Name: functional and physiological methods of evaluating median nerve regeneration in the rat
Uploaded: 2020-04-18T14:00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functional and Physiological Methods of Evaluating Median Nerve Regeneration in the Rat at JoVE.com

Diogo Casal recebeu uma bolsa do Programa de Educação Médica Avançada, que tem o patrocínio da Fundação Calouste Gulbenkian, Fundação Champalimaud, Ministério da Saúde e Fundação para a Ciência e Tecnologia, Portugal. Os autores são muito gratos ao Sr. Filipe Franco pelo desenho ilustrativo na Figura 1. Os autores agradecem a ajuda técnica do Sr. Alberto Severino na filmagem e edição do vídeo. Por fim, os autores agradecem à sra. Sara Marques pela ajuda em todos os aspectos logísticos relativos à aquisição e manutenção dos animais.

Os autores não têm nada para revelar.

Este artigo apresenta um protocolo para criar diferentes tipos de lesões de MN e reparar no rato. Além disso, ilustra como avaliar a recuperação funcional desse nervo utilizando vários testes comportamentais não invasivos e medidas fisiológicas.
Notavelmente, vários dos testes funcionais descritos neste artigo, ou seja, o Teste de Corrida de Escada e o Teste da Corda, dependem significativamente da disposição do rato para realizar a tarefa com a expectativa de obter a recompensa alimentar51,52,53. Deve-se notar que certas cepas de ratos são mais passíveis de treinamento e realização reprodutivelmente neste tipo de testes51,52,53. Por exemplo, os ratos de Lewis têm um desempenho ruim nestes testes tanto na fase de treinamento quanto,posteriormente,51,52,53.
A habitação de ratos deve permitir ampla liberdade de movimento de acordo com seu comportamento exploratório natural, além de permitir que os animais experimentais se familiarizem com alguns dos elementos presentes nos testes funcionais19. Portanto, diferentes formas de moradia que permitem maior liberdade de movimento são mostradas. As gaiolas grandes são personalizadas com elementos de enriquecimento que são posteriormente utilizados nos testes funcionais (por exemplo, cordas e escadas).
Indiscutivelmente, esses elementos enriquecedores, bem como as gaiolas com rodas de corrida incorporadas e as esferas de treinamento individuais fornecem uma forma de fisioterapia pós-operatória semelhante à oferecida aos pacientes humanos operados no sistema nervoso periférico10.
Significativamente, embora alguns autores defendam dissecar os tecidos subcutâneos e as fáscias musculares sem rodeios ou por corte limpo com um bisturi número 15, recomenda-se o uso de termocauterismo ao dissecar essas estruturas para minimizar o risco de hematoma pós-operatório.
Deve-se notar que inúmeros testes foram elaborados para testar diferentes aspectos da reparação do nervo periférico no rato, ou seja, regeneração axonal, reinervação de alvo e recuperação funcional, alguns dos quais estão além do escopo deste estudo29,54,55,56. Por exemplo, a análise cinemática29,36,55 e avaliação histomorfométrica29,36,57 são amplamente empregadas por múltiplos autores. Além disso, vários desses testes envolvem variações para maximizar a eficiência e/ou reprodutibilidade54. Por exemplo, a algisemetria mecânica (ou seja, avaliação de respostas a estímulos mecânicos dolorosos) pode ser avaliada qualitativamente usando um dado filamento von Frey, como descrito no presente artigo, ou semiquantitativamente usando filamentos von Frey sucessivamente mais fortes, ou mesmo quantitativamente usando dispositivos eletrônicos que aplicam pressões crescentes até que uma resposta de retirada seja observada30,54.
Da mesma forma, embora vários autores utilizem a análise de pista de caminhada para avaliar o reparo do nervo de membros dianteiros no rato, outros autores argumentam que lesões únicas de MN frequentemente não produzem alterações reprodutíveis nas patas10,58,59. Além disso, alguns afirmaram que essas alterações podem não ser proporcionais à recuperação muscular10,60. Tendo isso em mente, alguns pesquisadores têm defendido o uso da análise de pista de caminhada na pata dianteira principalmente na avaliação da recuperação após esmagamento das lesões de neve e não após reconstrução do nervo segmental10,50,61.
O Teste de Apreensão é amplamente utilizado para avaliar a recuperação motora dos músculos controlados pelo MN16,27. Para garantir a uniformidade e a reprodutibilidade dos dados obtidos com este teste, recomenda-se a aplicação do Teste de Apreensão utilizando a metodologia bem estabelecida proposta por Bertelli et al.16. No entanto, o protocolo atual difere na forma de não imobilizar rotineiramente a pata contralateral para evitar estresse indevido11,27. Deve-se notar também que outros autores, após imobilizar a pata ilesa, avaliam quantitativamente o Teste de Apreensão utilizando um dinamômetro ou uma escala27,56. No entanto, essa avaliação quantitativa pode ser afetada pela força que o pesquisador aplica à cauda do rato26. Além disso, é difícil distinguir entre a força gerada pelos músculos flexores digitais (unicamente inervados pelo MN no rato e o objeto do Teste de Apreensão9) da força produzida pelos flexores de pulso, que incluem o flexor carpi ulnaris que recebe sua inervação do nervo ulnar9,10,27. Para tentar contornar esses vieses potenciais, este protocolo utiliza uma escala ordinal semelhante à Escala do Conselho de Pesquisa Médica comumente usada para classificar a força muscular em humanos10,11,62. Alternativamente, outros autores descreveram uma avaliação detalhada da apreensão usando análise de vídeo e um sistema de pontuação baseado em vídeo11,63.
