Name: labeling of blood vessels in the teleost brain and pituitary using cardiac perfusion with a dii-fixative
Uploaded: 2019-06-13T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative at JoVE.com

Vi takker Dr. Shinji Kanda for demonstration af kardiel perfusion med fikativ opløsning i medaka, Lourdes Carreon G Tan for hjælp med medaka-opdræt og Anthony Peltier til illustrationer. Dette arbejde blev finansieret af NMBU og af Forskningsrådet i Norge, tilskud nummer 248828 (Digital Life Norge program).

Al håndtering af dyr blev udført i overensstemmelse med anbefalingerne vedrørende omsorg og velfærd for forsknings dyrene ved det norske Universitet for biovidenskab og under opsyn af autoriserede efterforskere.
1. forberedelse af instrumenter og løsninger
<ol><li>Forbered DiI stamopløsning opløse 5 mg af DiI krystal i 1,5 mL plastrør med 1 mL af 96% EtOH. Vortex for 30 s og holde dækket ved hjælp af aluminiumsfolie. Bemærk: Den DiI stamopløsning kan bevares i...

<ol>
	<li>Nishida, N., Yano, H., Nishida, T., Kamura, T., Kojiro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+cancer.">Angiogenesis in cancer.</a> Vascular Health and Risk Management. 2 (3), 213-219 (2006).</li><li>Simon, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+morphogenesis+and+the+formation+of+vascular+networks.">Vascular morphogenesis and the formation of vascular networks.</a> Developmental Cell. 6 (4), 479-482 (2004).</li><li>Magistretti, P. J., Zigmond, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Brain energy metabolism in Fundamental neuroscience. , 389-413 (1999).</li><li>Weltzien, F. A., Andersson, E., Andersen, O., Shalchian-Tabrizi, K., Norberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+brain-pituitary-gonad+axis+in+male+teleosts,+with+special+emphasis+on+flatfish+(Pleuronectiformes).">The brain-pituitary-gonad axis in male teleosts, with special emphasis on flatfish (Pleuronectiformes).</a> Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Molecular &amp; Integrative Physiology. 137 (3), 447-477 (2004).</li><li>Ooi, G. T., Tawadros, N., Escalona, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+cell+lines+and+their+endocrine+applications.">Pituitary cell lines and their endocrine applications.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 228 (1-2), 1-21 (2004).</li><li>Knigge, K. M., Scott, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+median+eminence.">Structure and function of the median eminence.</a> American Journal of Anatomy. 129 (2), 223-243 (1970).</li><li>Ball, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothalamic+control+of+the+pars+distalis+in+fishes,+amphibians,+and+reptiles.">Hypothalamic control of the pars distalis in fishes, amphibians, and reptiles.</a> General Comparative Endocrinology. 44 (2), 135-170 (1981).</li><li>Knowles, F., Vollrath, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+contacts+between+neurosecretory+fibres+and+pituicytes+in+the+pituitary+of+the+eel.">Synaptic contacts between neurosecretory fibres and pituicytes in the pituitary of the eel.</a> Nature. 206 (4989), 1168 (1965).</li><li>Knowles, F., Vollrath, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosecretory+innervation+of+the+pituitary+of+the+eels+Anguilla+and+Conger+I.+The+structure+and+ultrastructure+of+the+neuro-intermediate+lobe+under+normal+and+experimental+conditions.">Neurosecretory innervation of the pituitary of the eels Anguilla and Conger I. The structure and ultrastructure of the neuro-intermediate lobe under normal and experimental conditions.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 250 (768), 311-327 (1966).</li><li>Golan, M., Zelinger, E., Zohar, Y., Levavi-Sivan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+GnRH-Gonadotrope-Vasculature+Reveals+a+Dual+Mode+of+Gonadotropin+Regulation+in+Fish.">Architecture of GnRH-Gonadotrope-Vasculature Reveals a Dual Mode of Gonadotropin Regulation in Fish.</a> Endocrinology. 156 (11), 4163-4173 (2015).</li><li>Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vascular+anatomy+of+the+developing+zebrafish:+an+atlas+of+embryonic+and+early+larval+development.">The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development.</a> Developmental Biology. 230 (2), 278-301 (2001).</li><li>Cha, Y. R., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+experimental+analysis+of+blood+vessel+formation+using+transgenic+zebrafish.">Visualization and experimental analysis of blood vessel formation using transgenic zebrafish.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 81 (4), 286-296 (2007).</li><li>Kamei, M., Isogai, S., Pan, W., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+blood+vessels+in+the+zebrafish.">Imaging blood vessels in the zebrafish.</a> Methods Cell Biology. 100, 27-54 (2010).</li><li>Wu, E. S., Jacobson, K., Papahadjopoulos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+Diffusion+in+Phospholipid+Multibilayers+Measured+by+Fluorescence+Recovery+after+Photobleaching.">Lateral Diffusion in Phospholipid Multibilayers Measured by Fluorescence Recovery after Photobleaching.</a> Biochemistry. 16 (17), 3936-3941 (1977).</li><li>Schlessinger, J., Axelrod, D., Koppel, D. E., Webb, W. W., Elson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+Transport+of+a+Lipid+Probe+and+Labeled+Proteins+on+a+Cell-Membrane.">Lateral Transport of a Lipid Probe and Labeled Proteins on a Cell-Membrane.