um prato, o pesquisador só é capaz de analisar as respostas de um rato de cada vez. No entanto, deve notar-se que 96 de instrumentos também estão disponíveis para higher taxa de transferência. Em segundo lugar, há pontos fortes e fracos inerentes na avaliação da disfunção mitocondrial em mitocôndrias isoladas em comparação com 1 em células intactas. Algumas fraquezas incluem ter relevância fisiológica menos em comparação com células intactas e induzindo artefatos do processo de isolamento. Finalmente, o sucesso deste método depende da qualidade do processo de isolamento mitocondrial. Embora alguns destes ensaios foram ambos desenvolvidos em sistemas diferentes ou ter sido validada em outros modelos animais, os métodos aqui apresentados são os primeiros a sintetizar todos os ensaios acima mencionados para a utilização óptima de um multi-poços máquina de medição do consumo de oxigénio utilizando rato músculo esquelético. Mais importante, todos os 5 desses ensaios podem ser realizados com a quantidade de mitocôndrias isoladas de ~ 75 - 100 mg de músculo esquelético do rato, proporcionando assim material de alto rendimento com um mínimo. De grande importância, a capacidade de multi-poçostecnologias de consumo de oxigénio para executar os ensaios com quantidades mínimas de mitocôndrias, combinada com um método de isolamento optimizado, permite ao investigador para executar uma multiplicidade de outras experiências com o resto do tecido do músculo esquelético (por exemplo., Western blots, RT-PCR, ensaios enzimáticos, etc.), que muitas vezes é uma luta com este modelo animal. Em conclusão, os métodos aqui apresentados fornecem instruções passo-a-passo para a realização de uma coleção de ensaios em microplacas respirométricos usando quantidades mínimas de rato músculo esquelético. Mais importante, os métodos apresentados requerem quantidades mínimas de tecido e mitocôndrias. Uma vez dominado, as técnicas aqui descritas irão permitir que os investigadores a determinar um mecanismo potencial de um composto ou produto do gene mitocondrial no consumo de oxigénio em um modelo animal utilizado.

O principal papel fisiológico das mitocôndrias do músculo esquelético é produzir ATP a partir de 1 de fosforilação oxidativa. É importante ressaltar que as mitocôndrias musculares esqueléticas desempenhar um papel específico na capacidade de exercício 2, 3 envelhecimento, doença degenerativa 4 e diabetes tipo II 5. Como o envelhecimento da sociedade, e diabetes Tipo II sendo o 7º principal causa de morte nos Estados Unidos 6, a necessidade de métodos para avaliar a função mitocondrial tornou-se cada vez mais prevalente na investigação biomédica 7,8. Especificamente, a medição do consumo de oxigênio tem utilidade excepcional na avaliação da função mitocondrial, uma vez que representa a função coordenada entre os genomas mitocondriais e nucleares para expressar os componentes funcionais da fosforilação oxidativa 9. Várias tecnologias existem que permitem a medição do consumo de oxigénio em células intactas e isolard mitocôndrias 7-10. Além disso, os ensaios foram desenvolvidos para vários tipos de células e tecidos, e uma variedade de espécies que permitem a medição das vias respiratória mitocondrial e controlo 9,11,12. No entanto, não existe actualmente um vazio na literatura no que diz respeito à compilação de todos estes ensaios utilizando mitocôndrias isoladas de rato músculo esquelético para utilização em tecnologias de consumo de oxigénio em microplacas. É importante ressaltar que o uso de microplacas ensaios respirométricos está crescendo entre os biólogos mitocondriais e permite medições de alto rendimento, utilizando quantidades mínimas de mitocôndrias isoladas 9. Portanto, uma coleção de ensaios em microplacas respirométricos foram desenvolvidos que permitem identificar de onde anomalias e / ou adaptações podem estar ocorrendo na cadeia de transporte de elétrons (ETC). Além disso, dois ensaios respirométricos em microplacas adicionais foram desenvolvidos que permitem a avaliação da coordenação between o ciclo de ácido tricarboxílico (TCA) e do ETC, e entre ß-oxidação eo ETC. É importante ressaltar que os métodos apresentados fornecem uma maneira clara e concisa para medir mudanças mecânicas em função mitocondrial em um modelo animal comumente usados.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>63559</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic, minimum 99.0%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5379</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate, ACS reagent, 99.0-102.0%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES minimum 99.5% titration</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essentially Fatty&#160;</td>
			<td rowspan="2">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="2">A6003</td>
			<td rowspan="2">Store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid Free- BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic Acid, 98%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>107360</td>
			<td>Store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9512</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L(-) Malic Acid, BioXtra, &#8805;95%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6413</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">L-Glutamic acid</td>
			<td rowspan="2">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="2">G1251</td>
			<td rowspan="2">Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethyl-p-phenylenediamine</td>
			<td rowspan="2">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="2">T7394</td>
			<td rowspan="2">Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99%, powder [TMPD]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoyl L-carnitine chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1645</td>
			<td>Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin A, &#8805; 95% (HPLC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td>Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)</td>
			<td rowspan="3">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="3">C2920</td>
			<td rowspan="3">Store at 2-8&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylhydrazone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#8805;98% (TLC), powder [FCCP]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A from streptomyces sp.</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td>Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Adenosine 5&#8242;-diphosphate monopotassium salt dehydrate [ADP]</td>
			<td rowspan="2">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="2">A5285</td>
			<td rowspan="2">Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce&#8482; BCA Protein Assay Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of mitochondrial function in this tissue has become more prevalent. Although many technologies and assays exist that measure mitochondrial respiratory pathways in a variety of cells, tissue and species, there is currently a void in the literature in regards to the compilation of these assays using isolated mitochondria from mouse skeletal muscle for use in microplate based technologies. Importantly, the use of microplate based respirometric assays is growing among mitochondrial biologists as it allows for high throughput measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. Therefore, a collection of microplate based respirometric assays were developed that are able to assess mechanistic changes/adaptations in oxygen consumption in a commonly used animal model. The methods presented herein provide step-by-step instructions to perform these assays with an optimal amount of mitochondrial protein and reagents, and high precision as evidenced by the minimal variance across the dynamic range of each assay.