Uma desvantagem potencial do uso do MN em comparação com o nervo ciático é que uma maior quantidade de informação está disponível em relação ao último nervo. Isso, por sua vez, pode fazer comque os dados obtidos com o MN com os de trabalhos experimentais anteriores mais difíceis46,48,64. Além disso, o tamanho menor do MN em relação ao nervo ciático torna a manipulação cirúrgica mais desafiadora8,12,27,56,65.
Ao contrário da metodologia descrita neste artigo, a avaliação da eletroneuromiografia pode ser realizada utilizando eletrodos monopolares transcutâneos colocados no braço e nas regiões ternar51. Apesar de menos invasivo, este método apresenta o risco de confusão potencial devido à possibilidade de coestimulação do nervo ulnar na região do braço9,51.
A maioria dos autores concorda que nem todos os testes utilizados no rato fornecem resultados concordantes, pois a reparação do nervo periférico depende de uma complexa gama de fatores, compreendendo a sobrevivência dos neurônios, alongamento e poda axonal, sinaptogênese, recaptura bem sucedida dos órgãos sensoriais e unidades motoras denervadas, e plasticidade cerebral7,10,50,66,67.
Finalmente, deve-se notar que uma ressalva significativa dos modelos de roedores é que os nervos periféricos de ratos estão muito mais próximos de seus órgãos finais e têm áreas transversais muito menores do que as estruturas humanas homólogas. No entanto, essa diferença de tamanho garante dados experimentais mais rápidos em roedores, e melhores resultados gerais em ratos em comparação com humanos são esperados68. De fato, vários autores alertam que o cuidado deve ser utilizado ao tentar extrapolar dados experimentais obtidos na reparação de nervos periféricos usando roedores para humanos7,69. Modelos primatas são considerados mais comparáveis70. No entanto, seu uso está associado a restrições éticas, logísticas e orçamentárias vexatórias71.
Embora o nervo ciático seja o nervo mais comumente usado na pesquisa do nervo periférico, o rato MN apresenta múltiplas vantagens. Por exemplo, as lesões de MN estão associadas a uma menor incidência de contraturas articulares e automutilação da pata afetada11,,12,,16,56. Significativamente, a autotomia subseqüente à transsecção do nervo ciático aflige 11-70% dos ratos. Isso pode tornar as avaliações atuais como o índice ciático impossível14. Isso, por sua vez, faz com que a estimativa do número de animais necessários para obter um determinado poder estatístico seja complicada15.
Além disso, como o MN é mais curto que o nervo ciático, a recuperação nervosa é observada mais cedo58,72,73,74,75,76. Além disso, o MN não é coberto por massas musculares, tornando sua dissecção tecnicamente mais fácil do que a do nervo ciático16. Além disso, o MN tem um caminho paralelo para o nervo ulnar no braço. Assim, o nervo ulnar pode ser facilmente usado como enxerto nervoso para reparar lesões de MN. Finalmente, em humanos, a maioria das lesões nervosas periféricas ocorrem no membro superior, o que suporta ainda mais o uso desse nervo no rato77,78.
Indiscutivelmente, os roedores são os animais experimentais mais comumente utilizados no reino da reparação do nervo periférico48,79. Como mostrado, o rato MN é um modelo conveniente de lesão e reparação do nervo periférico. De fato, existem múltiplas estratégias padronizadas disponíveis para avaliar a recuperação motora e sensorial, permitindo uma comparação mais fácil dos resultados36,,46,,60,,80,,81,,82. Muitos desses métodos são não invasivos, permitindo uma avaliação diária.
Além disso, a fisioterapia faz parte do padrão de atendimento dos pacientes que se recuperam de lesões nervosas periféricas. Como demonstrado neste artigo, existem múltiplas estratégias para fornecer um ambiente pós-operatório de fisioterapia a ratos submetidos às lesões de MN4,5. Assim, este modelo é particularmente adequado para replicar o cenário clínico, facilitando a extrapolação dos resultados para a espécie humana12,27,48,56,58,83.
Como mostrado neste artigo, várias estratégias padronizadas estão disponíveis para avaliar a recuperação motora e sensorial no modelo MN do rato. A maioria deles são procedimentos não invasivos, permitindo avaliação frequente. Além disso, como a maioria das lesões nervosas periféricas na espécie humana ocorre no membro superior, as configurações de fisioterapia experimental mencionadas podem imitar mais adequadamente a recuperação no contexto clínico. Indiscutivelmente, isso pode facilitar a extrapolação de resultados para a espécie humana, validando ainda mais o uso deste nervo no rato.

Lesões nervosas periféricas ocorrem regularmente como resultado de trauma, infecção, vasculite, autoimunidade, malignidade e/ou radioterapia1,2. Infelizmente, o reparo do nervo periférico continua a apresentar resultados clinicamente imprevisíveis e frequentemente decepcionantes3,4. Há um consenso generalizado de que ainda é necessária uma pesquisa básica e translacional considerável para melhorar a perspectiva dos afetados4,5,6,7.
O rato MN apresenta grandes semelhanças com o dos seres humanos8,9 (Figura 1). Originário do plexo braquial na região axilar, este nervo desce para o aspecto medial do braço, atingindo o cotovelo, e ramificando-se para a maioria dos músculos no compartimento ventral do antebraço. O MN alcança a mão, onde inerva os músculos tenar e os dois primeiros músculos lumbrical, bem como parte da pele da mão do rato9 (Figura 1).
