Souhaite RAW à remercier les membres de la Zon et Davidson laboratoires de recherche pour leurs innombrables contributions à aider à développer des stratégies qui ont progressivement façonné cette technique de dissection chez le poisson zèbre adulte au cours des dix dernières années. En outre, nous tenons à exprimer notre gratitude aux membres du personnel du Centre Notre-Dame pour la recherche de poisson zèbre pour fournir d&#39;excellents soins élevage en cours pour notre colonie de poisson zèbre. RAW recueilli des fonds de recherche de l&#39;attribution de subvention NIH-NIDDK DK083512, et le laboratoire généreux fonds de démarrage de l&#39;Université de Notre-Dame.

1. Dissection du rein zèbre adulte à partir d&#39;un échantillon d&#39;animaux non fixés <ol><li> Sélectionnez un zèbre adulte entre 3-6 mois d&#39;âge pour la dissection. </li><li> Euthanasier le poisson en le plaçant dans un plat avec 0,2% 7,0 tricaïne pH d&#39;environ 4-5 minutes, à regarder attentivement pour voir que les branchies arrêter de bouger et le cœur cesse de battre. </li><li> Avec une cuillère, soulevez le poisson du bain tricaïne dans une petite quantité de solution, décanter la solution et placez doucement l&#39;animal sur une serviette en papier. </li><li> Utilisez une paire de ciseaux de dissection d&#39;enlever la tête de l&#39;animal, faire une coupe juste derrière l&#39;opercule des branchies (Figure 1, voie A). Jeter la tête dans un conteneur pour déchets biologiques dangereux. </li><li> Utilisez des ciseaux de dissection d&#39;ouvrir le corps de l&#39;animal, en faisant une longue incision ventrale, à partir de la tête et se terminant à la queue à la base de la nageoire caudale (figure 1, chemin B). </li><li> Enlever les organes internes de l&#39;animal à l&#39;aide d&#39;une pincette de dissection / forceps, et les placer dans des déchets biologiques dangereux. Soyez prudent de ne pas frôler la paroi du corps dorsale, comme cela est l&#39;emplacement du rein (Figure 2). Si vous avez choisi un poisson femelle, vous aurez besoin de ramasser les œufs en développement à sortir de la cavité du corps, qui peut être plus facilement fait en utilisant une paire d&#39;angles de forceps ou de pincettes. </li><li> Utiliser des aiguilles de dissection à la broche ouverte les parois du corps d&#39;un plateau de dissection, et l&#39;angle des broches pour que les reins peuvent être visualisées. Le rein doit posséder une forme caractéristique (tête, tronc / selle, la queue) et la couleur, la pigmentation étant entrecoupées de teintes noires (figure 2). Vous pouvez également voir l&#39;aorte rempli de sang périphérique, qui descend de la ligne médiane de la structure d&#39;organes. </li><li> Utilisez une pince fine pour détacher le rein de la paroi dorsale du corps, en utilisant une paire de pince pour soulever le rein que vous vous séparez de l&#39;orgue à partir des tissus conjonctifs qui sous-tendent. </li><li> Placez délicatement le rein dans le véhicule désiré pour des études de cellules vivantes, comme un microtube contenant du PBS 1x pour la préparation de FACS. </li></ol> 2. Préparation et la dissection du rein zèbre adulte auprès d&#39;un échantillon d&#39;animaux fixes <ol><li> Préparer une solution de PBST paraformaldehyde/1X 4%. Faire bouillir la solution pour dissoudre la PFA dans la solution, puis refroidir le mélange à 4 ° C et ajouter 0,1% de diméthylsulfoxyde. Nous avons eu le plus de succès avec la préservation des tissus d&#39;utiliser des solutions fraîchement préparées PFA, par opposition à aliquotes congelées. Faire suffisamment de solution pour immerger le poisson zèbre adulte lors de la dissection. </li><li> Remplissez un bac de dissection avec une solution de fixation assez pour immerger le poisson zèbre adulte lors de la dissection. Nous effectuons les étapes suivantes avec ce bac placé sous le microscope, qui peuvent être placés dans une hotte chimique pour réduire l&#39;exposition aux odeurs de fixation. </li><li> Sélectionnez un zèbre adulte entre 3-6 mois d&#39;âge pour la dissection. </li><li> Euthanasier le poisson en le plaçant dans un plat avec 0,2% 7,0 tricaïne pH pendant environ 5 minutes, à regarder attentivement pour voir que les branchies et les coups d&#39;arrêt cardiaque. </li><li> Avec une cuillère, soulevez le poisson du bain tricaïne dans une petite quantité de solution, décanter la