Cette étude a été soutenue par la Juvenile Diabetes Research Foundation accorde 5-2007-97 (au VEP), par l&#39;Institut national du diabète et des maladies digestives et rénales subventions R01DK064973 (au VEP), R01DK48494 (pour LHP), T32DK07074 (soutien SCE), K01DK083552 (pour MDK), et par P60DK20595 à l&#39;Université de Chicago recherche sur le diabète et le Centre de Formation. Le contenu est uniquement la responsabilité de leurs auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles de l&#39;NIDDK ou le NIH.

1. Les préparatifs pré-injection <ol><li> Rapide le poisson pendant au moins 24 heures avant l&#39;injection. Cela vide le bulbe intestinale (estomac) contenu. Le protocole de jeûne de base est de transférer les poissons, à leur densité normale, à un réservoir propre, puis retenir la nourriture. Pour plus long terme le jeûne qui exige des conditions plus rigoureuses (par exemple, pour les études de glucose dans le sang), voir d&#39;autres considérations dans la discussion. </li><li> Préparer une solution saline Cortland (Perry et al., 1984). Pour un volume de 100 ml, dissoudre dans l&#39;eau distillée: 725 mg de NaCl (124,1 mM) 38 mg de KCl (5,1 mM) 41 mg de Na 2 HPO 4 (2,9 mM) 24 mg MgSO 4 ∙ 7H 2 O (1,9 mM) 16 mg de CaCl 2 ∙ 2H 2 O (1,4 mm) 100 mg de NaHCO 3 (11,9 mm) 4 g de polyvinylpyrrolidone (PVP) (4%) 1000 unités d&#39;héparine USP Filtre, stériliser et stocker à 4 ° C. </li><li> Préparer le microscope. <ul><li> Couvrez la base de microscope avec une pellicule de plastique pour la protection en cas de déversements. </li><li> Mettez une serviette en papier sur le dessus de la pellicule de plastique. La table d&#39;opération sera assis sur le haut de la serviette en papier. </li><li> Pré-ajuster le focus en regardant la table d&#39;opération et en se concentrant sur l&#39;éponge. </li></ul> Astuce: Placez votre doigt sur le dessus de l&#39;éponge et se concentrer sur cela. Ce sera d&#39;éliminer ou de réduire encore l&#39;ajustement focale une fois le poisson est sur la table d&#39;opération. </li><li> Peser le poisson. <ul><li> Remplir un bécher de 500 ml environ 1 / 3 avec de l&#39;eau installation poissons. </li><li> Tarer la balance. </li><li> Recueillir les poissons à l&#39;aide d&#39;un filet. Mèche excès d&#39;eau loin de la net et du poisson par une brève tamponnant sur le net sur des serviettes en papier. Transférer les poissons dans le bécher. </li><li> Peser le poisson. </li><li> Transférer les poissons dans un réservoir propre. </li><li> Transfert chaque poisson pesé à son réservoir étiquetés propres. </li><li> Calculer le volume d&#39;injection pour chaque poisson en fonction du poids des poissons. </li></ul></li><li> Préparer la seringue et du matériel liés à l&#39;injection. Pour l&#39;injection, nous recommandons une aiguille 35G acier biseauté et une microseringue de 10 Nanofil ul. Préparer la seringue Nanofil et tubes Silflex suivant les instructions du fabricant. Il est important d&#39;enlever toutes les bulles de la seringue et la tubulure. Après avoir rempli la seringue et le tube, monter la seringue sur la pompe, et le programme du volume d&#39;injection pour le premier poisson. </li><li> Préparer la table d&#39;opération. <ul><li> Couper une éponge douce (tels que # L800-D, Jaece Industries) afin qu&#39;il se trouve à environ 20 mm de hauteur. Sur le visage plat, faire une coupe qui est de 10-15 mm de profondeur. Cette coupe est le creux qui va tenir le poisson pour l&#39;injection. </li><li> Réglez l&#39;éponge dans un plat de Pétri de 60 mm. </li><li> Réglez la boîte de Pétri avec éponge dans un couvercle de dimensions adéquates et une pipette boîte de pointe. Le couvercle doit être assez grand pour contenir l&#39;eau pour aider à maintenir la température de l&#39;éponge, mais il devrait être assez peu profond pour ne pas obtenir de la manière. Nous utilisons un couvercle d&#39;une boîte P200 pointe est de 11,4 cm L x 7,7 cm L x 1,5 cm D. </li></ul> Ces trois éléments assemblés (éponge dans boîte de Pétri au couvercle de la boîte) constituent la table d&#39;opération. </li><li> Préparer l&#39;anesthésie. <ul><li> Faire de la glace pilée à l&#39;aide des cubes à partir de l&#39;eau installation poissons. </li></ul> Astuce: Utilisation typique de bacs à glaçons, il faudra 3 plateaux pour anesthésier les poissons de 10 à 12. <ul><li> Remplissez un seau à glace nettoyer avec de la glace concassée. </li><li> Mettez la table d&#39;opération dans un grand récipient, tel qu&#39;un conteneur de 2,4 litres de Rubbermaid entreposage des aliments. </li><li> Versez de l&#39;eau des installations (à chaud) dans le conteneur extérieur et la table d&#39;opération. Gardez une réserve d&#39;eau chaude installation à proximité. </li><li> Mettez un thermomètre dans le conteneur extérieur. </li></ul></li></ol> 2. Anesthésie par injection et récupération <ol><li> Placez le récipient anesthésie extérieur et table chirurgicale adjacent au microscope. Avez-seau de copeaux de glace à proximité. </li><li> Amener la température de l&#39;eau à 17 ° C en ajoutant des glaçons. Important: Ne pas descendre en dessous de 17 ° C pendant cette étape. </li><li> Utilisez un filet de transférer le poisson sur le conteneur externe. </li><li> Ajouter lentement morceaux de glace pour le conteneur pour abaisser la température à 12 ° C, au cours de plusieurs minutes. </li><li> Surveiller le comportement des poissons: à 17 ° C ou légèrement plus bas, le poisson se propage généralement ses nageoires pectorales horizontalement, gasp, et avoir des mouvements opercule rapide. Comme la température baisse, les poissons nagent plus lentement et finalement arrêter la natation. Comme le plan chirurgical de l&#39;anesthésie est approché, haletant s&#39;arrête et mouvements opercule sera lente. Le poisson est prêt pour l&#39;injection quand elle ne réagit pas à être manipulés. Pour la plupart des poissons, 12 ° C est suffisante. Les gros poissons peuvent exiger plus froides water. </li><li> Comme la température souhaitée est atteinte (~ 12 ° C ou moins), appuyez sur l&#39;éponge pour le saturer. </li><li> Gardez vos doigts dans l&#39;eau froide suffisamment pour qu&#39;ils ne seront pas réchauffer le poisson et le faire sortir de l&#39;anesthésie pendant la manipulation. </li><li> Avec les doigts froids, doucement transférer les poissons à l&#39;auge de l&#39;éponge. Placez le poisson avec l&#39;abdomen et les branchies dans l&#39;auge. </li><li> Transférez rapidement la table de chirurgie de la platine du microscope. </li><li> En travaillant rapidement, soigneusement insérer l&#39;aiguille dans la ligne médiane entre les nageoires pelviennes. L&#39;aiguille doit pointer crânialement et être insérés près de la ceinture pelvienne que de l&#39;anus. Vous devriez être capable de sentir lorsque l&#39;aiguille est profond à la paroi du corps. Injecter le volume approprié et retirer l&#39;aiguille. </li><li> Après l&#39;injection, transférer immédiatement le poisson de son eau chaude (~ 28,5 ° C) du réservoir pour la récupération en libérant le poisson de l&#39;éponge sur l&#39;eau du réservoir. Astuce: Si le poisson ne commence pas nager immédiatement, l&#39;aider à récupérer l&#39;eau en remuant doucement vers les branchies. </li><li> Vérifiez l&#39;aiguille. Parfois une échelle peut être attaché et doit être enlevé avant la prochaine injection. </li><li> Pour les injections suivantes, l&#39;utilisation d&#39;eau chaude installation pour amener la température de l&#39;eau anesthésie chambre arrière jusqu&#39;à 17 ° C avant d&#39;introduire le prochain poisson. </li></ol> 3. Les résultats représentatifs: <img src="/files/ftp_upload/2126/2126fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Les résultats représentatifs après injection intrapéritonéale de 0,5 mg / g de glucose ou d&#39;un véhicule. Les poissons ont été à jeun pendant 72 heures avant l&#39;injection. L&#39;axe des abscisses montre le temps, après l&#39;injection. Moyenne ± SEM.