Utilizando o rato MN, é possível replicar adequadamente lesões nervosas periféricas em humanos10,,11,12. Este nervo tem várias vantagens potenciais de pesquisa em relação ao nervo ciático habitualmente usado. Como o MN está localizado no membro dianteiro dos ratos (semelhante aos membros superiores humanos), ele pode ser danificado experimentalmente com um impacto muito menor no bem-estar do rato, em comparação com o nervo ciático, que inerva uma porção substancial do membro pélvico13. Além disso, em humanos a maioria das lesões clínicas ocorre no membro superior, que corresponde ao membro dianteiro do rato10,,11,12,14,15,16.
Este artigo mostra como produzir diferentes tipos de lesões de MN no rato. Além disso, são apresentadas diferentes formas de simular fisioterapia pós-operatória. Por fim, são descritos testes para avaliar a recuperação funcional do MN. Existem múltiplas estratégias padronizadas disponíveis para avaliar a recuperação motora e sensorial utilizando um modelo MN de lesão e reparação do nervo periférico, permitindo assim uma fácil comparação dos resultados. O modelo MN é particularmente adequado para replicar o cenário clínico, facilitando a extrapolação dos resultados para a espécie humana.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetaminophen</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>https://www.amazon.com/Childrens-Tylenol-grape-flavor-ages/dp/B0051VVVZG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acland clamps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>00398 V</td>
			<td>http://www.merciansurgical.com/aclandclamps.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acland Single Clamps B-1V (Pair)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>396</td>
			<td>http://www.merciansurgical.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biogel Surgical Gloves</td>
			<td>Medex Supply</td>
			<td>30465</td>
			<td>https://www.medexsupply.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSL Analysis</td>
			<td>BIOPAC Systems</td>
			<td></td>
			<td>https://www.biopac.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castroviejo needle holders</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12565-14</td>
			<td>http://s-and-t.ne</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clamp applicator</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>CAF-4</td>
			<td>http://www.merciansurgical.com/acland-clamps.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constante voltage stimulator</td>
			<td>BIOPAC Systems</td>
			<td>STM200</td>
			<td>https://www.biopac.com/product/constant-voltage-stimulator-unipolar-pulse/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cutasept skin disinfectant</td>
			<td>Bode Chemie</td>
			<td></td>
			<td>http://www.productcatalogue.bode-chemie.com/products/skin/cutasept_f.php</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dafilon 10-0</td>
			<td></td>
			<td>G1118099</td>
			<td>http://www.bbraun.com/cps/rde/xchg/bbraun-com/hs.xsl/products.html?prid=PRID00000816</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Derf Needle Holders 12 cm TC</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>703DE12</td>
			<td>http://www.merciansurgical.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry heat sterilizer</td>
			<td>Quirumed</td>
			<td>2432</td>
			<td>http://www.quirumed.com/pt/material-de-esterilizac-o/esterilizadores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamometer</td>
			<td>SAUTER</td>
			<td>FH5</td>
			<td>https://www.sauter.eu/shop/en/measuring-instruments/force-measurement/FH-S/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroneuromiography setup</td>
			<td>BIOPAC Systems</td>
			<td>MP36</td>
			<td>https://www.biopac.com/product/biopac-student-lab-basic-systems/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethilon 5-0</td>
			<td></td>
			<td>W1618</td>
			<td>http://www.farlamedical.co.uk/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLIR Software</td>
			<td>FLIR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graeffe forceps 0.8 mm tips curved</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11052-10</td>
			<td>http://www.finescience.de</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graph paper</td>
			<td>Ambar</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Lamp HL-1</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>727562</td>
			<td>https://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/haisku3_10001_11051_39108_-1_HAI_ProductDetail_N_37610_37611_37613</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium Solution (Heparin LEO 10000IU/ml)</td>
			<td>Universal Drugstore</td>
			<td></td>
			<td>http://www.universaldrugstore.com/medications/Heparin+LEO/10000IU%2Fml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Temperature Cautery</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>AA03</td>
			<td>http://www.boviemedical.com/products_aaroncauteries_high.asp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homeothermic Blanket System with Flexible Probe</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>507220F</td>
			<td>https://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/haisku3_10001_11051_39108_-1_HAI_ProductDetail_N_37610_37611_37613</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared camera</td>
			<td>FLIR</td>
			<td>E6</td>
			<td>http://www.flir.eu/instruments/e6-wifi/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrapac - Adson Toothed Forceps (Extra Fine)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>7973</td>
			<td>http://www.millermedicalsupplies.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors 11.5 cm Curves EASY-CUT</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>EA7613-11</td>
			<td>http://www.merciansurgical.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>K113</td>
			<td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/k113?lang=pt&#38;region=PT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lacri-lube Eye Ointment 5g</td>
			<td>Express Chemist</td>
			<td>LAC101F</td>
			<td>http://www.expresschemist.co.uk/lacri-lube-eye-ointment-5g.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo Scissors 14 cm Straight Chamfered Blades EASY-CUT</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>EA7652-14</td>
			<td>http://www.merciansurgical.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>Recropharma</td>
			<td>Mobic</td>