A Figura 1 representa as taxas de consumo de oxigénio (OCR) para o piruvato / malato, succinato / rotenona, palmitoil carnitina / malato, glutamato e / malato ensaios (ensaios de acoplamento). Estes traçados de ensaio são apresentados como taxa de consumo de oxigénio ou OCR, em função do tempo, estão correceted fundo, e são apresentados como as taxas de ponto-a-ponto. Cada painel representa o consumo de oxigênio em diferentes estados mitocondriais, como descrito por acaso e Williams 14. O primeiro painel representa o consumo de oxigénio basal, ou Estado 2. O segundo painel, após a injecção de ADP, representa máxima acoplado respiração, ou Estado 3. O terceiro painel, após a injecção de oligomicina A (um inibidor de Complexo V), representa a respiração devido ao vazamento de prótons, ou Estado 4o. O quarto painel, após a injeção de FCCP, representa máxima respiração desacoplado, ou 3U Estado. Finalmente, o quinto painel, após a injecção de antimicina A, representa a inibição da respiração oxidativo. Notavelmente, all estados mitocondriais têm desvio padrão mínimo. Isto é devido a uma mistura completa do estoque mitocondrial e as misturas mitocôndrias / substrato, e a realização de uma única monocamada de mitocôndrias Após a centrifugação de aderência (Passo 2.6). Por outro lado, o carregamento mitocôndrias desiguais em cada poço e não atingir uma única monocamada de mitocôndrias no poço da microplaca leva ao aumento do desvio padrão em cada estado como apresentado na Figura 2. Os traçados em Figura 1 exibição planaltos para cada estado mitocondrial e para cada substrato. O patamar alcançada após dois ciclos de medição sugere boa qualidade mitocondrial e as mitocôndrias que permanece aderida ao poço durante toda a duração do ensaio. Além disso, a obtenção de taxas máximas plateaued pode ser mais desejável uma vez que este permite que o investigador a tomar o OCR média nestes estados mitocondriais, reduzindo assim a tendência que pode ocorrerpor arbitrariamente selecionar um ponto. A quantidade de mitocôndrias por poço foi determinada por meio de ensaios de optimização. A quantidade óptima de mitocôndrias por poço deverá resultar no estado 2 taxas entre 100-200 pmol / min / cavidade e as taxas de estado 3 &lt;1500 pmol / min / cavidade, uma vez que estes valores estão dentro da alcance de detecção de oxigénio dinâmica do multi-poços de oxigénio máquina de medição de consumo. Carregando demasiada proteína mitocondrial por poço pode resultar em OCRs além da gama dinâmica do instrumento (Figura 3A). A Figura 3 representa o carregamento 3,5 ^ g de proteína mitocondrial por poço (rastreio azul), em comparação com a carga de 2,5 ug de proteína mitocondrial por poço (vermelho rastreamento) para o ensaio de succinato / rotenona. Carregando demasiada proteína mitocondrial por poço pode também conduzir ao esgotamento do oxigénio dentro da microcâmara do poço, impedindo, assim, uma medição precisa do OCR para cada medição sucessiva 9 (Figura 3B &lt;/ strong&gt;). Ponto-a-ponto de OCR é a taxa de variação instantânea do OCR. Se plana, o OCR é constante / estável, mas se a diminuir, então pode haver um problema biológico ou técnica. O declínio acentuado em OCR em estado 3 e respiração 3U Estado (Figura 3A) é causado pela mitocôndria esgotar o fornecimento de oxigênio antes do fim da medição (Figura 3B). A Figura 4 representa OCR em função do tempo para o ensaio de fluxo de electrões. O traçado é corrigida e exibidos como descrito para a Figura 1. O primeiro painel neste ensaio representa respiração 3u Estado em piruvato / malato por meio de I. Complexo O segundo painel, após a injecção de rotenona, representa a inibição do complexo I respiração mediada. O terceiro painel, após a injeção de succinato, representa substrato estimulou 3U Estado com elétrons entrar no ETC no Complexo II (Complexo II respiração mediada). O quarto painel, após a injecção de Antimycin A, representa a inibição de Complexo III e, assim, a respiração total. Finalmente, o quinto painel, após a injecção de ascorbato / TMPD, representa Complexo IV respiração mediada. Similar aos traçados da Figura 1, todos os estados têm mitocondriais desvio padrão mínimo, e cada taxa tem ou quase atingiu um patamar. