Isoler les myocytes auriculaires pour les utiliser dans des expériences patch-clamp a grandement fait progresser nos connaissances et la compréhension de l’électrophysiologie auriculaire aux niveaux cellulaire et moléculaire. L’approche que nous utilisons donne effectivement un grand nombre de myocytes auriculaires isolés qui peuvent être utilisés pour étudier l’électrophysiologie auriculaire cellulaire et l’arrhythmogenèse dans un large éventail de modèles expérimentaux et de conditions. Nous avons adopté une approche de digestion du tronc pour isoler les myocytes auriculaires.
L’avantage de cette approche est qu’elle permet au chercheur de choisir la région spécifique qu’il souhaite étudier. Commencez cette procédure par la préparation de l’équipement et des solutions tel que décrit dans le protocole texte. Éloquez la plaque de dissectation, disséquez des outils, une pipette Pasteur et les pipettes polies au feu.
Ce protocole peut être effectué sur des souris mâles ou femelles de type sauvage, des souris porteuses de mutations génétiques et des modèles muraux de maladies. Après l’euthanasie de souris telle que décrite dans le protocole textuel, placez la souris sur une serviette en papier ou un panneau de liège et collez les pattes vers le bas pour maintenir la souris en place. Mouiller la poitrine de la souris avec 70% d’éthanol.
Retirer la fourrure et la peau qui recouvrent la poitrine à l’aide de ciseaux incurvés. Ensuite, utilisez des forceps de dent de rat pour soulever le sternum, puis couper le diaphragme le long du bord des côtes. Retirez la cage thoracique entière à l’aide de ciseaux incurvés pour exposer le cœur.
Pour enlever l’appendice auriculaire, soulevez doucement l’appendice à l’aide de forceps disséquants fins et découpez-le avec des ciseaux à ressort. Transférez immédiatement l’appendice atrial à un plat disséquant recouvert de silicium contenant 20 millilitres de solution de pH 7.4 modifiée réchauffée par Tyrode. Placez une goupille disséquante en haut et une épingle au bas de l’ouverture de l’appendice auriculaire.
À l’aide d’une pipette Pasteur, rincer les atria avec la solution de pH 7.4 de Tyrode modifiée réchauffée pour enlever le sang. Ouvrez l’appendice auriculaire en coupant le long de son bord supérieur et inférieur. Ensuite, épinglez les coins de l’appendice auriculaire vers le bas pour créer un morceau plat rectangulaire de tissu.
Couper l’appendice auriculaire en environ huit à dix bandes de taille égale à l’aide de ciseaux à ressort et de forceps fins. Notez que les bandes se contractent une fois qu’elles sont coupées librement du morceau principal de tissu. À l’aide de la petite pipette polie par le feu de forage, transférer les bandes de tissu dans le premier tube contenant la solution pH 6.9 modifiée de Tyrode réchauffée.
Attends cinq minutes. Maintenant, utilisez la pipette polie au feu moyen pour transférer les bandes de tissu au deuxième tube à fond rond contenant la solution pH 6.9 modifiée de Tyrode. Pour laver les bandes tissulaires, capuchon le tube à fond rond de cinq millilitres et inverser doucement le tube trois fois.
Laissez les bandes tissulaires s’installer au fond du tube avant de transférer les bandes tissulaires vers le troisième tube à l’aide de la pipette polie au feu moyen. Lavez les lanières à nouveau par inversion. Ensuite, transférez les bandes tissulaires dans la solution enzymatique à l’aide d’une pipette polie au feu moyen et incubez pendant 30 minutes.
Faites tourbillonner le tube toutes les trois à cinq minutes pour empêcher les bandes tissulaires d’adhérer ensemble. Au début de la digestion enzymatique, les bandes tissulaires s’installent rapidement après avoir tourbillonnant. À environ 20 minutes de digestion, les bandes tissulaires commencent à flotter dans la solution enzymatique après avoir tourbillonnant.