			<td>https://www.recropharma.com/product-pipeline/meloxicam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene Blue solution</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Jewellers Forceps 11 cm straight 00108</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>JF-5</td>
			<td>http://www.merciansurgical.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Jewellers Forceps 11cm angulated 00109</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>JFA-5b</td>
			<td>http://www.merciansurgical.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro retractor</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>RS-6540</td>
			<td>http://www.finescience.de</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Scissors Round Handles 15 cm Straight</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>67</td>
			<td>http://www.merciansurgical.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-vessel dilators 11 cm 0.3 mm tips 00124</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>D-5a.2</td>
			<td>http://www.merciansurgical.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monosyn 5-0</td>
			<td></td>
			<td>15423BR</td>
			<td>http://www.mcfarlanemedical.com.au/15423BR/SUTURE-MONOSYN-5_or_0-16MM-70CM-(C0023423)-BOX_or_36/pd.php</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal saline for irrigation</td>
			<td>Hospira, Inc.</td>
			<td>0409-6138-22</td>
			<td>http://www.hospira.com/en/search?q=sodium+chloride+irrigation%2C+usp&#38;fq=contentType%3AProducts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating microscope</td>
			<td>Leica Surgical Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>http://www.leica-microsystems.com/products/surgical-microscopes/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skin Skribe Surgical Skin Marker</td>
			<td>Moore Medical</td>
			<td>31456</td>
			<td>https://www.mooremedical.com/index.cfm?/Skin-Skribe-Surgical-Skin-Marker/&#38;PG=CTL&#38;CS=HOM&#38;FN=ProductDetail&#38;PID=1740&#38;spx=1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snacks</td>
			<td>Versele-Laga</td>
			<td>Complete Crock-Berry</td>
			<td>http://www.versele-laga.com/en/complete/products/complete-crock-berry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight mosquito forcep</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91308-12</td>
			<td>http://www.finescience.de</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical drapes</td>
			<td>Barrier</td>
			<td>800430</td>
			<td>http://www.molnlycke.com/surgical-drapes/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veet Sensitive Skin Hair Removal Cream Aloe Vera and Vitamin E 100 ml</td>
			<td>Veet</td>
			<td></td>
			<td>http://www.veet.co.uk/products/creams/creams/veet-hair-removal-cream-sensitive-skin/</td>
		</tr>
	</tbody>
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functional and physiological methods of evaluating median nerve regeneration in the rat

O principal objetivo desta investigação é mostrar como criar e reparar diferentes tipos de lesões nervosas medianas (MN) no rato. Além disso, são apresentados diferentes métodos de simulação da fisioterapia pós-operatória. Múltiplas estratégias padronizadas são utilizadas para avaliar a recuperação motora e sensorial utilizando um modelo MN de lesão e reparação do nervo periférico, permitindo assim fácil comparação dos resultados. Várias opções estão incluídas para fornecer um ambiente de fisioterapia pós-operatória para ratos que sofreram lesões de MN. Por fim, o artigo fornece um método para avaliar a recuperação do MN utilizando vários testes não invasivos (ou seja, teste de apreensão, teste de picada de pino, teste de caminhada de escada, teste de subida de corda e análise de pista de caminhada) e medidas fisiológicas (termografia infravermelha, eletroeuromiografia, avaliação de força de flexão e determinação do peso muscular flexor carpi radialis). Assim, esse modelo parece particularmente apropriado para replicar um cenário clínico, facilitando a extrapolação dos resultados para a espécie humana.
Embora o nervo ciático seja o nervo mais estudado na pesquisa do nervo periférico, a análise do rato MN apresenta várias vantagens. Por exemplo, há uma incidência reduzida de contraturas articulares e automutilação do membro afetado em estudos de lesão de MN. Além disso, o MN não é coberto por massas musculares, tornando sua dissecção mais fácil do que a do nervo ciático. Além disso, a recuperação de MN é observada mais cedo, porque o MN é mais curto que o nervo ciático. Além disso, o MN tem um caminho paralelo para o nervo ulnar no braço. Assim, o nervo ulnar pode ser facilmente usado como enxerto nervoso para reparar lesões de MN. Finalmente, o MN em ratos está localizado no membro dianteiro, semelhante ao membro superior humano; em humanos, o membro superior é o local da maioria das lesões nervosas periféricas.

Um total de 34 ratos foram divididos aleatoriamente nos seguintes grupos: Sham (n = 17), Excisão (n = 17) e Enxerto Nervoso (n = 10) para a operação. Todos os ratos sobreviveram à cirurgia e ao pós-operatório sem intercorrências. Uma semana após a cirurgia e nos 100 dias seguintes, todos os animais foram submetidos aos testes funcionais descritos acima uma vez por semana. Os resultados representativos de cada um desses testes são descritos abaixo.
Teste de apreensão
A porcentagem de ratos com uma resposta positiva no teste de apreensão foi maior para o grupo Sham. Esse valor aumentou gradualmente ao longo do tempo em ratos dos grupos Crush e Nerve Graft (Figura 3).
Teste de pino
Os ratos do grupo Sham tiveram as melhores pontuações no teste acumulado de picada de pino em relação aos ratos do grupo enxerto nervoso. Ambos tiveram melhores pontuações do que os ratos do grupo Excision (Figura 4).
Teste de corrida de escada
A velocidade dos ratos no teste de corrida de escada foi mais alta no grupo Sham do que nos ratos submetidos à lesão de MN. Entre estes últimos, o tempo de execução da escada tende a diminuir com o tempo, paralelamente à recuperação de MN (Figura 5).
Teste de corda
Como no teste de corrida de escada, o tempo que os ratos levaram para subir a corda foi menor no grupo Sham em comparação com os grupos em que o MN foi ferido. A velocidade dos ratos neste teste aumentou quando o MN foi autorizado a recuperar (Figura 6).
Análise de pista de caminhada
A análise das faixas a pé tende a apresentar alterações na morfologia das pegadas (Figura 7). Essas alterações foram frequentemente mais acentuadas em lesões de esmagamento do que em lesões do nervo segmental50.
