Notre protocole fournit et approche facile et rapide pour l’isolement primaire de fibroblaste avec un accent clair sur éviter la contamination de bactéries, qui peut être un problème énorme. Surtout pour les débutants. Le principal avantage de notre technique est sa simplicité.
Comme il ne nécessite pas de compétences manuelles étendues ou d’expérience et il peut être facilement appris par tout le monde dans une courte période de formation. Manja Newe, technicienne de l’extérieur du laboratoire, présentera la technique. Avant de commencer la dissection, mettre deux paires de gants jetables, l’un sur le dessus de l’autre.
Et fixer la souris à un tampon de polystyrène. Désinfecter la fourrure avec 70% d’éthanol, en s’assurant que l’animal est trempé. Et utilisez des forceps chirurgicaux stérilisés à l’éthanol et des ciseaux atraumatiques pour tasser la peau juste au-dessus du tractus urogène.
Couper trois à quatre centimètres le long de la ligne médiane de l’incision initiale au cou, en ajoutant des coupures de soulagement aux membres. Et épingler la peau à la garniture pour obtenir un accès optimal à la musculature couvrant la cavité abdominale. Ensuite, désinfectez la musculature abdominale deux fois avec de l’éthanol frais à 70 %.
Lorsque l’éthanol a séché, retirer la première paire de gants. Et utilisez un nouvel ensemble stérile de forceps et ciseaux pour inciser la couche musculaire pour ouvrir la cavité abdominale et le thorax. Pour enlever les organes d’intérêt, saisissez doucement chaque organe avec les forceps chirurgicaux sans percer le tissu.
Et utilisez les ciseaux pour couper soigneusement les vaisseaux sanguins d’alimentation près du point d’entrée de l’organe. Placez chaque organe dans un tube de PBS stérile et froid et fermez le tube hermétiquement. Placer chaque tube sur de la glace humide au fur et à mesure que les organes sont recueillis.
Lorsque tous les organes ont été récoltés, vaporiser les tubes avec 70% d’éthanol avant de les placer dans une hotte stérile de culture cellulaire. Portant une paire de gants frais, utilisez des forceps stériles pour transférer chaque organe sur la moitié d’une boîte de Pétri stérile de six centimètres. Et laver brièvement les organes avec pbs frais pour enlever l’excès de sang.
Transférer les organes rincés dans la deuxième moitié de chaque boîte de Pétri et retirer l’excès de PBS. À l’aide de deux scalpels stériles, hacher les organes en fragments d’un à deux millimètres. Et utilisez une spatule stérile pour transférer les morceaux de tissu dans de nouveaux tubes individuels, stériles et de 15 millilitres.
Ajouter deux millilitres de solution Trypsin à 0,25% à chaque tube. Et placez les tubes dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. À la fin de l’incubation, vortex les tubes à environ 1400 rotations par minute pendant dix secondes.
Et arrêter la réaction de Trypsine avec quatre millilitres d’un milieu approprié de culture complété avec le sérum foetal de veau par tube. Ensuite, ajoutez le volume approprié de la solution de mélange de collagène à chaque tube. Et placez les tubes dans un bain d’eau ultrasonique de 37 degrés Celsius pendant 10 minutes.
À la fin de la sonication, vortex doucement les tubes pendant 10 secondes. Avant de remettre les tubes dans le bain d’eau ultrasonique pendant 10 minutes de plus. À la fin de la deuxième sonication, vortex les tubes pendant 10 secondes de plus.
Et désinfecter les tubes avec 70% d’éthanol. Dans le capot de culture cellulaire, filtrer les suspensions cellulaires à travers des passoires individuelles de 40 micromètres dans un nouveau tube stérile de 15 millilitres. Et recueillir les cellules par centrifugation.
Suspendre à nouveau les granulés dans un millilitre de milieu frais par tube. Et voir les cellules dans les vaisseaux de culture cellulaire appropriés à des densités de placage appropriées. Ensuite, placez les cellules dans l’incubateur de culture cellulaire pendant la nuit.
Le lendemain matin, lavez chaque culture trois fois avec du PBS avant d’ajouter du milieu frais et de retourner les cellules à l’incubateur. En utilisant ce protocole, des fibroblastes viables peuvent être obtenus pour une utilisation dans des expériences ultérieures. Comme des expériences de coloration ou de prolifération amino-fluorescentes.
Les fibroblastes adultes sont des cellules plates en forme de fuseau avec de multiples processus cellulaires qui se développent généralement en monomères. Des différences morphologiques distinctes dans les populations de fibroblastes de différents organes peuvent être observées, cependant. Par exemple, les fibroblastes rénaux sont plus petits et se développent à des densités plus élevées que les fibroblastes cardiaques, pulmonaires ou hépatiques.
Les fibroblastes isolés affichent des taux de prolifération élevés, atteignant une confluence optique supérieure à 90% après environ six jours. Ici, un myofibroblaste différencié avec des microfilaments alpha lisses distinctifs d’actine de muscle peut être observé. Ces cellules se trouvent en abondance dans les cultures du cœur, des reins, du foie et des cellules pulmonaires.
Alors que seulement environ 20 à 30 pour cent des cellules isolées et cultivés expriment des microfilaments d’actine musculaire lisses et alpha ordonnés, pratiquement toutes les cellules sont positives pour vimentin et récepteur de domaine discoidin 2 après sept jours dans la culture. La chose la plus importante à retenir est d’utiliser la bonne technique tout au long de la procédure que la contamination bactérienne doit être évitée. Après l’isolement primaire de fibroblaste, les cellules peuvent être employées pour toutes sortes d’expériences et de caractérisation de psychiatrie.
Comme la prolifération de la chimie immunocytique ou des essais de cicatrisation des plaies, ou des évaluations biologiques moléculaires.