solution et placez doucement l&#39;animal sur une serviette en papier. </li><li> Utilisez une paire de ciseaux de dissection d&#39;enlever la tête de l&#39;animal, faire une coupe juste derrière l&#39;opercule des branchies (Figure 1, voie A). Jeter la tête dans un conteneur pour déchets biologiques dangereux, et placer immédiatement l&#39;animal dans le bac de dissection PFA contenant. </li><li> Utilisez des ciseaux de dissection d&#39;ouvrir le corps de l&#39;animal, en faisant une longue incision ventrale, à partir de la tête et se terminant à la queue à la base de la nageoire caudale (figure 1, chemin B), et garder le corps partiellement immergé pendant la procédure. </li><li> Enlever les organes internes de l&#39;animal à l&#39;aide d&#39;une pincette de dissection / forceps, et les placer dans des déchets biologiques dangereux. Soyez prudent de ne pas frôler la paroi du corps dorsale, comme cela est l&#39;emplacement du rein (Figure 2). </li><li> Utiliser des aiguilles de dissection à la broche ouverte les parois du corps, et l&#39;angle des broches pour que les reins peuvent être visualisées. Le rein doit posséder une forme caractéristique (tête, la selle, la queue) et la couleur, la pigmentation étant entrecoupées de teintes noires (figure 2). Vous pouvez également voir l&#39;aorte rempli de sang périphérique, qui descend de la ligne médiane de la structure d&#39;organes. </li><li> Fixer l&#39;échantillon pendant la nuit, plaçant la barre à 4 ° C lorsque vous avez terminé avec l&#39;organisation les échantillons souhaités. </li><li> Le lendemain, retirez la solution IFP dans le bac et remplacez avec 1x PBST. </li><li> Utilisez une pince fine pour détacher soigneusement les reins de la paroi dorsale du corps, en utilisant une paire de pince pour soulever le rein que vous vous séparez de l&#39;orgue à partir des tissus conjonctifs qui sous-tendent. Le tissu rénal sera molle et souple de la DMSO dans la solution de fixation, ce qui permet de disséquer les organes rénaux entière en un seul morceau. </li><li> Utiliser une échellepipette de transfert alésage de placer le rein dans un tube à centrifuger. </li><li> Le rein peut maintenant être traitées ultérieurement de procéder à monter histologique ou toute in situ des études d&#39;expression génique basée sur l&#39;étude souhaitée. </li></ol> 3. Les résultats représentatifs: Les étapes qui sont schématisés à la figure 1 indique la procédure de dissection. Le rein peut être identifié grâce à sa forme caractéristique et la coloration, et la localisation anatomique de la paroi dorsale de la cavité du corps de l&#39;animal, comme le montre la figure 2. Après dissection d&#39;un échantillon de rein fixés, monter toute l&#39;hybridation in situ peut être utilisé pour localiser l&#39;expression d&#39;un gène d&#39;intérêt, comme le montre la figure 3. <img src="/files/ftp_upload/2839/2839fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1: Procédure qui permet un accès direct pour disséquer le rein adulte poisson zèbre. (A) est disséqué le poisson-zèbre euthanasiés de manière progressive (indiqué par des chiffres et des flèches) pour donner le chercheur le plus simple d&#39;accès à l&#39;organe de rein complet. Images de la cavité abdominale avant (B) et après (C) la suppression des organes abdominaux. <img src="/files/ftp_upload/2839/2839fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2:. Visualisation du rein poisson zèbre dans un échantillon non fixé Après le retrait d&#39;organes dans la cavité du corps, le rein apparaît comme un seul organe aplati qui est adhérente à la paroi dorsale du corps par l&#39;intermédiaire des tissus conjonctifs (A), et a été schématisé (B) pour montrer sa forme anatomique. <img src="/files/ftp_upload/2839/2839fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Figure 3: mount entier hybridations in situ réalisées sur l&#39;organe rein adulte entier. (A) sont détectés cadherin17 transcriptions dans le tubule de néphrons rein adulte, agrandie en (A &#39;) (B). Transcriptions mafba sont localisés proximale types de cellules du néphron dans le rein adulte (comparer à tubule ensemble dans le panneau A). (B&#39; ) Une vue agrandie de l&#39;expression mafba révèle que les transcriptions sont spécifiquement localisées à l&#39;podocyte (P), les cellules du sang (glomérule) filtre et tubule contourné proximal (PCT).