Termografia infravermelha
A termografia foi útil ao examinar as diferenças de temperatura entre as patas dianteiras nos primeiros 30 dias após a cirurgia. As diferenças de temperatura foram mais perceptíveis em ratos com MN mais gravemente ferido, como nos do grupo Excision (Figura 8 e Figura 9).
Electroneuromiografia
A Tabela 1 resume a importância biológica das medições de eletroneuromiografia, proporcionando resultados representativos para os diferentes grupos experimentais. Vários padrões foram observados com a eletroneuromiografia. Um CMAP normal foi típico de um rato do grupo Sham, enquanto um CMAP polifásico foi associado com um grau variável de lesão do MN, como no Crush e nos grupos de enxerto nervoso (Figura 10). No grupo excision, não foram observados CMAPs.
Força de flexão do pulso
Dado que a flexão do pulso depende principalmente do MN, este teste foi utilizado para avaliar a recuperação motora no território deste nervo. A força de flexão do pulso foi mais próxima do normal quando a recuperação foi máxima (Figura 11).
Peso muscular e morfologia
O peso e a morfologia do músculo flexor carpis radialis dependiam da recuperação de MN, pois este músculo é inervado exclusivamente pelo MN9,10. Assim, o peso normal e a morfologia foram observados no grupo Sham. Observou-se perda de peso e tropismo muscular nos grupos Esmagamento, Enxerto Nervosoe Excisão (Figura 12).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59767/59767fig01.jpg"> Figura 1: Representação esquemática da anatomia do nervo mediano do rato. (1) Origem e término do nervo mediano no cérebro de rato (área verde = área motora primária; área azul = área sensorial primária). (2) Seção transversal da medula espinhal a nível de segmento C7; (3) Nervo axilar; (4) Nervo musculocutâneo; (5) Nervo radial; (6) Nervo mediano; (7) Nervo ulnar; (8) Ramo cutâneo medial do braço; (9) Ramo cutâneo medial do antebraço; (10) Artéria axilar; (11) Artéria braquial; (12) Artéria mediana; (13) Artéria radial superficial; (14) Artéria ulnar; (15) Ramo motor do nervo mediano para o músculo pronador teres; (16) Ramo motor do nervo mediano para o músculo flexor carpis radialis; (17) Ramo motor do nervo mediano para o músculo flexor digitorsuperficial superficialis; (18) Ramo motor do nervo mediano para o músculo flexor digitorum profundus; (19) Ramo sensorial do nervo mediano para a região ternar; (20) Artéria palmar comum do primeiro espaço interosseous; (21) Artéria digital palmar radial do primeiro dígito; (22) Ramo motor do nervo mediano para os músculos do ternar; (23) Arco arterial palmar; (24) Nervo digital palmar radial do primeiro dígito; (25) Nervo digital palmar ulnar do primeiro dígito; (26) Artéria palmar comum do terceiro espaço interassérea; (27) Ramificações motoras das divisões terminais do nervo mediano para os três primeiros músculos lumbrical; (28) Nervos digitais palmarulnar do segundo, terceiro e quarto dígitos; (29) Artérias digitais palmarulnar para o quarto e quinto dígitos; (30) Nervos digitais palmares radiais do segundo, terceiro e quarto dígitos; (31) Artéria digital palmar radial do quinto dígito; (32) Território da pele do nervo mediano na pata dianteira (região de sombreado azul). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59767/59767fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59767/59767fig02.jpg"> Figura 2: Fotografia do membro dianteiro direito do rato mostrando a anatomia cirúrgica do nervo mediano no braço e nas regiões axilares. Cr, cranial; Eu, medial <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59767/59767fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59767/59767fig03.jpg"> Figura 3: Percentual de ratos com teste de apreensão positivo no grupo experimental diferente durante um período de 100 dias após a cirurgia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59767/59767fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59767/59767fig04.jpg"> Figura 4: Avaliação da nocicepção utilizando resultados cumulativos de pino na pata dianteira operada normalizada na pata contralateral nos diferentes grupos experimentais. As barras verticais representam intervalos de confiança de 95%. As linhas horizontais na parte superior da figura indicam diferenças estatisticamente significativas entre os grupos experimentais, ***p<0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59767/59767fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59767/59767fig05.jpg"> Figura 5: Velocidade média no teste de corrida de escada nos diferentes grupos experimentais. As barras verticais representam intervalos de confiança de 95%. Os asteriscos na parte superior do número indicam diferenças estatisticamente significativas entre os grupos, *p<0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59767/59767fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59767/59767fig06.jpg"> Figura 6: Velocidade média de subida no teste de corda nos grupos Sham e Excision. As barras verticais representam intervalos de confiança de 95%. Os asteriscos na parte superior da figura mostram diferenças estatisticamente significativas entre os grupos, *p<0,05; **p<0,01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59767/59767fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59767/59767fig07.jpg"> Figura 7: Parâmetros de pista de caminhada nos diferentes grupos experimentais. Os valores no membro operado são expressos como percentuais de meios normalizados para o