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53216/53216fig1.jpg" /> Figura 1. Ensaios de acoplamento. (A), 10 mM de piruvato / malato 5 mM, (B) succinato 10 mM / 2 uM rotenona, (C) 40 uM palmitoil carnitina / 1 mM de malato, e (D) glutamato 10 mM / 10 mM malato acoplado mitocondriais traçados ensaio respiração conforme determinado por multi-poços medição do consumo de oxigénio. Os valores são expressos como média ± DP. Proteína mitocondrial carregado por poço foi de 3,5 ug para todos os ensaios excepto succinato / rotenona, que utiliza 2,5 ug de proteína mitocondrial por poço. Os dados representam n = 3 repetições biológicas emparelhados. OCR = Consumo de Oxigênio Taxa; ADP = difosfato de adenosina; Oligo = oligomicina A; FCCP = carbonílico cyanide- 4 - (trifluorometoxi) fenil-hidrazona; Anti-A = antimicina A; PYR = Pyruvate; SUCC = Succinate; ROT = Rotenone; PAL-C = palmitoyl carnitina; GLUT = glutamato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53216/53216fig1large.png" style="font-size: 14px; line-height: 28px;" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53216/53216fig2.jpg" /> Figura 2. altamente variável piruvato / malato de Ensaio. Altamente variável 10 mM de piruvato de 5 mm / ensaio malato causada pela mistura incompleta mitocôndrias do estoque mitocondrial no substrato / MAS mistura, levando assim a pró mitocondrial variáveltein carregamento em cada poço. Proteína mitocondrial carregado por poço foi de 3,5 ug. Os dados representam n = 3 repetições biológicas emparelhados. OCR = Consumo de Oxigênio Taxa; ADP = difosfato de adenosina; Oligo = oligomicina A; FCCP = carbonílico cyanide- 4 - (trifluorometoxi) fenil-hidrazona; Anti-A = antimicina A; PYR = Pyruvate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53216/53216fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53216/53216fig3.jpg" /> Figura 3. Sobrecarga Mitocondrial Proteína para o Succinate / Rotenone Ensaio. (A) As taxas de consumo de oxigénio fora do intervalo dinâmico da máquina de medição do consumo de oxigénio multi-poços causado pelo carregamento 3,5 ^ g de proteína mitocondrial por poço (rastreio azul), em comparação com a carga de 2,5 ug de proteína mitocondrial por poço (traçado vermelho). (B ) OxyGen tensão próximos de zero seguinte ADP e injeções FCCP causados ​​pela carga de proteína mitocondrial excessiva (3,5 mg) por poço (traçado azul) em relação ao carregamento de uma quantidade ideal (2,5 mg) de proteína mitocondrial por poço (traçado vermelho). Os dados representam N = 3 repetições biológicas emparelhados por quantidade de proteína mitocondrial. OCR = Consumo de Oxigênio Taxa; ADP = difosfato de adenosina; Oligo = oligomicina A; FCCP = carbonílico cyanide- 4 - (trifluorometoxi) fenil-hidrazona; Anti-A = antimicina A; SUCC = Succinate; ROT = Rotenone; O 2 = Oxigênio; mm Hg = milímetros de mercúrio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53216/53216fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53216/53216fig4.jpg" /> Figura 4. Ensaio de Fluxo de electrões. 5 mM de piruvato / 1 mM de malato + 4 uM FCCP, f electrõesbaixo mitocondrial rastreio tal como determinado por multi-poços medição do consumo de oxigénio ensaio de respiração. Os valores são expressos como média ± DP. Proteína mitocondrial carregado por poço foi de 3,5 ug. Os dados representam n = 3 repetições biológicas emparelhados. OCR = Consumo de Oxigênio Taxa; Anti-A = antimicina A; Asc = ascorbato; TMPD = N, N, N &#39;, N&#39; -tetramethyl- p fenilenodiamina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53216/53216fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="0"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Da Concentração </td><td> MW </td><td> O volume final </td><td> Mass Adicionado </td><td> Comentários / Descrição </td></tr><tr><td></td><td> (H) </td><td> (g / mol) </td><td> (ml) </strong&gt; </td><td> (g ou ml) </td><td></td></tr><tr><td> EGTA, pH 7,2 </td><td> 0,1 </td><td> 380,35 </td><td> 100 ml de 1 M de Tris Base de Dados </td><td> 3,801 g </td><td> Armazenar a 4 ° C </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 1 </td><td> 238.3 </td><td> 250 ml de H2O DIH </td><td> 59. 