<ol>
	<li>Perry, S. F., Davie, P. S., Daxboeck, C., Ellis, A. G., Smith, D. G., Hoar, W. S., Randall, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion+methods+for+the+study+of+gill+physiology.">Perfusion methods for the study of gill physiology.</a> Fish Physiology Volume X: Gills, Part B: Ion and Water. , 325-388 (1984).</li><li>Brown, L. A., Stoskopf, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthesia+and+restraint.">Anesthesia and restraint.</a> Fish Medicine. , 79-90 (1993).</li><li>Eames, S. C., Philipson, L., Prince, V. E., Kinkel, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+sugar+measurement+in+zebrafish+reveals+dynamics+of+glucose+homeostastis.">Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostastis.</a> Zebrafish. 7, 205-213 (2010).</li><li>Chavin, W., Young, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+in+the+determination+of+normal+serum+glucose+levels+of+goldfish+Carassius+auratus+L.">Factors in the determination of normal serum glucose levels of goldfish Carassius auratus L.</a> Comp Biochem Physiol. 33, 629-653 (1970).</li><li>Groff, J. M., Zinkl, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematology+and+clinical+chemistry+of+cyprinid+fish.+Common+carp+and+goldfish.">Hematology and clinical chemistry of cyprinid fish. Common carp and goldfish.</a> Vet Clin North Am Exot Anim Pract. 2, 741-776 (1999).</li><li>Brand, M., Granato, M., Nusslein-Volhard, C., Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+and+raising+zebrafish.">Keeping and raising zebrafish.</a> Zebrafish: A Practical Approach. , 7-37 (2002).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. , (1995).</li><li>Iwama, G. K., Ackerman, P. A., Hochachka, P. W., Mommsen, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaesthetics.">Anaesthetics.</a> Biochemistry and Molecular Biology of Fishes, Volume 3: Analytical Techniques. , 1-15 (1994).</li><li>Reavill, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+diagnostic+and+clinical+techniques+for+fish.">Common diagnostic and clinical techniques for fish.</a> Vet Clin North Am Exot Anim Pract. 9, 223-235 (2006).</li><li>Stoskopf, M. K., Stoskopf, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgery.">Surgery.</a> Fish Medicine. , 91-97 (1993).</li></ol>