Pendant ce temps, les bandes de tissu auriculaire changent également d’apparence du rose pâle au blanc pendant qu’elles sont digérées. Après la digestion enzymatique, effectuez trois lavages à l’aide de 2,5 millilitres de solution KB dans les tubes ronds à fond rond préparés de cinq millilitres. Pour chaque lavage, inversez doucement le tube trois fois avant de déplacer le tissu vers le tube suivant à l’aide de la pipette polie au feu moyen.
Après le lavage final, transférer les bandes dans le tube à fond rond de 14 millilitres contenant 2,5 millilitres de solution KB. Attends cinq minutes. Triturer délicatement le tissu pendant 7,5 minutes à l’aide de la pipette polie au feu de l’alésage.
Ceci dissociera mécaniquement les bandes de tissu et donnera une solution trouble remplie des myocytes auriculaires individuels. Le premier de la trituration doit être adapté pour donner un grand nombre de cellules sans endommager les cellules. Tenez compte de facteurs tels que l’âge des souris et l’état de la maladie.
Adaptez la force de trituration à l’isolement individuel en modifiant à la fois la fréquence et la vitesse d’expulsion des bandes tissulaires de la pipette polie par le feu de l’alésage. La trituration douce entraîne un faible rendement cellulaire, tandis que la trituration dure donnera de nombreuses cellules mortes. Remplissez le tube à fond rond de 14 millilitres contenant les bandes de tissu triturées avec la solution KB à un volume final de sept à 10 millilitres selon la densité désirée des cellules pour une utilisation expérimentale.
Placez ce tube à température ambiante pendant une heure. Après cette période d’incubation, les cellules peuvent être utilisées pour une variété d’expériences pendant une période maximale de sept heures. On y voit des exemples de myocytes auriculaires isolés provenant de souris normales.
Les myocytes auriculaires isolés sont généralement de l’ordre de 100 microns de longueur et de 10 microns de largeur avec des stries claires. La capacité des myocytes auriculaires isolés est typiquement 40 à 70 picofarads. Un exemple d’un potentiel d’action atrial de myocyte enregistré utilisant la technique perforée de patch-clamp dans le mode courant de pince est montré.
Une famille représentative de courants de sodium a été enregistrée dans toute la configuration cellulaire de la technique patch-clamp. Ces courants ont été enregistrés à l’aide d’étapes de pince de tension de 50 millisecondes entre 100 et 10 millivolts négatifs à partir d’un potentiel de détention de 120 millivolts négatifs. Une relation sommaire de tension de courant de sodium est présentée ici.
Une famille représentative des courants de calcium a été enregistrée utilisant des étapes de pince de tension de milliseconde de milliseconde entre 60 négatifs et positifs 80 millivolts d’un potentiel de fixation de 70 millivolts négatifs. Une relation de tension de courant de calcium résumée est affichée ici. Une famille représentative des courants de potassium a été enregistrée à partir d’un potentiel de détention de 80 millivolts négatifs utilisant des étapes de pince de tension de 500 millisecondes entre 120 millivolts négatifs et positifs 80 millivolts.
Ici, la relation de tension actuelle résumée est montrée pour le courant de potassium total. Il est important de se rappeler qu’un isolement atrial réussi de myocyte dépend à la fois d’une digestion enzymatique appropriée aussi bien que de la dissociation mécanique des cellules pendant la trituration. Une fois isolés, les myocytes auriculaires peuvent être utilisés dans des expériences de pince à timbres pour les mesures de la morphologie potentielle d’action et des courants ioniques, tels que les courants de sodium, les courants calciques et les courants de potassium.
L’étude des changements dans l’électrophysiologie auriculaire de myocyte a été essentielle pour déterminer la base cellulaire et moléculaire des arythmies auriculaires représentant un danger pour la vie et pour le développement et l’essai des composés anti-arythmiques pour des arythmies auriculaires.