57 g </td><td> Armazenar a 4 ° C </td></tr><tr><td> MgCl2, hexa-hidrato de </td><td> 1 </td><td> 203,31 </td><td> 250 ml de H2O DIH </td><td> 50,82 g </td><td> Armazenar a 4 ° C </td></tr><tr><td> Piruvato pH 7,4 </td><td> 0,1 </td><td> 88.06 (Vem como solução 14,11 M) </td><td> 40 ml de H2O DIH </td><td> 0,283 ml de ácido pirúvico </td><td> Faça alíquotas de 1 ml e armazenar a -20 ° C, fazer nova a cada duas semanas </td></tr><tr><td> Succinato de pH 7,4 </td><td> 0,5 </td><td> 118,09 </td><td> 100 ml de H2O DIH </td><td> 9,4 g de suácido ccinic </td><td> Faça alíquotas de 1 ml e armazenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> Malato, pH 7,4 </td><td> 0,5 </td><td> 134,09 </td><td> 100 ml de etanol a 95% </td><td> 6,7 g de ácido málico </td><td> Faça 200 mL alíquotas e armazenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> TMPD </td><td> 0,01 </td><td> 164,25 </td><td> 10 ml </td><td> 0,0164 g </td><td> Faça 300 mL alíquotas e armazenar a -20 ° C; Misturar com uma quantidade equimolar de ascorbato de manter TMPD reduzida </td></tr><tr><td> Cloreto de palmitoil-L-carnitina </td><td> 0,01 </td><td> 436,07 </td><td> 1,14 ml de 95% etanol </td><td> 0,005 g </td><td> Faça 40 mL alíquotas e armazenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> A oligomicina </td><td> 0,006 </td><td> 791,06 </td><td> 0,987 ml de 95% etanol </td><td> 0,005 g </td><td> Faça 20 mL alíquotas e armazenar a -20 ° C </td></tr&gt; <tr><td> FCCP </td><td> 0,01 </td><td> 254,17 </td><td> 3,9 ml de 95% etanol </td><td> 0,01 g </td><td> Faça 40 mL alíquotas e armazenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> Rotenone </td><td> 0,001 </td><td> 394,4 </td><td> 10 ml de etanol a 95% </td><td> 0,0039 g </td><td> Armazenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> Antimicina A </td><td> 0,005 </td><td> 548,63 </td><td> 9,12 ml de 95% etanol </td><td> 0,025 g </td><td> Armazenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> K + ADP </td><td> 0,5 </td><td> 501,32 </td><td> 3,9 ml de H2O DIH </td><td> 1,0 g </td><td> Armazenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> Ácido málico, pH 7,4 </td><td> 0,5 </td><td> 134,09 </td><td> 40 ml </td><td> 2,68 g </td><td> Faça 200 mL alíquotas e armazenar a -20 ° C </td></tr></tbody></table><strong&gt; Tabela 1. Soluções de Stock <table border="0"><tbody><tr><td rowspan="2"> Reagente </td><td> Da Concentração </td><td> Mass Adicionado </td><td rowspan="2"> Molarity final / Percent </td></tr><tr><td> (H) </td><td> (g ou ml) </td></tr><tr><td> Sacarose </td><td> - </td><td> 11,98 g </td><td> 70 mM </td></tr><tr><td> Manitol </td><td> - </td><td> 20,04 g </td><td> 220 mM </td></tr><tr><td> Fosfato de potássio monobásico </td><td> - </td><td> 0,34 g </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> MgCl2, hexa-hidrato de </td><td> 1 </td><td> 2,5 ml </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 1 </td><td> 1,0 ml </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 0,1 </td><td> 5,0 ml </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> Essencialmente Ácidos Graxos Free- BSA </td><td> - </td><td> 1,0 g </td><td> 0.20% </td></tr></tbody></table> . Tabela 2. MAS Mix pH 7,4, 500 ml: alíquota de 25 ml e armazenar a -20 ºC * Nota: Excluir BSA para MAS mistura usada para injeções de ensaio. <table border="0"><tbody><tr><td> Substrato Médio </td><td> Concentração final </td><td> Quantidade de ações (ul) </td><td> Quantidade de MAS * (ml) </td></tr><tr><td rowspan="2"> Pyruvate / Malate </td><td rowspan="2"> 10 mM / 5 mM </td><td> Piruvato: 1000 </td><td rowspan="2"> 9 </td></tr><tr><td> Malate: 100 </td></tr><tr><td rowspan="2"> Succicinate / Rotenone </td><td rowspan="2"> 10 mm / 2 uM </td><td> Succinato: 200 </td><td rowspan="2"> 10 </td></tr><tr><td> Rotenone 20 </td></tr><tr><td rowspan="3"> * Pyruvate / Malato + FCCP </td><td rowspan="3"> 5 mM / 1 mM / 4? M </td><td> Piruvato: 500 </td><td rowspan="3"> 10 </td></tr><tr><td> FCCP: 4 </td></tr><tr><td> Malato: 20 </td></tr><tr><td> Palmitoil-L-carnitina / Malato </td><td> 40 jiM / 1 mM </td><td> Palmitoylcarnitine: Malato 40: 20 </td><td> 10 </td></tr><tr><td rowspan="2"> Glutamato / malato </td><td rowspan="2"> 10 mM / 10 mM </td><td> Glutamato: 400 </td><td rowspan="2"> 10 </td></tr><tr><td> Malato: 200 </td></tr></tbody></table> Tabela 3. Soluções de substrato pH 7,4: Adicione fresco o dia do experimento. * A solução ensaio de escoamento Electron. <table border="0"><tbody><tr><td> Injeção Médio </td><td> Concentração </td><td> Quantidade de ações (ul) </td> &lt;td&gt; O montante do MAS (ml) </td><td> Quantidade injectada no cartucho </td><td> Concentração final </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> (Depois de injectados em placa) </td></tr><tr><td> ADP </td><td> 50 mM </td><td> 300 ul </td><td> 3 </td><td> 50 ul </td><td> 5,0 mM </td></tr><tr><td> A oligomicina </td><td> 20 uM </td><td> 10 ul </td><td> 3 </td><td> 55 ul </td><td> 2,0 mM </td></tr><tr><td> FCCP </td><td> 40 uM </td><td> 12 ul </td><td> 3 </td><td> 60 ul </td><td> 4,0 mM </td></tr><tr><td> Antimicina A </td><td> 40 uM </td><td> 24 ul </td><td> 3 </td><td> 65 ul </td><td> 4,0 mM </td></tr></tbody></table> Tcapazes 4. As injecções para ensaios acoplados pH 7,4:. Adicione fresco o dia do experimento. * Os ensaios de acoplamento incluem (mas não estão limitados a) piruvato / malato, succinato / rotenona, palmitoil carnitina / malato, glutamato e / malato. <table border="0"><tbody><tr><td> Injeção Médio </td><td> Concentração </td><td> Quantidade de ações (g ou ul) </td><td> Quantidade de MAS (ml) </td><td> Quantidade injectada no cartucho </td><td> Concentração final (após injetado na placa) </td></tr><tr><td> Rotenone </td><td> 20 uM </td><td> 60 ul </td><td> 3 </td><td> 50 ul </td><td> 2,0 mM </td></tr><tr><td> Succinate </td><td> 50 mM </td><td> 300 ul </td><td> 3 </td><td> 55 ul </td><td> 5,0 mM </td></tr><tr><td> Antimicina A </td><td> 40 uM </td><td> 24 μ;eu </td><td> 3 </td><td> 60 ul </td><td> 4,0 mM </td></tr><tr><td> TMPD / Ascorabte </td><td> 1 mM, 100 mM </td><td> TMPD: 300 ul </td><td> 3 </td><td> 65 ul </td><td> 100 uM, 10 mM </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Ascorbato: 0,059 g </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 5. As injecções para Electron Ensaio de Fluxo de pH 7,4:. Adicione fresco no dia do experimento <table border="0"><tbody><tr><td> Comando </td><td> Tempo (min) </td><td> # De ciclos </td></tr><tr><td> Calibrar </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Aguarde </td><td> 10 min (para permitir que a placa para aquecer a partir do passo a aderência) </td><td></td></tr><tr><td> Misturar </td><td> 1 minuto </td><td rowspan="2"> 2 </td></tr><tr><td> Euasure </td><td> 2 min </td></tr><tr><td> Injectar A </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Misturar </td><td> 1 minuto </td><td rowspan="2"> 2 </td></tr><tr><td> Medida </td><td> 2 min </td></tr><tr><td> Injectar B </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Misturar </td><td> 1 minuto </td><td rowspan="2"> 2 </td></tr><tr><td> Medida </td><td> 2 min </td></tr><tr><td> Injectar C </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Misturar </td><td> 1 minuto </td><td rowspan="2"> 2 </td></tr><tr><td> Medida </td><td> 2 min </td></tr><tr><td> Injectar D </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Misturar </td><td> 1 minuto </td><td rowspan="2"> 2 </td></tr><tr><td> Medida </td><td> 2 min </td></tr></tbody></table> Tabela 6. Instrumento Executar protocolo.