membro contralateral. (A)Fator de postura; (B) Comprimento de impressão; (C) Fator de disseminação de dedos; (D) Fator de disseminação de dedos intermediários; (E) Comprimento do passo; (F)Base de apoio. As barras verticais representam intervalos de confiança de 95%. As linhas horizontais na parte superior da figura indicam diferenças estatisticamente significativas entre os grupos experimentais. D30, D60, D90 = 30, 60 e 90 dias após a cirurgia, *p<0,05; **p<0,01; p<0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59767/59767fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59767/59767fig08.jpg"> Figura 8: Diferença média de temperatura registrada pela termografia infravermelha. As parcelas da caixa representam a diferença de temperatura entre a região palmar do nervo mediano no lado operado (lado direito) e o lado contralateral (esquerda) nos grupos Sham (n = 17) e Excisão (n = 17), *p<0,05; **p<0,01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59767/59767fig08large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59767/59767fig09.jpg"> Figura 9: Padrão típico de termografia infravermelha de um animal do grupo de excisão durante os primeiros 45 dias após a cirurgia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59767/59767fig09large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59767/59767fig10.jpg"> Figura 10: Padrões típicos de Potenciais de Ação Muscular Composta (CMAPs) de um animal dos grupos Sham e Nerve Graft 90 dias após a cirurgia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59767/59767fig10large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59767/59767fig11.jpg"> Figura 11: Avaliação da força de flexão do pulso em ambas as patas dianteiras 90 dias pós-operatórios em diferentes grupos experimentais. A força de flexão do pulso foi avaliada utilizando-se a área sob a curva (AUC) durante um período de tempo de 30 s e utilizando estimulação supratetânea. Linhas verticais denotam intervalos de confiança de 95%. As linhas horizontais na parte superior da figura destacam diferenças estatisticamente significativas entre os grupos, **p<0,01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59767/59767fig11large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59767/59767fig12.jpg"> Figura 12: Flexor carpi radialpeso muscular e aparência macroscópica 100 dias após a cirurgia. (A) Parcelas de caixa que retratam o peso muscular flexor carpi radialis normalizado em diferentes grupos experimentais, **p<0.01; p<0,001. (B) Fotografias dos músculos dos lados direito e esquerdo nos grupos experimentais Sham e Excision. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59767/59767fig12large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Parâmetro</td>
			<td>Significância do parâmetro</td>
			<td>Grupo Sham</td>
			<td>Grupo de excisão</td>
			<td>Grupo NG</td>
		</tr>
<tr>
<td>Limiar de estimulação neurológica (%)</td>
			<td>Avaliação da regeneração nervosa, pois há um número mínimo de fibras nervosas necessárias para produzir um CMAP ou uma contração muscular visível12
</td>
			<td>281,63 ± 271,65</td>
			<td>5359,98 ± 3466,52</td>
			<td>2108,12 ± 2115,13</td>
		</tr>
<tr>
<td>Limiar de estimulação motora (%)</td>
			<td>Avaliação da regeneração nervosa, pois há um número mínimo de fibras nervosas necessárias para produzir um CMAP ou uma contração muscular visível12
</td>
			<td>462,52 ± 118,91</td>
			<td>1694,10 ± 503,24</td>
			<td>1249,50 ± 503,24</td>
		</tr>
<tr>
<td>Latência (%)</td>
			<td>Avaliação da velocidade de condução nervosa nas fibras nervosas mais rápidas, ou seja, as maiores fibras mielinadas44
</td>
			<td>113,55 ± 25,04</td>
			<td>N/A</td>
			<td>132,80 ± 69,95</td>
		</tr>
<tr>
<td>Velocidade de transdução neuromuscular (%)</td>
			<td>Avaliação da velocidade de condução nervosa nas fibras nervosas mais rápidas, ou seja, as maiores fibras mielinadas44
</td>
			<td>92,01 ± 20,88</td>
			<td>N/A</td>
			<td>91,30 ± 26,51</td>
		</tr>
<tr>
<td>Amplitude de CMAPs (%)</td>
			<td>Avaliação do número de unidades motoras reinervadas34
</td>
			<td>110,63 ±45,66</td>
			<td>N/A</td>
			<td>41,60 ± 24,84</td>
		</tr>
<tr>
<td>Duração dos CMAPs (%)</td>
			<td>Avaliação da sincronia da inervação muscular, que depende do grau de reinervação muscular e mielinação das fibras motoras interiores44,45
</td>
			<td>101,12 ± 23,92</td>
			<td>N/A</td>
			<td>151,06 ± 54,52</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">
NG, enxerto nervoso CMAPs, potencial de ação muscular composta. N/A,não aplicável Todos os parâmetros são expressos como percentuais dos valores médios contralaterais. As variáveis numéricas são expressas como média ± desvio padrão.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Avaliação eletroeuromiográfica no final do experimento.

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Functional and Physiological Methods of Evaluating Median Nerve Regeneration in the Rat

Apresenta-se um protocolo para produzir diferentes tipos de lesões nervosas medianas (MN) e reparar no rato. Além disso, o protocolo mostra como avaliar a recuperação funcional do nervo utilizando vários testes comportamentais não invasivos e medidas fisiológicas.

Métodos funcionais e fisiológicos de avaliação da regeneração do nervo mediano no rato

The main goal of this investigation is to show how to create and repair different types of median nerve (MN) lesions in the rat. Moreover, different ...

