Este protocolo é significativo porque pode ser usado para criar xenoenxertos musculares esqueléticos humanos, que podem ser usados para modelar doenças musculares e realizar testes terapêuticos pré-clínicos. Este modelo de xenoenxerto permite que os pesquisadores estudem os músculos humanos in vivo para entender melhor a biologia celular muscular humana e desenvolver novos modelos para doenças musculares raras ou adquiridas. Após a obtenção de uma biópsia muscular humana, coloque a amostra em uma placa de Petri de 100 por 15 milímetros contendo meio muscular, e use um microscópio estéreo e uma tesoura cirúrgica para remover qualquer fáscia restante ou tecido gorduroso.
Disseque a biópsia muscular em pedaços de aproximadamente sete por três por três milímetros, tomando cuidado para que as fibras sejam dispostas longitudinalmente dentro da amostra. Em seguida, transfira a placa de Petri contendo o músculo dissecado no gelo, e coloque suturas sintéticas e não absorvíveis em uma placa petri de 100 por 15 milímetros de 70% de etanol. Depois de confirmar a falta de resposta ao beliscão do dedo do pé em um rato de oito a 12 semanas de idade, anestesiado NOD-Rag-gamma, aplique pomada aos olhos do animal imunodeficente, e use um aparador para remover o cabelo sobreposto do tibialis anterior do tornozelo ao joelho.
Em seguida, aplique creme depilatório na pele exposta por um minuto antes de desinfetar o local cirúrgico com solução povidone-iodo e 70% de etanol. Para enxertar o tecido humano, primeiro fita para baixo da perna do rato, e fazer uma incisão reta sobre a tibialis anterior originária dos tendões distais e terminando abaixo do joelho. Use dissecção sem corte para separar a pele do tecido muscular, e use uma tesoura para fazer uma incisão de menos de 0,5 milímetros através do epimísio do músculo tibialis anterior, começando no tendão e terminando no joelho.
Depois de cortar o tendão distal do tibial anterior, segure o tendão com fórceps de íris, e puxe o músculo para cima em direção ao joelho. Em seguida, corte o tendão distal do extensor digitorum longus, e puxe o extensor digitorum longus até o joelho. Uma vez visível o tendão proximal do músculo peroneus longus, remova o extensor digitorum longus e o tibialis anterior com a tesoura.
Use um lenço cirúrgico molhado com PBS para aplicar uma leve pressão até que a hemostasia seja alcançada, e enfie uma sutura através do tendão peroneus proximal peroneus longus, deixando um pedaço de linha de aproximadamente 1,5 polegadas em ambos os lados do tendão. Faça a primeira metade de um nó quadrado cirúrgico de duas mãos sem apertar para formar um círculo, e coloque um xenoenxerto no círculo, apertando o laço para fixar o tecido do enxerto. Complete a outra metade do nó quadrado para suturar o xenoenxerto no tendão proximal do peroneus longus, e enfie a sutura através do tendão peroneus longo distal para repetir a técnica do nó quadrado no tendão distal.
Quando ambas as extremidades do enxerto tiverem sido fixadas, puxe a pele sobre o músculo xenoenxerado, sele a incisão com cola cirúrgica e coloque de dois a três grampos cirúrgicos sobre a cola. Em seguida, coloque o mouse em uma gaiola limpa em uma almofada aquecida com monitoramento até a recumbência total. Quatro a seis meses após a cirurgia, coloque um béquer coberto contendo 200 mililitros de 2-metilbutano em uma caixa de gelo seco por pelo menos 30 minutos antes da colheita de xenoenxerto.
Quando o 2-metilbutano tiver esfriado, confirme a falta de resposta ao aperto do dedo do pé e remova o cabelo sobreominando a tibialis anterior do tornozelo para o joelho com um aparador e creme depilatório. As suturas que seguram o xenoenxerto no lugar devem ser observadas através da pele. Segure a perna com fita adesiva, e use tesouras e fórceps de íris para abrir a pele sobre o xenoenxerto até que ambas as suturas sejam descobertas.
Use um bisturi para cortar entre o xenoenxerto e a tíbia para libertar um lado do xenoenxerto antes de cortar entre o músculo peroneus longus e o músculo gastrocnemius. Corte abaixo da sutura distal e através do tendão distal do peroneus longus, e use os fórceps de íris para agarrar e desviar a sutura em direção ao joelho enquanto usa uma tesoura para cortar o xenoenxerto longe do tecido muscular subjacente. Em seguida, use uma tesoura para cortar acima da sutura proximal para remover o xenoenxerto e peroneus longus, e coloque o espécime colhido em um pequeno pedaço de papelão.
Fixar o tecido o mais próximo possível das suturas enquanto estica suavemente o músculo para garantir que a orientação das fibras seja mantida durante o processo de congelamento de snap. Quando os pinos estiverem firmemente no lugar, deslize o músculo até os pinos para que o tecido fique logo acima do papelão, e congele o xenoenxerto no pré-resfriado 2-metilbutano para menos 80 graus Celsius armazenamento. Um xenoenxerto bem sucedido demonstra uma regeneração robusta de miofibers humanos como identificado com anticorpos específicos do homem.
A coloração positiva de minosina embrionária dentro de uma proporção de miofibers indica que o processo de regeneração ainda está em curso. Em contraste, a má técnica cirúrgica ou uma amostra inadequada podem levar a uma má regeneração das fibras musculares. Xenoenxertos realizados a partir de um paciente diagnosticado com uma miopatia inflamatória idiopática apresentam um número moderado de miofibers humanos regenerados em coleções de quatro e seis meses, e a coloração de minosina embrionária persiste aos seis meses.
As células inflamatórias também estão presentes dentro do xenoenxerto, como observado pelas manchas de H e E. Os tamanhos individuais de miofibra são semelhantes entre quatro e seis meses em xenoenxertos de miopatia inflamatória idiopática. Fibras raras que mostram uma área transversal superior a 3.500 micrômetros ao quadrado são observadas dentro dos xenoenxertos, mas não nas biópsias de miopatia inflamatória idiopática, indicando que alguns dos miofibers nos xenoenxertos podem se regenerar para uma área transversal semelhante em tamanho aos miofibers saudáveis.
As partes mais importantes deste procedimento são identificar todos os tendões do tornozelo após a incisão inicial ser feita e cortar com sucesso através do epimísio. A competência funcional dos xenoenxertos pode ser avaliada por meio da isolação enzimática de miofibers únicos e testando transitórios de cálcio ou realizando medições forçadas evocadas após estimulação elétrica.