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Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

The methods presented provide step-by-step instructions for the performance of a collection of microplate based respirometric assays using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle. These assays are able to measure mechanistic changes/adaptations in mitochondrial oxygen consumption in a commonly used animal model.

Usando mitocôndrias isoladas de quantidades mínimas de Rato Músculo Esquelético para alta taxa de transferência de microplacas respiratórias Medições

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

Isolamento e Quantitative Immunocytochemical caracterização de células Miogênica primários e fibroblastos de músculo-esquelético humano

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Biologia do Desenvolvimento

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Análise de Zebrafish larvas Músculo Esquelético Integrity com Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced skeletal muscle regeneration is a widely used, powerful model system to study the events involved in muscle regeneration as well as the mechanisms and different players. Indeed, a detailed knowledge of this process is essential for a better understanding of the pathological conditions that lead to skeletal muscle degeneration, and it aids in identifying new targeted therapeutic strategies. The present work describes a detailed and reproducible protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in mice through a single intramuscular injection of cardiotoxin (CTX). CTX belongs to the family of snake venom toxins and causes myolysis of myofibers, which eventually triggers the regeneration events. The dynamics of skeletal muscle regeneration is evaluated by histological analysis of muscle sections. The protocol also illustrates the experimental procedures for dissecting, freezing, and cutting the Tibialis Anterior muscle, as well as the routine Hematoxylin &#38; Eosin staining that is widely used for subsequent morphological and morphometric analysis.

This manuscript describes a detailed protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in adult mice and subsequent manipulations of the muscles, such as dissection, freezing, cutting, routine staining, and myofiber cross-sectional area analysis.