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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Les cellules souches adultes sont des éléments dynamiques et essentielles qui maintiennent la forme du corps adulte 1. Les cellules souches adultes peuvent aussi servir à contrer les dommages qu&#39;il engage corps pendant les états pathologiques, et le dysfonctionnement ou la perte de cellules souches adultes peuvent conduire à la diminution du fonctionnement des organes et a été impliqué à conduire des tumeurs malignes du cancer et de contribuer au vieillissement. Les cellules souches adultes présentent des propriétés cellulaires qui les distinguent des types de cellules différenciées. Après la division cellulaire, les cellules souches adultes sont capables d&#39;auto-renouvellement et la production de cellules progénitrices qui peuvent à leur tour donner naissance à leur progéniture différenciées distinctes. Il ya un grand intérêt dans la compréhension des voies qui régulent les décisions du destin cellulaire et la puissance des cellules souches adultes en raison de leur rôle important dans une homéostasie tissulaire. Par exemple, de nombreux scientifiques cherchent actuellement à identifier les signaux qui maintiennent les différentes populations de cellules souches adultes dans leur niche, ou microenvironnement spécialisé, et comment cette niche est impacté par des facteurs humoraux. Adulte cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont des cellules pluripotentes qui alimentent le rajeunissement continu de cellules sanguines chez les animaux 8. L&#39;hématopoïèse est un processus dynamique qui est constamment en cours durant la vie d&#39;un organisme des vertébrés parce que la maturité différenciées types de cellules sanguines sont de courte durée et doit donc être réapprovisionné régulièrement. Comme elles se divisent, CSH répondre à cette demande cruciale par auto-renouvellement et la production d&#39;une série de progéniteurs qui donnent lieu à des cellules érythroïdes, lignées mégacaryocytaire, lymphoïdes et myéloïdes. Chacun de ces types de cellules sanguines exerce des fonctions uniques de la circulation, notamment en fournissant des échanges gazeux aux tissus, une manière pour l&#39;étanchéité des blessures aux vaisseaux sanguins par des moyens de formation de caillot, ou des mécanismes de défense contre les pathogènes envahisseurs. Alors que les CSH ont été reconnus depuis de nombreuses années, une pléthore de questions restent sans réponse au sujet fascinant ces cellules incroyable. Des études récentes ont identifié des sous-classes de CSH avec différents à long terme des propriétés d&#39;auto-renouvellement, et l&#39;élucidation des composants de niche et les signaux qui modulent le comportement HSC 8. Le poisson zèbre est maintenant parmi les pierres angulaires des paradigmes de recherche de l&#39;hématopoïèse, sur la base des attributs génétiques et moléculaires de ce modèle 8 animaux. Recherche utilisant le poisson zèbre a conduit à des informations nouvelles sur la biologie HSC qui sont conservées avec les vertébrés supérieurs comme les mammifères, en soulignant la pertinence des enquêtes biomédicales sang de poisson 8. Historiquement, les connaissances sur les CSH a ouvert la voie à des expéditions qui cherchent à découvrir si d&#39;autres organes du corps sont entretenus par les cellules souches adultes. De nombreuses populations de cellules souches adultes sont désormais appréciées à exister, allant à travers diverses structures du cerveau à l&#39;intestin, la peau et le muscle squelettique. La poursuite des efforts dans le domaine des cellules souches cherchent à déterminer comment les cellules souches adultes et même d&#39;autres types de cellules différenciées peut afficher la puissance améliorée dans divers milieux. En ce qui concerne le rein, il ya eu un grand débat parmi les néphrologues de savoir si les cellules souches rénales existent 16. Conclusions indépendantes ont documenté les populations de cellules rénales chez les mammifères qui possèdent des degrés variables de potentiel