</a> Science. 195 (4275), 307-309 (1977).</li><li>Johnson, M., Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+Diffusion+in+Plasma-Membrane+of+Mouse+Egg+Is+Restricted+after+Fertilization.">Lateral Diffusion in Plasma-Membrane of Mouse Egg Is Restricted after Fertilization.</a> Nature. 272 (5652), 448-450 (1978).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbocyanine+Dye+Orientation+in+Red-Cell+Membrane+Studied+by+Microscopic+Fluorescence+Polarization.">Carbocyanine Dye Orientation in Red-Cell Membrane Studied by Microscopic Fluorescence Polarization.</a> Biophysical Journal. 26 (3), 557-573 (1979).</li><li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Carbocyanine+Dyes+Allow+Living+Neurons+of+Identified+Origin+to+Be+Studied+in+Long-Term+Cultures.">Fluorescent Carbocyanine Dyes Allow Living Neurons of Identified Origin to Be Studied in Long-Term Cultures.</a> Journal of Cell Biology. 103 (1), 171-187 (1986).</li><li>Godement, P., Vanselow, J., Thanos, S., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+in+developing+visual+systems+with+a+new+method+of+staining+neurones+and+their+processes+in+fixed+tissue.">A study in developing visual systems with a new method of staining neurones and their processes in fixed tissue.</a> Development. 101 (4), 697-713 (1987).</li><li>Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde+Fixation.">Formaldehyde Fixation.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).</li><li>Puchtler, H., Meloan, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Chemistry+of+Formaldehyde+Fixation+and+Its+Effects+on+Immunohistochemical+Reactions.">On the Chemistry of Formaldehyde Fixation and Its Effects on Immunohistochemical Reactions.</a> Histochemistry. 82 (3), 201-204 (1985).</li><li>Hoetelmans, R. W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+acetone,+methanol,+or+paraformaldehyde+on+cellular+structure,+visualized+by+reflection+contrast+microscopy+and+transmission+and+scanning+electron+microscopy.">Effects of acetone, methanol, or paraformaldehyde on cellular structure, visualized by reflection contrast microscopy and transmission and scanning electron microscopy.</a> Applied Immunohistochemistry &amp; Molecular Morphology. 9 (4), 346-351 (2001).</li><li>Hobro, A. J., Smith, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+fixation+methods:+Spatial+and+compositional+cellular+changes+observed+by+Raman+imaging.">An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging.</a> Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).</li><li>Li, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+labeling+and+visualization+of+blood+vessels+with+lipophilic+carbocyanine+dye+DiI.">Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI.</a> Nature Protocols. 3 (11), 1703-1708 (2008).</li><li>Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medaka--a+model+organism+from+the+far+East.">Medaka--a model organism from the far East.</a> Nature Review Genetic. 3 (1), 53-64 (2002).</li><li>Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Healthy+Brain-pituitary+Slices+for+Electrophysiological+Investigations+of+Pituitary+Cells+in+Teleost+Fish.">Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish.</a> Journal of Visual Experiments. (138), 57790 (2018).</li><li>Ager-Wick, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+a+High-quality+Primary+Cell+Culture+from+Fish+Pituitaries.">Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries.</a> Journal of Visual Experiments. (138), 58159 (2018).</li><li>Hildahl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+tracing+of+luteinizing+hormone+beta-subunit+gene+expression+using+green+fluorescent+protein+transgenic+medaka+(Oryzias+latipes)+reveals+a+putative+novel+developmental+function.">Developmental tracing of luteinizing hormone beta-subunit gene expression using green fluorescent protein transgenic medaka (Oryzias latipes) reveals a putative novel developmental function.</a> Developmental Dynamics. 241 (11), 1665-1677 (2012).</li><li>Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-level+3D+visualization+API+for+Java+and+ImageJ.">A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ.</a> BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).</li><li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dil+and+diO:+versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing.">Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends Neurosciences. 12 (9), 333-335 (1989).</li><li>Fontaine, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+Neurons+Controlling+Anterior+Pituitary+Functions:+Anatomy+and+Ontogenesis+in+Zebrafish.">Dopaminergic Neurons Controlling Anterior Pituitary Functions: Anatomy and Ontogenesis in Zebrafish.</a> Endocrinology. 156 (8), 2934-2948 (2015).</li></ol>

Hjerte perfusion med DiI tidligere har været brugt til at mærke blodkar i flere model arter24, herunder teleost fisk13.
Som DiI er direkte leveret til endotel cellemembranen ved perfusion i Vaskulaturen, er det muligt at øge signal-til-støj forholdet ved at øge DiI koncentrationen i fiksativ løsning. Derudover giver fluorophore intens farvning, når den er spændt med minimal blegning, hvilket giver relativt langvarig emission<su...