Indução da Aguda Skeletal regeneração muscular por cardiotoxina Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting occurs. Loss of muscle mass and function is associated with muscle fiber type atrophy, fiber type switching, defective muscle regeneration associated with dysfunction of satellite cells, muscle stem cells, and other pathophysiological processes. These changes are associated with changes in intracellular as well as local and systemic niches. In addition to most commonly used rodent models of muscle ageing, there is a need to study muscle homeostasis and wasting using human models, which due to ethical implications, consist predominantly of in vitro cultures. Despite the wide use of human Myogenic Progenitor Cells (MPCs) and primary myoblasts in myogenesis, there is limited data on using human primary myoblast and myotube cultures to study molecular mechanisms regulating different aspects of age-associated muscle wasting, aiding in the validation of mechanisms of ageing proposed in rodent muscle. The use of human MPCs, primary myoblasts and myotubes isolated from adult and aged people, provides a physiologically relevant model of molecular mechanisms of processes associated with muscle growth, atrophy and regeneration. Here we describe in detail a robust, inexpensive, reproducible and efficient protocol for the isolation and maintenance of human MPCs&#160;and their progeny&#160;&#8212; myoblasts and myotubes from human muscle samples using enzymatic digestion. Furthermore, we have determined the passage number at which primary myoblasts from adult and aged people undergo senescence in an in vitro culture. Finally, we show the ability to transfect these myoblasts and the ability to characterize their proliferative and differentiation capacity and propose their suitability for performing functional studies of molecular mechanisms of myogenesis and muscle wasting in vitro.

This protocol describes a robust, reproducible and simple method of isolation and culture of myoblast progenitor cells from the skeletal muscle of adult and aged people. The muscles used here include foot and leg muscles. This approach enables the isolation of an enriched population of primary myoblasts for functional studies.

Preparação e cultivo de células precursoras Miogênica / mioblastos primárias de músculo esquelético de Adulto e Idoso Humanos

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at least two pericyte subpopulations (called type I and type II), which express different molecular markers and have distinct differentiation capabilities. Using NG2-DsRed and Nestin-GFP double-transgenic mice, type I (NG2-DsRed+Nestin-GFP-) and type II (NG2-DsRed+Nestin-GFP+) pericytes have been successfully isolated. However, the availability of these double-transgenic mice prevents the widespread use of this purification method. This work describes an alternative protocol that allows for the easy and simultaneous isolation of type I and type II pericytes from skeletal muscles. This protocol utilizes the fluorescence-activated cell sorting (FACS) technique and targets PDGFR&#946;, rather than NG2, together with the Nestin-GFP signal. Following isolation, type I and type II pericytes show distinct morphologies. In addition, type I and type II pericytes isolated with this new method, like those isolated from the double-transgenic mice, are adipogenic and myogenic, respectively. These results suggest that this protocol can be used to isolate pericyte subpopulations from skeletal muscles and possibly from other tissues.

This work describes a FACS-based protocol that allows for easy and simultaneous isolation of type I and type II pericytes from skeletal muscles.

Isolamento de Pericitos Tipo I e Tipo II de Músculos Esqueléticos de Rato

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To investigate the underlying mechanisms that bring about various muscle adaptations, a number of exercise protocols such as treadmill, wheel running, and swimming exercise have been used in the animal studies. However, these exercise models require a long period of time to achieve muscle adaptations, which may be also regulated by humoral or neurological factors, thus limiting their applications in studying the muscle-specific contraction-induced adaptations. Indirect low frequency stimulation (10 Hz) to induce chronic contractile activity (CCA) has been used as an alternative model for exercise training, as it can successfully lead to muscle mitochondrial adaptations within 7 days, independent of systemic factors. This paper details the surgical techniques required to apply the treatment of CCA to the skeletal muscle of rats, for widespread application in future studies.

This protocol describes the use of the chronic contractile activity model of exercise to observe stimulation-induced skeletal muscle adaptations in the rat hindlimb.