L&#39;injection intrapéritonéale comporte cinq étapes: le jeûne, la pesée, anesthésier, l&#39;injection et la récupération. Pour chaque étape il ya les meilleures pratiques qui peuvent assurer le succès. Le succès comprend un patient poissons en bonne santé ainsi que d&#39;un bon résultat expérimental. Le jeûne: un jeûne de 24 heures devrait vider l&#39;ampoule intestinale. Cette pratique est tiré de la littérature poissons vétérinaires (par exemple, Brown, 1993). D&#39;autres considérations de jeûne sont discutés ci-dessous. À plus long terme à jeun: Nous avons constaté qu&#39;un jeûne de 72 heures est nécessaire pour diminuer la glycémie à un niveau de base avant l&#39;injection (Eames et al, 2010).. Nous avons également constaté que pour des études de glucose il ya plusieurs procédures qui sont nécessaires pour s&#39;assurer que les poissons sont mis à jeun correctement. Commencez avec un réservoir propre (pas de débris sur le fond). Les réservoirs doivent être déconnecté, clairement étiqueté comme «jeûne», et dans un endroit où enthousiastes personnel des soins de poisson ne sera pas les nourrir. Évaluer l&#39;environnement externe de la cuve et prendre des mesures pour empêcher les poissons d&#39;être stressés par des perturbations, comme le stress est connu pour augmenter la glycémie (Chavin et Young, 1970;. Groff et al, 1999). Par exemple, nous avons eu une expérience dans laquelle le jeûne d&#39;une radio a été opéré quotidiennement sur le banc qui tenait les réservoirs de poissons. Nous avons constaté que la glycémie était anormalement élevé et a conclu que les poissons ont été soulignés par les vibrations. Un autre facteur de stress est la surpopulation. Les poissons devraient être maintenus à une densité conforme aux bonnes pratiques d&#39;élevage des poissons. Pour les recommandations, voir Brand et al. (2002) et Westerfield (1995). Nous avons eu de bons résultats à jeun nos poissons à une densité de 10-12 poissons dans un réservoir de 9 litres (avec 3 couches de billes de prendre une partie de ce volume). La séparation des sexes peut causer du stress, nous recommandons de maintenir une population mixte de sexe pendant le jeûne. Cela signifie que les œufs peuvent être établies, et les œufs ont besoin d&#39;être séquestré, afin qu&#39;ils ne se mange pas. Un moyen simple pour séquestrer les oeufs est de couvrir le fond du réservoir avec 2-3 couches de billes. Qualité de l&#39;eau doit être maintenu en retirant les oeufs et les déchets et en remplaçant environ 10-15% de l&#39;eau du réservoir, tous les jours. Pour enlever les œufs et les déchets, le siphonnage fonctionne bien. Pesée: Lors du pesage des poissons qui ne sont pas anesthésiés, les soins devraient être prises pour minimiser le transfert de l&#39;eau du filet dans le bécher, afin d&#39;assurer un pesage précis. Si le net (avec du poisson) est effacé sur du papier absorbant, la majorité de l&#39;eau en excès peut être enlevé et le poids peut être mesurée avec précision. Il peut être plus facile d&#39;anesthésier le poisson avant la pesée, mais nous n&#39;avons pas testé les effets possibles d&#39;anesthésier un poisson deux fois par jour. Nous avons testé notre technique en pesant le premier poisson avec le filet / buvard méthode et puis re-pesée du poisson après qu&#39;il a été anesthésié, et doucement effacé sec. Nous n&#39;avons trouvé aucune différence significative de poids entre les méthodes (P = 0,7927, test t). De plus, nous avons testé si ce filet / buvard glycémie méthode affectée, en comparaison avec tout simplement le transfert des poissons dans le bécher dès qu&#39;il est pris au filet (pas de buvard). Nous n&#39;avons trouvé aucune différence significative dans le niveau de glucose sanguin entre les deux méthodes de transfert (P = 0,2241, test t). Anesthésiant: anesthésie chimique peut être adapté à de nombreuses études. Ici, nous avons démontré l&#39;anesthésie de l&#39;eau froide comme une alternative, parce anesthésiques beaucoup (y compris tricaine/MS-222 (Brown, 1993)), augmenter la glycémie. Dans des études précédentes, nous avons déterminé que l&#39;eau froide ne pose pas de glucose dans le sang chez le poisson zèbre (Eames et al., 2010). Pour l&#39;anesthésie de l&#39;eau froide, la température doit être diminué lentement. Le taux de diminution semble dépendre de la taille du poisson, avec des poissons plus petits vont plus vite que dans les plus gros poissons. Après l&#39;injection, vous