régénératif, mais une compréhension cohérente de ces rapports n&#39;a pas encore été atteint. Fait intéressant, il existe des preuves solides pour soutenir l&#39;idée que les nombreuses espèces de poissons possèdent des cellules de carburant qui peut robuste régénération des néphrons endommagés, ainsi que développer néphrons entièrement nouvelle à l&#39;âge adulte 9. Des travaux récents ont identifié les caractéristiques moléculaires des cellules souches adultes du rein dans le poisson zèbre 10,11, et démontré la puissance d&#39;auto-renouvellement de ces soi-disant rénale cellules souches / progénitrices (RPC) 11. De futures études sont nécessaires pour déterminer si des cellules de rein analogues sont présents chez les mammifères. Néanmoins, des investigations ont continué sur les mécanismes cellulaires et moléculaires qui régulent les RPC poissons peuvent fournir un aperçu de la manière dont exploits régénérative peut être stimulée dans les reins de mammifères. Il est évident qu&#39;il reste beaucoup à apprendre sur les RPC, et que les nombreux outils disponibles pour le chercheur de poisson zèbre peut être mis en œuvre pour s&#39;attaquer à ces questions intrigantes. Dans ce protocole, nous décrivons notre méthode pour l&#39;identification et la dissection anatomique du rein poisson zèbre adulte. Étapes alternatives peuvent être utilisées pour disséquer les reins, comme l&#39;ouverture de la cavité abdominale par une incision ventrale avec des ciseaux de dissection, cependant, nous avons rencontré le plus de succès dans l&#39;accès du rein entier lorsque la paroi abdominale est épinglé ouverte et la tête est enlevée. Chercheurs de sang et les reins, qui souhaitent isoler et travailler avec ces types de cellules peuvent utiliser la méthode de dissection soit. Il faut noter que la méthode que nous décrivons pour isoler et working avec le rein adulte poisson zèbre n&#39;est certainement pas limité à des scientifiques qui souhaitent poursuivre des questions de biologie des cellules souches adultes, comme la dissection de cet organe peut faciliter les études pour ceux des chercheurs qui poursuivent des enquêtes sur des sujets allant de la physiologie du vieillissement. En outre, cette méthode peut être couplée avec d&#39;autres technologies telles que les transgéniques, afin de moléculairement étiquette, puis de purifier et d&#39;étude des sous-populations distinctes de globules ou de rein de type sauvage ou génétiquement mutant de poisson zèbre 11. Pour l&#39;avenir, de telles procédures de purification détaillée des types de cellules souches et progénitrices est vitale pour acquérir la connaissance sur la façon dont leur comportement est réglementée, comme les tests opérationnels tels que la transplantation ou la culture de progéniteurs constituent la base par laquelle la puissance et l&#39;identité de ces cellules est définie. Les progrès récents dans hématopoïétiques progénitrices des méthodes de culture ouvrent de nombreuses voies nouvelles pour l&#39;étude, et peuvent être adaptés à la culture des populations rénale 17. Zebrafish la génétique chimique ont été couronnés de succès dans l&#39;identification des voies qui modulent les CSH et les progéniteurs rénale dans divers contextes 18-20, et continuera d&#39;être un moyen utile de tester en combinaison avec les techniques de biologie cellulaire ci-dessus. Pris ensemble, il ya eu un certain nombre de contributions novatrices aux domaines de l&#39;hématologie et néphrologie en utilisant le modèle de poisson zèbre, et a continué la recherche dans ces arènes promet de manier encore aperçus de transformation dans les années à venir.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th></tr><tr><td> Ciseaux de dissection </td><td> Roboz </td><td> RS-5882 </td></tr><tr><td> Pinces à dissection </td><td> Roboz </td><td> RS-5010 </td></tr><tr><td> Pinces à dissection angle </td><td> Roboz </td><td> RS-5058 </td></tr><tr><td> Tricaïne </td><td> Sigma </td><td> E10521 </td></tr><tr><td> Paraformaldéhyde </td><td> Services de microscopie électronique </td><td> 19210 </td></tr></tbody></table>