Aplicação da estimulação crônica para estudar ratos induzida pela atividade contrátil adaptações fenotípica de músculo esquelético

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, antibodies for specific cell markers are applied on tissue sections. In adult skeletal muscle, satellite cells (SCs) are stem cells that contribute to muscle repair and regeneration. Therefore, it is important to visualize and trace the satellite cell population under different physiological conditions. In resting skeletal muscle, SCs reside between the basal lamina and myofiber plasma membrane. A commonly used marker for identifying SCs on the myofibers or in cell culture is the paired box protein Pax7. In this article, an optimized Pax7 immunofluorescence protocol on skeletal muscle sections is presented that minimizes non-specific staining and background. Another antibody that recognizes a protein (laminin) of the basal lamina was also added to help identify SCs. Similar protocols can also be used to perform double or triple labeling with Pax7 and antibodies for additional proteins of interest.

The precise identification of satellite cells is essential for studying their functions under various physiological and pathological conditions. This article presents a protocol to identify satellite cells on adult skeletal muscle sections by immunofluorescence-based staining.

Identificação de células satélite de músculo esquelético por imunofluorescência com anticorpos de laminina e Pax7

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

X-ray Diffraction of Intact Murine Skeletal Muscle as a Tool for Studying the Structural Basis of Muscle Disease

Transgenic mouse models have been important tools for studying the relationship of genotype to phenotype for human diseases including those of skeletal muscle. Mouse skeletal muscle has been shown to produce high quality X-ray diffraction patterns on third generation synchrotron beamlines providing an opportunity to link changes at the level of the genotype to functional phenotypes in health and disease by determining the structural consequences of genetic changes. We present detailed protocols for preparation of specimens, collecting the X-ray patterns and extracting relevant structural parameters from the X-ray patterns that may help guide experimenters wishing to perform such experiments for themselves.

We present detailed protocols for performing small-angle X-ray diffraction experiments using intact mouse skeletal muscles. With the wide availability of transgenic mouse models for human diseases, this experimental platform can form a useful test bed for elucidating the structural basis of genetic muscle diseases

Difração de raios X do músculo esquelético murino intacto como uma ferramenta para estudar a base estrutural da doença muscular

Transgenic mouse models have been important tools for studying the relationship of genotype to phenotype for human diseases including those of skeletal ...

Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle regenerative process. There are recognized challenges to working with human primary adult stem cells, particularly human muscle progenitor cells (hMPCs) derived from skeletal muscle biopsies, including low cell yield from collected tissue and a large degree of donor heterogeneity of growth and death parameters among cultures. While incorporating heterogeneity into experimental design requires a larger sample size to detect significant effects, it also allows us to identify mechanisms that underlie variability in hMPC&#160;expansion capacity, and thus allows us to better understand heterogeneity in skeletal muscle regeneration. Novel mechanisms that distinguish the expansion capacity of cultures have the potential to lead to the development of therapies to improve skeletal muscle regeneration.

We present techniques for isolating, culturing, characterizing, and differentiating human primary muscle progenitor cells (hMPCs) obtained from skeletal muscle biopsy tissue. hMPCs obtained and characterized through these methods can be used to subsequently address research questions related to human myogenesis and skeletal muscle regeneration.

Isolamento, cultura, caracterização e diferenciação de células progenitoras do músculo humano do procedimento de biópsia do músculo esquelético

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle ...

Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this failure is the use of inadequate laboratory models. It is challenging to model complex human diseases in traditional laboratory organisms, but this issue can be circumvented through the study of human xenografts. The surgical method we describe here allows for the creation of human skeletal muscle xenografts, which can be used to model muscle disease and to carry out preclinical therapeutic testing. Under an Institutional Review Board (IRB)-approved protocol, skeletal muscle specimens are acquired from patients and then transplanted into NOD-Rag1null IL2r&gamma;null (NRG) host mice. These mice are ideal hosts for transplantation studies due to their inability to make mature lymphocytes and are thus unable to develop cell-mediated and humoral adaptive immune responses. Host mice are anaesthetized with isoflurane, and the mouse tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles are removed. A piece of human muscle is then placed in the empty tibial compartment and sutured to the proximal and distal tendons of the peroneus longus muscle. The xenografted muscle is spontaneously vascularized and innervated by the mouse host, resulting in robustly regenerated human muscle that can serve as a model for preclinical studies.

Complex human diseases can be challenging to model in traditional laboratory model systems. Here, we describe a surgical approach to model human muscle disease through the transplantation of human skeletal muscle biopsies into immunodeficient mice.

Realizando xenoenxertos de músculo esquelético humano em camundongos imunodeficientes

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this ...