Injection intrathoracique pour l’étude du coeur de zebrafish adulte

Dans la recherche cardiaque sur le poisson zèbre adulte, les traitements médicamenteux sont généralement effectués d’une manière systémique. Avec l’injection intrathoracique, on peut localement fournir la solution au coeur sans causer des dommages myocardiques. Cette méthode permet la livraison de petits volumes de médicaments, protéines ou autres molécules en solution précisément autour du cœur d’un poisson zèbre adulte.

Pour commencer cette procédure, utilisez un tire-aiguille pour tirer des capillaires en verre borosilicate adaptés à la microinjection. Conserver les capillaires tirés dans une boîte de Pétri de neuf centimètres avec des rails d’argile modélisée ou de ruban adhésif. À l’aide de ciseaux communs, couper un morceau d’éponge et sculpter une silhouette de poisson au milieu.

Ensuite, préparez de petits aliquots des solutions d’injection avec les protéines testées ou d’autres composés. Ajustez leur concentration en fonction de l’analyse en diluant la substance dans la solution de sel équilibrée de Hanks 1x complétée par 10% de rouge phénol. Pour obtenir la concentration de travail des anesthésiques, ajoutez deux à trois millilitres de solution de stock de tricaine à un bécher contenant 100 millilitres d’eau de poisson.

Tout d’abord, allumez le microscope stéréo avec la lumière du haut, et ajustez le grossissement à 16x. Faire tremper l’éponge avec de l’eau de poisson et la placer sur une boîte de Pétri de neuf centimètres au microscope. Ajustez la mise au point et, au microscope stéréo, utilisez des ciseaux iridectomy pour couper l’extrémité d’un microcapillaire à environ sept millimètres de la base, tel que décrit dans la figure 1A du protocole textuel.

Insérez le microcapillaire coupé dans le porte-aiguille de l’appareil de microinjecteur. À l’aide des pointes microchargeur, chargez une solution de commande pour configurer la pression de l’injection afin d’obtenir le débit approprié, puis videz l’aiguille. Après cela, chargez le volume sélectionné de la solution d’injection dans la pointe du capillaire, en vous assurant qu’il n’y a pas de bulles d’air.

Utilisez un filet pour attraper un poisson adulte et transférez-le dans la solution anesthésique. Après une à deux minutes, lorsque le poisson cesse de nager et que le mouvement de l’operculum est réduit, touchez le poisson avec une cuillère en plastique pour vous assurer qu’il ne réagit à aucun contact. Ensuite, transférez rapidement et soigneusement le poisson dans la rainure de l’éponge humide, avec le côté ventral vers le haut.

La tête du poisson doit s’éloigner de la main dominante de l’opérateur. Sous le microscope stéréo, observez attentivement le mouvement du cœur battant sous la peau du poisson. Déterminez visuellement le point d’injection au-dessus du cœur battant et au milieu du triangle, défini par les plaques cartilagineuses ventrales.

Insérez la pointe du capillaire à un angle compris entre 30 et 45 degrés par rapport à l’axe du corps. Pénétrer doucement la peau avec la pointe du microcapillaire dans le péricarde. Une fois que l’aiguille est à l’intérieur du péricarde, appuyez sur la pédale du dispositif de microinjecteur pour compléter l’injection.

Après injection, retirez doucement le capillaire du thorax et transférez immédiatement le poisson dans un réservoir avec de l’eau du système pour la récupération. Surveillez le poisson jusqu’à ce qu’il se rétablisse complètement de l’anesthésie. Pour analyser les effets de l’injection, recueillir le cœur au point de temps désiré, et le préparer à une analyse plus approfondie.

Dans cette étude, des composés exogènes et des protéines sont livrés dans la cavité péricardique afin d’étudier leurs effets sur le cœur chez le poisson zèbre adulte. Pour valider cette méthode, deux expériences d’essai sont réalisées en injectant des colorants couleur et fluorescents dans des poissons euthanasiés. Dans les deux analyses, l’analyse de montage entier révèle l’étiquetage de tout le cœur, y compris le ventricule, l’atrium, et le bulbus arteriosus.

Ces résultats révèlent une diffusion efficace des solutions d’injection à la surface du cœur. Pour comparer l’adéquation de l’injection intrathoracique à l’injection intraperitoneal pour les études cardiaques, une quantité similaire de DAPI est injectée en utilisant les deux méthodes. Les cœurs sont ensuite fixés après cinq minutes ou 120 minutes.

Aucune cellule DAPI-positive n’est observée dans les coeurs après injection intraperitoneal à chaque point de temps. En revanche, les injections intrathoraciques entraînent la présence de noyaux étiquetés DAPI dans le myocarde. Ces résultats démontrent que l’injection intrathoracique améliore la livraison du composé au cœur, par rapport à l’injection intraperitoneal.

Pour tester l’adéquation de cette méthode pour les études de régénération cardiaque, les ventricules sont cryoinjurés, puis les injections sont effectuées à trois et sept jours après cryoinjury. Le myocarde et le tissu blessé contiennent de nombreuses cellules DAPI-positives, indiquant une pénétration efficace de ce colorant dans le cœur intact et le tissu fibrotique. En outre, la phalloidine injectée AF649 est également incorporée par des cardiomyocytes de la zone péri-blessure et certains fibroblastes recrutés de la zone blessée.

Cette expérience révèle que les médicaments peuvent traverser l’épicardium et pénétrer dans le myocarde sous-jacent. Après avoir testé l’efficacité des injections intrathoraciques à l’aide de sous-dyes, les effets des protéines injectées sur le cœur sont analysés. Pour cela, les effets de la cytokine exogène sur divers processus sont étudiés.

Les aspects biologiques de la prolifération cardiomyocyte, du dépôt extracellulaire de matrice, du recrutement de cellules immunitaires, et de l’expression cardioprotective de gène sont activés par injection intrathoracique de cytokine. Ces résultats démontrent que l’injection intrathoracique fournit une stratégie appropriée pour la livraison ciblée des protéines pour étudier leurs effets sur les tissus cardiaques distincts dans une variété d’essais. L’insertion de l’aiguille dans le péricarde est une étape clé pour une injection réussie.

La forme de l’aiguille, l’angle de pénétration et les sites de ponction sont autant de facteurs qui influencent l’insertion de l’aiguille. Après ou avant l’injection intrathoracique, on peut effectuer un cryoinjury afin d’analyser l’effet des molécules injectées sur la régénération cardiaque. L’injection intrathoracique a été utilisée chez le poisson zèbre pour étudier le préconditionnement cardiaque.

Une protéine appelée CNTF a été injectée et a été montré pour améliorer les programmes cytoprotecteurs et pro-régénérateurs dans le cœur.