dissection of the adult zebrafish kidney

Les chercheurs travaillant dans le domaine en plein essor de la biologie des cellules souches adultes cherchent à comprendre les signaux qui régulent le comportement et la fonction des cellules souches au cours homéostasie normale et d&#39;états pathologiques. La compréhension des cellules souches adultes a de larges implications pour atteindre à l&#39;avenir de la médecine régénérative 1. Par exemple, une meilleure connaissance de la biologie des cellules souches adultes peuvent faciliter la conception de stratégies thérapeutiques dans lesquelles les organes sont déclenchées pour guérir eux-mêmes ou même la création de méthodes d&#39;organes de plus en plus in vitro qui peuvent être transplantés dans le corps humain 1. Le poisson zèbre est devenu un modèle animal puissant pour l&#39;étude de la biologie cellulaire des vertébrés 2. Il a été abondante documentation et d&#39;analyse du développement embryonnaire chez le poisson zèbre 3. Ce n&#39;est que récemment que les scientifiques ont cherché à documenter l&#39;anatomie adulte et techniques de dissection chirurgicale 4, comme il ya eu un mouvement progressiste au sein de la communauté zebrafish d&#39;élargir les applications de cet organisme de recherche à des études pour adultes. Par exemple, il ya des intérêts en expansion utilisant le poisson zèbre pour étudier la biologie des populations de cellules souches adultes et de faire des modèles pour adultes sophistiqué de maladies comme le cancer 5. Historiquement, l&#39;isolement du rein adulte poisson zèbre a été déterminant pour l&#39;étude de l&#39;hématopoïèse, comme le rein est la localisation anatomique de la production de cellules sanguines chez les poissons 6,7. Le rein est composé d&#39;unités fonctionnelles néphron trouvés dans les arrangements arborisée, entourés par du tissu hématopoïétique qui est dispersée à travers les espaces intermédiaires. La composante hématopoïétiques se compose de cellules souches hématopoïétiques (CSH) et de leurs descendants qui habitent les reins en phase terminale jusqu&#39;à ce qu&#39;ils différencient 8. En outre, il est maintenant reconnu que d&#39;un groupe d&#39;rénale cellules souches / progénitrices (RPC) habitent également les organes rénaux poisson-zèbre et permettre une régénération du rein et de la croissance, comme observé dans les autres espèces de poissons 9-11. À la lumière de cette nouvelle découverte, le rein poisson zèbre est un organe qui abrite l&#39;emplacement de deux opportunités passionnantes pour les études de biologie cellulaire souches adultes. Il est clair que de nombreuses questions en suspens pourraient être bien servis avec ce système expérimental. Pour encourager l&#39;expansion de ce domaine, il est bénéfique pour documenter des méthodes détaillées de visualiser et ensuite isoler l&#39;organe de poisson zèbre pour adultes du rein. Ce protocole de détails de notre procédure de dissection du rein adulte à partir d&#39;animaux non fixés à la fois et fixes. La dissection de l&#39;organe du rein peut être utilisé pour isoler et caractériser les cellules souches hématopoïétiques et rénales et de leurs descendants en utilisant des techniques établies, telles que l&#39;histologie, tri cellulaire par fluorescence (FACS) 11,12, 13,14 profilage de l&#39;expression, et la transplantation 11,15. Nous espérons que la diffusion de ce protocole permettra aux chercheurs des connaissances nécessaires pour mettre en œuvre plus large recours à des études qui ont finalement poisson zèbre peut être traduit par l&#39;application humaine.

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Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Le rein zebrafish abrite à la fois rénale et hématopoïétique adulte cellules souches / progénitrices, et représente une occasion exceptionnelle d&#39;étudier ces types de cellules et de leur progéniture dans un organisme modèle vertébré. Ici, nous démontrons une procédure de dissection détaillé qui permet au chercheur d&#39;identifier et d&#39;enlever chirurgicalement le rein poisson zèbre adulte, qui peut être utilisé pour des applications telles que l&#39;isolement cellulaire, la transplantation, et les études d&#39;expression du rein et / ou des populations de cellules sanguines.

Dissection du rein Zebrafish adultes

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

Research

JoVE Journal

Biology

36.5K vues.  University of Notre Dame. Le rein zebrafish abrite à la fois rénale et hématopoïétique adulte cellules souches / progénitrices, et représente une occasion exceptionnelle d'étudier ces types de cellules et de leur progéniture dans un organisme modèle vertébré. Ici, nous démontrons une procédure de dissection détaillé qui permet au chercheur d'identifier et d'enlever chirurgicalement le rein poisson zèbre adulte, qui peut être utilisé pour des applications telles que l...

Vidéo: Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

La transplantation de moelle rein entier chez le poisson zèbre pour adultes

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

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Biologie

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular features of the epithelia, which are mainly composed of two types of cells: hair cells (HCs) and supporting cells (SCs). Here we choose to study the inner ear sensory epithelia in adult zebrafish not only because the epithelial structures are highly conserved in all vertebrates studied, but also because the adult zebrafish is able to regenerate HCs, an ability that mammals lose shortly after birth. We use the inner ear of adult zebrafish as a model system to study the mechanisms of inner ear HC regeneration in adult vertebrates that could be helpful for clinical therapy of hearing/balance deficits in human as a result of HC loss.
Here we demonstrate how to do gross and fine dissections of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish. The gross dissection removes the tissues surrounding the inner ear and is helpful for preparing tissue sections, which allows us to examine the detailed structure of the sensory epithelia. The fine dissection cleans up the non-sensory-epithelial tissues of each individual epithelium and enables us to examine the heterogeneity of the whole epithelium easily in whole-mount epithelial samples.