Usando o nervo mediano do rato, é possível replicar adequadamente lesões nervosas periféricas em humanos. Clinicamente, a maioria dessas lesões ocorre, na extremidade superior que dá suporte ao uso deste modelo experimental. Neste artigo vamos mostrar como produzir diferentes tipos de lesões nervosas medianas no rato.Além disso, vamos ilustrar como avaliar a recuperação funcional deste nervo usando vários testes. O nervo mediano é originário dos segmentos da medula espinhal C6 a T1. O nervo mediano é destacado em verde. Neste vídeo, as cortinas cirúrgicas não são usadas para fins de demonstração.Por favor, inclua uma cortina durante a realização da cirurgia. A pele no aspecto medial do braço direito e da região peitoral é incisada até o plano de fáscias profundas. Vasos sanguíneos estão cuidadosamente ligados.Em seguida, a fáscia braquial é cuidadosamente cortada, tomando cuidado para não danificar as estruturas vasculares e nervosas, no aspecto medial do braço. Um par de tesouras é aberta sem rodeios abaixo, a inserção terminal do músculo peitoral principal, a fim de provocar este músculo, longe da artéria axilar e veia subjacente, bem como dos ramos terminais do plexo braquial. A inserção do músculo peitoral maior, é então dividida com um cautery elétrico.O músculo peitoral menor é então exposto e cortado. O nervo medial é então dissecado sem rodeios dos vasos braquiais e do nervo ulnar até a região do cotovelo. Agora é possível observar os diferentes ramos terminais do plexo braquial, ou seja, o Mediano, o Ulnar, o Radial, o Axilário e os nervos musculocutâneos.Com o nervo mediano exposto e isolado diferentes lesões mecânicas podem ser induzidas. Um grupo Sham pode ser criado, apenas dissecando o nervo mediano. No grupo de esmagamento, o nervo mediano é comprimido, usando fórceps de microcirurgia por 15 segundos.O grupo de excisão resulta da remoção de um segmento de 10 milímetros de comprimento do nervo mediano. O toco proximal do nervo mediano é ligado com o 8-0 sutura de nylon para evitar o crescimento axonal. Alternativamente, é possível girar o segmento excisado 180 graus e usá-lo como enxerto nervoso autólogo.Neste caso, os tocos proximais e distais da seção no nervo da mídia são suturados ao enxerto nervoso usando pontos de nylon de 10-0. A fisioterapia faz parte do padrão de cuidado dos pacientes em recuperação de lesões nervosas periféricas. Existem múltiplas estratégias para fornecer fisioterapia pós-operatória aos ratos, que foram submetidas a lesões nervosas medianas.É importante escolher ratos jovens e permitir que eles tenham contato com os instrumentos de fisioterapia antes da cirurgia. Isso garante uma adaptação mais fácil e rápida às configurações de exercícios. Além disso, os instrumentos de fisioterapia devem permitir que os ratos tenham algum grau de liberdade e, idealmente, permitir que eles realizem movimentos finos com as previs.Existem várias formas de realizar fisioterapia. Por exemplo, esferas individuais podem ser usadas. Coloque o rato dentro da esfera e coloque-o em uma sala com poucos obstáculos.Deixe-o explorar o quarto por meia hora. Faça isso uma vez por dia. Ratos também podem ser alojados em gaiolas individuais.Com rodas de corrida incorporadas. Desta forma, os ratos podem se exercitar, tanto quanto quiserem e quando quiserem. Outra possibilidade é acomodar os ratos em grupos em gaiolas maiores.Personalize as gaiolas usando couros, cordas, rodas de corrida e outros elementos de enriquecimento ambiental. Isso lhes permite ampla liberdade de movimento, de acordo com seu comportamento exploratório natural e permite que os ratos se familiarizem, com alguns dos elementos presentes, nos testes funcionais. Antes de realizar os testes funcionais, familiarize os ratos com os alimentos que você escolheu usar como reforço positivo.Realize os testes à noite, quando os ratos estiverem naturalmente mais ativos. Comece com um teste de apreensão. Coloque o rato na grade e levante-o pela cauda, deixando-o pegar a grade.Quando o rato é capaz de pegar a grade, com força semelhante com ambas as previs. Significa que o nervo mediano está funcionando e o teste de Apreensão é considerado positivo. Se não conseguir pegar a grade com a pata ferida, o teste de agarramento é considerado negativo.Para o teste Pin Prick, coloque o rato na plataforma e espere alguns minutos até que as atividades exploratórias e de preparação diminuam. Comece quando o rato estiver parado e de pé sobre as previs. Com a ajuda do espelho, insira o cabelo Von Frey através da malha para cutucar o aspecto palmar da previ.Repita isso cinco vezes em cada previ, alternativamente, esperando alguns segundos após cada avaliação. Marque a resposta de retirada da seguinte forma, zero para nenhuma resposta de retirada, se o rato lentamente remover a pata do filamento e dois se o rato responder rapidamente ao estímulo e remover a pata ou lamber a pata. Coloque o rato na parte inferior da escada e toque suavemente na cauda do rato.Inicie o temporizador assim que o rato começar a andar e pare-o assim que seus focinhos cruzarem a entrada das caixas. Regissua a hora e repita o teste três vezes. Coloque o rato no fundo da corda e convença-o a escalar-o tocando suavemente sua cauda.Considere o teste válido se o animal não fizer, hesite durante a tarefa ou pare de escalar. Inicie o temporizador assim que o animal iniciar a escalada e pare no momento em que o focinho do rato cruza a entrada da plataforma. Dê ao rato um lanche depois de executar, as tarefas corretamente e deixe-o, alguns minutos de descanso antes de repeti-lo.Coloque um pedaço de papel gráfico no chão dos corredores. Em seguida, pegue o rato pela cauda e deixe-o segurar o pincel, impregnado em azul