pouvez observer que le poisson se remet trop lentement de l&#39;anesthésie (voir ci-dessous). Cela peut entraîner lorsque soit la température de départ est trop faible, ou lorsque la température diminue trop rapidement. La température de départ est trop faible si les virages poissons latéralement en entrant dans l&#39;eau. Si la température de départ est correct, le poisson va maintenir son équilibre initialement. Il va tourner ses nageoires pectorales en position horizontale, le souffle coupé, et avoir des mouvements opercule rapide. Typiquement, il nagera. Comme la température diminue, les mouvements de va diminuer et les poissons vont perdre l&#39;équilibre. Un avion d&#39;une anesthésie chirurgicale est atteint lorsque le poisson peut être manipulé sans réagir. Afin de maintenir le poisson sous anesthésie chirurgicale, vos doigts doivent être à froid, afin de les garder dans l&#39;eau avant de manipuler le poisson. L&#39;éponge doit également être conservés au froid à la même température que l&#39;eau utilisée pour anesthésier les poissons. Il est important de saturer l&#39;éponge avec de l&#39;eau qui est sufficiently froide pour maintenir l&#39;anesthésie une fois le poisson est placé sur elle. Injection: Avant les injections entreprise, vous voudrez peut disséquer au moins un poisson pour avoir une idée de l&#39;épaisseur de paroi du corps. Cela peut vous aider à juger à quel point l&#39;aiguille doit insérer pour entrer dans la cavité abdominale. De plus, comme vous insérer l&#39;aiguille, vous pouvez sentir la paroi du corps «donner» lorsque l&#39;aiguille pénètre dans la cavité abdominale. Pendant l&#39;injection, prendre des mesures pour garder le patient heureux. Assurez-vous que l&#39;éponge est saturée avec de l&#39;eau froide température correcte pour empêcher les poissons de revivre pendant l&#39;injection. Une éponge bien saturées et douce est importante pour minimiser les dommages à l&#39;échelle et le mucus qui couvre de la peau. Une éponge bien saturées est également important de garder les branchies aéré. Nous recommandons fortement l&#39;éponge en mousse énumérés ci-dessous sous Matériaux. Enfin, une fois le poisson est anesthésié, travailler rapidement pour minimiser le temps que le poisson est moins. Recouvrement: Le poisson doit se remettre de l&#39;anesthésie presque à l&#39;entrée du réservoir d&#39;eau chaude. Si le poisson ne commence pas immédiatement la natation, agiter doucement l&#39;eau vers les branchies pour accélérer la récupération. Si la récupération est lente, puis le poisson est allé trop vite, sous et vous devriez régler la procédure d&#39;anesthésie appropriée. Les causes possibles de la lente reprise sont examinées sous anesthésiant.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Foam Sponge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jaece Industries</td>
<td>L800-D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>60 mm Petri dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pipet tip box lid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>not too deep, e.g. 1.5 cm</td>
</tr>
<tr>
<td>Plastic storage container</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>deep, e.g. 7 cm </td>
</tr>
<tr>
<td>Thermometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Crushed ice</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>made from facility water</td>
</tr>
<tr>
<td>Warm facility water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1 liter or more</td>
</tr>
<tr>
<td>500 ml beaker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>for weighing</td>
</tr>
<tr>
<td>NanoFil syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
<td>NANOFIL</td>
<td>or Hamilton syringe</td>
</tr>
<tr>
<td>35 gauge needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>NF35BV-2</td>
<td>beveled</td>
</tr>
<tr>
<td>Silflex tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>SILFLEX-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>UltraMicroPump III and Micro4 controller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>UMPS-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Foot switch</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>15867</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plastic wrap</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paper towels</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cortland salt solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