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

The inner ear sensory epithelium of adult zebrafish is a good model system for understanding the mechanisms of hair cell regeneration in adult vertebrates. This protocol demonstrates the fine dissection of the epithelia, through which we can get tissue samples for studying the regenerative events at cellular and subcellular levels.

Dissection fine et globale de l&#39;épithélium sensoriel de l&#39;oreille interne adultes poisson zèbre ( Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

Dissection d&#39;organes sur le poisson zèbre pour adultes

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, this method makes it difficult to know how much reagent is absorbed or taken up per fish. Some experimental questions, particularly those related to metabolic studies, may be better addressed by delivering a defined quantity to each fish, based on weight. Here we present a method for intraperitoneal (IP) injection into adult zebrafish. Injection is into the abdominal cavity, posterior to the pelvic girdle. This procedure is adapted from veterinary methods used for larger fish. It is safe, as we have observed zero mortality. Additionally, we have seen bleeding at the injection site in only 5 out of 127 injections, and in each of those cases the bleeding was brief, lasting several seconds, and the quantity of blood lost was small. Success with this procedure requires gentle handling of the fish through several steps including fasting, weighing, anesthetizing, injection, and recovery. Precautions are required to minimize stress throughout the procedure. Our precautions include using a small injection volume and a 35G needle. We use Cortland salt solution as the vehicle, which is osmotically balanced for freshwater fish. Aeration of the gills is maintained during the injection procedure by first bringing the fish into a surgical plane of anesthesia, which allows slow operculum movements, and second, by holding the fish in a trough within a water-saturated sponge during the injection itself. We demonstrate the utility of IP injection by injecting glucose and monitoring the rise in blood glucose level and its subsequent return to normal. As stress is known to increase blood glucose in teleost fish, we compare blood glucose levels in vehicle-injected and non-injected adults and show that the procedure does not cause a significant rise in blood glucose.

We demonstrate intraperitoneal injection into adult zebrafish. We use a 10 &mu;l NanoFil microsyringe controlled by a Micro4 controller and UltraMicroPump III. This demonstration includes the use of cold water as an anesthetic.

Injection intrapéritonéale en Zebrafish adultes

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

La transplantation de cellules directement dans le rein de poisson zèbre adulte

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work examining post-embryonic through adult cardiac development has been limited7-10. Examining the changing morphology of the maturing and aging heart are restricted by the lack of techniques available for staging and isolating juvenile and adult hearts. In order to analyze heart development over the fish's lifespan, we dissect zebrafish hearts at numerous stages and photograph them for further analysis11. The morphological features of the heart can easily be quantified and individual hearts can be further analyzed by a host of standard methods. Zebrafish grow at variable rates and maturation correlates better with fish size than age, thus, post-fixation, we photograph and measure fish length as a gauge of fish maturation. This protocol explains two distinct, size dependent dissection techniques for zebrafish, ranging from larvae 3.5mm standard length (SL) with hearts of 100&mu;m ventricle length (VL), to adults, with SL of 30mm and VL 1mm or larger. Larval and adult fish have quite distinct body and organ morphology. Larvae are not only significantly smaller, they have less pigment and each organ is visually very difficult to identify. For this reason, we use distinct dissection techniques.
We used pre-dissection fixation procedures, as we discovered that hearts dissected directly after euthanization have a more variable morphology, with very loose and balloon like atria compared with hearts removed following fixation. The fish fixed prior to dissection, retain in vivo morphology and chamber position (data not shown). In addition, for demonstration purposes, we take advantage of the heart (myocardial) specific GFP transgenic Tg(myl7:GFP)twu34 (12), which allows us to visualize the entire heart and is particularly useful at early stages in development when the cardiac morphology is less distinct from surrounding tissues. Dissection of the heart makes further analysis of the cell and molecular biology underlying heart development and maturation using in situ hybridization, immunohistochemistry, RNA extraction or other analytical methods easier in post-embryonic zebrafish. This protocol will provide a valuable technique for the study of cardiac development maturation and aging.

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

A clear, standardized method for dissection and isolation of the zebrafish heart at multiple developmental stages are described. Annotation and quantification techniques are also discussed.

Dissection du cœur chez les larves, le poisson zèbre juvéniles et adultes, Danio rerio</em

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

En électroporation in vivo de morpholinos dans la rétine de poisson zèbre adulte

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

En électroporation in vivo de morpholinos dans la régénération des adultes Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Gavage poisson zèbre pour adultes

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

Analyse de néphron Composition et fonction du rein poisson zèbre adulte

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...