de metileno. Coloque-o na entrada do corredor para fazê-lo andar dentro da caixa.Remova o papel gráfico do piso dos corredores e repita os testes até obter uma boa impressão representativa de ambas as pré-previs. A partir das impressões obtidas, selecione uma com uma boa impressão de sucessivas patas dianteiras e meça os seguintes parâmetros. Comprimento de impressão, difusão de dedo, difusão intermediária do dedo e fator de postura.Por fim, meça a distância entre o segundo dedo de duas impressões sucessivas, o Comprimento do Passo. Para realizar a Avaliação Termográfica, coloque um pedaço de cola lateral dupla na esponja. Coloque o rato sobre ele e cole as previs como mostrado.Espere um minuto para dissipar a troca de calor de manusear as patas do rato. Pegue a câmera em um ângulo de 90 graus e aproximadamente 30 centímetros de distância dos ratos. Faça duas aquisições.Primeiro, um termograma de corpo inteiro, então, aproximando a câmera da parte superior do corpo do rato, faça o segundo. A partir do termograma obtido, encontramos uma região de interesse correspondente à área palmar das previsões. Meça os valores médios, mínimos e máximos de temperatura dessa área em ambas as patas e calcule as diferenças de temperatura.Para realizar a seguinte avaliação, exponha o nervo mediano de ambos os lados como explicado anteriormente. Comece colocando o rato de costas e coloque o eletrodo apenas mostrado na pele. Os eletrodos do solo na coxa do rato e os eletrodos de estimulação e gravação, no membro superior esquerdo.Coloque um eletrodo de gravação, na barriga muscular de sublimis de dígito Flexor, e os eletrodos de estimulação, aproximadamente no nervo mediano. Inicie a aquisição com uma amplitude de estímulo de 10 milivolts e aumente-a gradualmente, em 10 passos milivolt até atingir dois volts. Durante a aquisição, registre a amplitude de estímulo para a primeira flexão visível dos dedos.Esse é o limiar de estimulação motora. A amplitude mínima de estímulo, necessária para obter um potencial de ação muscular composta, C.M.A.P.is um limiar de estimulação neurológica. Por fim, selecione um representante C.M.A.P, em resposta a um estímulo Supramaximal e meça os seguintes parâmetros, Latência, Amplitude e Duração.Para realizar a Avaliação de Força de Flexão, primeiro passe um loop de sutura de cinco ou seis de seda através da área palmar de cada previu e deixe-o com cinco centímetros de comprimento. Posicione o rato nas costas. Comece com a forepaw esquerda, enganchar a linha de sutura no gancho do dinamômetro e alinhe a forepaw com o dinamômetro, sem colocar muita tensão no gancho.Segure os eletrodos estimulantes, aproximadamente no nervo mediano. Ajuste a amplitude de estímulo para 1,5 volts e grave força instantânea por 30 segundos. A partir do lote obtido, analise os valores máximos, mínimos e médios de força e a área sob a curva.O flexor carpi radialis, que é inervatado pelo nervo mediano, é removido bilateralmente e pesado em uma balança de precisão. Em relação a alguns Resultados Representativos, no teste de Apreensão, a porcentagem de ratos com uma resposta positiva, é maior no grupo Sham e aumenta gradualmente ao longo do tempo, em ratos do grupo Enxerto Nervoso. Os resultados dos testes de Pin Prick são mais elevados, no grupo Sham em comparação com os dos grupos Graft ou Excision.A velocidade do rato no teste de corrida de escadas é mais alta no grupo Sham, do que o rato submetido à lesão do laboratório medial. Entre os mais leves, o tempo para correr a escada, tende a diminuir com o tempo, comparando a recuperação mediana do nervo. Analogamente ao que é observado no teste de Corrida de Escada, o tempo que os ratos levam para subir a corda, é inferior no grupo Sham, em comparação com os grupos em que o nervo mediano é ferido.A velocidade do rato, neste teste, aumenta nos ratos, nos quais um nervo mediano pode se recuperar. Como mostrado nestes gráficos de barras, a análise de ratos ambulantes, tende a mostrar mudanças na morfologia das impressões das patas. Essas alterações são muitas vezes mais pronunciadas, em lesões esmagadoras do que em lesões nervosas segmentais.Este gráfico mostra que a termografia parece ser uma ferramenta útil para procurar diferenças de temperatura, entre as previs nos primeiros 30 dias após a cirurgia. Essas diferenças de temperatura são mais perceptíveis, em ratos com o nervo mediano mais gravemente ferido, como naqueles do grupo Excision. A força de flexão do rato está diretamente correlacionada, com o grau de recuperação do nervo.Estar mais próximo do normal quando a recuperação é máxima, como pode ser visto nestes gráficos de barras comparando a força, em ambas as patas em Excisão e nos grupos de Enxerto Nervoso. Quanto à Eletroneurografia, vários padrões podem ser observados. Um potencial normal de C.M.A.P., é típico de um rato do grupo Sham.Enquanto a C.M.A.P.is polifásica associada, com um grau variável de lesão do nervo mediano, como acontece no esmagamento e nos grupos de Enxerto Nervoso. No grupo Excision, não há C.M.A.P.A., a onda e a morfologia dos radiais flexor carpi dependem da recuperação do nervo mediano. Estas duas imagens mostram esses músculos nos grupos Sham e Excision.Como mostrado neste artigo, o nervo mediano do rato é um modelo conveniente de lesão e reparação do nervo periférico. Várias estratégias padronizadas estão disponíveis para avaliar a recuperação motora e sensorial. Muitas delas não são invasivas, permitindo avaliação diária.Por fim, as configurações experimentais de fisioterapia podem simular a recuperação no contexto clínico, facilitando a estipulação de resultados para a espécie humana.

Research

JoVE Journal

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