intraperitoneal injection into adult zebrafish

Une méthode pratique pour traiter chimiquement le poisson-zèbre est d&#39;introduire le réactif dans l&#39;eau du réservoir, où il sera repris par les poissons. Cependant, cette méthode rend difficile de savoir combien de réactif est absorbé ou repris par poisson. Certaines questions expérimentales, en particulier ceux liés aux études métaboliques, peut-être mieux abordées par la livraison d&#39;une quantité définie de chaque poisson, basée sur le poids. Nous présentons ici une méthode pour intrapéritonéale (IP) d&#39;injection dans le poisson zèbre adulte. L&#39;injection est dans la cavité abdominale, postérieur à la ceinture pelvienne. Cette procédure est adaptée de méthodes vétérinaires utilisés pour les grands poissons. Il est sûr, que nous avons observé une mortalité zéro. En outre, nous avons vu des saignements au site d&#39;injection dans seulement 5 des 127 injections, et dans chacun de ces cas, le saignement a été brève, d&#39;une durée de quelques secondes, et la quantité de sang perdu était petit. Succès de cette procédure nécessite une manipulation en douceur du poisson par plusieurs étapes dont le jeûne, la pesée, anesthésier, l&#39;injection et la récupération. Des précautions sont nécessaires pour minimiser le stress tout au long de la procédure. Nos précautions en utilisant un volume d&#39;injection de petites et une aiguille 35G. Nous utilisons une solution saline Cortland que le véhicule, qui est osmotiquement équilibrée pour les poissons d&#39;eau douce. L&#39;aération des branchies est maintenu durant la procédure d&#39;injection par les première apportant le poisson dans un plan chirurgical de l&#39;anesthésie, qui permet des mouvements lents opercule, et la seconde, en tenant le poisson dans une cuvette à l&#39;intérieur d&#39;une éponge saturée d&#39;eau pendant l&#39;injection elle-même. Nous démontrons l&#39;utilité de l&#39;injection IP en injectant du glucose et du suivi de la montée du niveau de glucose dans le sang et son retour ultérieur à la normale. Comme le stress est connu pour augmenter le glucose sanguin chez les poissons téléostéens, nous comparons les taux de glycémie chez les adultes des véhicules à injection et non injecté et montrent que la procédure ne cause pas une hausse significative de la glycémie.

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Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

Nous démontrons injection intrapéritonéale dans le poisson zèbre adulte. Nous utilisons une microseringue 10 ul Nanofil contrôlée par un contrôleur Micro4 et UltraMicroPump III. Cette manifestation comprend l&#39;utilisation de l&#39;eau froide comme anesthésique.

Injection intrapéritonéale en Zebrafish adultes

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

intraperitoneal-injection-into-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

56.8K vues.  The University of Chicago. Nous démontrons injection intrapéritonéale dans le poisson zèbre adulte. Nous utilisons une microseringue 10 ul Nanofil contrôlée par un contrôleur Micro4 et UltraMicroPump III. Cette manifestation comprend l'utilisation de l'eau froide comme anesthésique.

Vidéo: Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

La transplantation de moelle rein entier chez le poisson zèbre pour adultes

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Recherche

Biologie

Injection of dsRNA into Female A. aegypti Mosquitos

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the James lab to inject dsRNA into female A. aegypti mosquitoes, which harbor the dengue virus.  The technique for calibrating injection needles, manipulating the injection setup, and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

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L&#39;injection d&#39;ARNdb dans Femme Mosquitos aegypti A.

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Zebrafish Brain Ventricle Injection

Proper brain ventricle formation during embryonic brain development is required for normal brain function.  Brain ventricles are the highly conserved cavities within the brain that are filled with cerebrospinal fluid.  In zebrafish, after neural tube formation, the neuroepithelium undergoes a series of constrictions and folds while it fills with fluid resulting in brain ventricle formation.  In order to understand the process of ventricle formation, and the neuroepithelial shape changes that occur at the same time, we needed a way to visualize the ventricle space in comparison to the brain tissue.  However, the nature of transparent zebrafish embryos makes it difficult to differentiate the tissue from the ventricle space.  Therefore, we developed a brain ventricle injection technique where the ventricle space is filled with a fluorescent dye and imaged by brightfield and fluorescent microscopy.  The brightfield and the fluorescent images are then processed and superimposed in Photoshop.  This technique allows for visualization of the ventricle space with the fluorescent dye, in comparison to the shape of the neuroepithelium in the brightfield image.  Brain ventricle injection in zebrafish can be employed from 18 hours post fertilization through early larval stages.  We have used this technique extensively in our studies of brain ventricle formation and morphogenesis as well as in characterizing brain morphogenesis mutants (1-3).

After neural tube formation, the neuroepithelium constricts and folds while the tube fills with embryonic cerebrospinal fluid (eCSF) to form the embryonic brain ventricles. We developed this ventricle injection technique to better visualize the fluid filled space in contrast to the neuroepithelial shape in a live embryo.

Injection Zebrafish ventricule cérébral

Proper brain ventricle formation during embryonic brain development is required for normal brain function.  Brain ventricles are the highly conserved ...

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is often the most effective and noninvasive form of delivery of an agent of interest. In the zebrafish (Danio rerio), IV injection of drugs has long been a challenge because of the small vessel diameter. This has also proved a significant hurdle for the injection of cells during hematopoeitic stem cell transplantation. Historically, injections into the bloodstream were done directly through the heart. However, this intra-cardiac procedure has a very high mortality rate as the heart is often punctured during injection leaving the fish prone to infection, massive blood loss or fatal organ damage. Drawing on our experience with the mouse, we have developed a new injection procedure in the zebrafish in which the injection site is behind the eye and into the retro-orbital venous sinus. This retro-orbital (RO) injection technique has been successfully employed in both the injection of drugs in the adult fish as well as transplantation of whole kidney marrow cells. RO injection has a much lower mortality rate than traditional intra-cardiac injection. Fish that are injected retro-orbitally tend to bleed less following injection and are at a much lower risk of injury to a major organ like the heart. Further, when performed properly, injected cells and/or drugs quickly enter the bloodstream allowing compounds to exert their effect on the whole fish and kidney cells to easily home to their niche. Thus, this new injection technique minimizes mortality while allowing efficient delivery of material into the bloodstream of adult fish. Here we exemplify this technique by retro-orbital injection of Tg(globin:GFP) cells into adult casper fish as well as injection of a red fluorescent dye (dextran, Texas Red ) into adult casper fish. We then visualize successful injections by whole animal fluorescence microscopy.

Here we show how to do retro-orbital injection in adult zebrafish.

Rétro-orbitaire d&#39;injection chez le poisson zèbre pour adultes

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

Dissection d&#39;organes sur le poisson zèbre pour adultes

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the eye, brain, and somites of zebrafish. The advantage of electroporation over other methods of genetic manipulation is that specific tissues can be targeted, both spatially and temporally, for the introduction of macromolecules by the application of electrical current. Here we describe the use of electroporation for transfecting mif and mif-like morpholinos into the tissues of the developing inner ear of the zebrafish. In past studies, mif morpholino injected into embryos at the 1- to 8-cell stage resulted in widespread morphological changes in the nervous system and eye, as well as the ear. By targeting the tissues of the inner ear at later stages in development, we can determine the primary effects of MIF in the developing inner ear, as opposed to secondary effects that may result from the influence of other tissues. By using phalloidin and acetylated tubulin staining to study the morphology of neurons, neuronal processes, and hair cells associated with the posterior macula, we were able to assess the efficacy of electroporation as a method for targeted transfection in the zebrafish inner ear. The otic vesicles of 24hpf embryos were injected with morpholinos and electroporated and were then compared to embryos that had received no treatment or had been only injected or electroporated. Embryos that were injected and electroporated showed a decrease in hair cell numbers, decreased innervation by the statoacoustic ganglion (SAG) and fewer SAG neurons compared with control groups. Our results showed that direct delivery of morpholinos into otocysts at later stages avoids the non-specific nervous system and neural crest effects of morpholinos delivered at the 1-8 cell stage. It also allows examination of effects that are directed to the inner ear and not secondary effects on the ear from primary effects on the brain, neural crest or periotic mesenchyme.

A method to deliver morpholinos directly into the zebrafish otocyst at 24hpf has been developed. Using microinjection of morpholinos into the lumen of otic vesicle and electroporation to effect penetration, we were able to bypass the effect of morpholinos on the brain and obtain effects specific to the inner ear.

Livraison directe de morpholinos MIF Into the otocyste Zebrafish par injection et électroporation affecte le développement oreille interne

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

La transplantation de cellules directement dans le rein de poisson zèbre adulte

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

Dissection du rein Zebrafish adultes

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

En électroporation in vivo de morpholinos dans la rétine de poisson zèbre adulte

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

En électroporation in vivo de morpholinos dans la régénération des adultes Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...