Blodkarrene spiller en væsentlig rolle i hvirveldyr, da de giver de nødvendige næringsstoffer, ilt og hormonelle signaler til alle organer. Også, da opdagelsen af deres involvering i kræft udvikling1, har de fået megen opmærksomhed i klinisk forskning. Selv om en række publikationer har undersøgt de mekanismer, der tillader blodkar vækst og morfogenese, og et stort antal gener er vigtige for deres dannelse er blevet identificeret2, en masse mangler at blive forstået med hensyn til samspillet mellem celler eller væv og cirkulerende blod.
Visualisering af blod vaskulatur i hjernen og hypofysen er vigtig. Neuroner i hjernen kræver en høj tilførsel af ilt og glucose3, og hypofysen indeholder op til otte vigtige hormon-producerende celletyper, der bruger blodgennemstrømningen til at modtage signal fra hjernen og sende deres respektive hormoner til forskellige perifert organ4,5. Mens der i pattedyr, portalsystemet i bunden af hypothalamus navngivet median eminence, forbinder hjernen og hypofysen6, sådan en klar blod bro er ikke blevet beskrevet i teleost fisk. Faktisk, i teleosts, preoptico-hypothalamus neuroner direkte projekt deres axoner i pars nervosa af hypofysen7 og for det meste innerverer de forskellige endokrine celletyper direkte8,9. Men, nogle af disse neuroner har deres nerveender placeret i det ekstravaskulære rum, i umiddelbar nærhed af blod kapillærer10. Derfor er forskellen mellem teleost fisk og pattedyr ikke så klar, og forholdet mellem blod Vaskulaturen og hjernen og hypofyse celler kræver større undersøgelse i teleost fisk.
Zebrafish har i mange henseender et anatomisk og funktionelt sammenligneligt vaskulære system til andre hvirveldyr arter11. Det er blevet en kraftfuld hvirveldyr model for kardiovaskulær forskning mest takket være udviklingen af flere transgene linjer, hvor komponenterne i det vaskulære system er mærket med fluorescerende reporter proteiner12. Men, nøjagtige kredsløbssygdomme anatomi kan variere mellem arter, eller endda mellem to individer, der tilhører den samme art. Derfor, visualisering af blodkar kan være af stor interesse også i andre teleost arter, som gensplejsning værktøjer ikke eksisterer.
Flere teknikker er blevet beskrevet for at mærke blodkarrene i både pattedyr og teleoster. Disse omfatter in situ-hybridisering for vaskulatur-specifikke gener, alkalisk fosfatasefarvning, mikroangiografi og farve indsprøjtninger (til en gennemgang Se13). Fluorescerende lipofile kationiske indocarbocyanine Dye (DiI) blev først brugt til at studere membran lipider lateral mobilitet, da det er bevaret i lipid dobbeltlag og kan migrere gennem det14,15,16. Faktisk et molekyle af DiI er sammensat af to kulbrinte kæder og chromophores. Mens kulbrinte kæderne integreres i lipid-bilags cellemembranen i cellerne i kontakt med den, forbliver chromophorerne på dens overflade17. Når i membranen, DiI molekyler diffuse sideværts inden for lipid tolags som hjælper til at plette membran strukturer, der ikke er i direkte kontakt med den DiI løsning. Indsprøjtning en DiI opløsning gennem hjerte perfusion, vil derfor mærke alle endotel celler i kontakt med den sammensatte, der tillader direkte mærkning af blodkarrene. I dag DiI bruges også til andre farvning formål, såsom enkelt molekyle billeddannelse, skæbne kortlægning, og neuronal sporing. Interessant, flere fluorophores eksisterer (med forskellige bølgelængder af emission) tillader kombinationen med andre fluorescerende etiketter, og inkorporering samt den laterale diffusion af DiI kan forekomme i både levende og faste væv18, 19. det er
Formaldehyd, som blev opdaget af Ferdinand Blum i 1893, har været anvendt bredt i dag som det foretrukne kemikalie til vævs fiksering20,21. Det viser bred specificitet for de fleste cellulære mål og bevarer cellulære struktur22,23. Det bevarer også de fluorescerende egenskaber af de fleste fluorophores, og dermed kan anvendes til fikse transgene dyr, for hvilke målrettede celler udtrykke fluorescerende reporter proteiner.
I dette manuskript er en tidligere protokol udviklet til at mærke blodkarrene i små eksperimentelle pattedyrs modeller24 er blevet tilpasset til brug i fisk. Hele proceduren tager kun et par timer at udføre. Det viser, hvordan man kan perfuse en fikativ opløsning af formaldehyd, der indeholder DiI i fiskens hjerte for direkte at mærke alle blodkar i hjernen og hypofysen af modellen fisk medaka. Medaka er en lille ferskvandsfisk indfødte til Asien, primært findes i Japan. Det er en forskning model organisme med en række molekylære og genetiske værktøjer til rådighed25. Derfor, identifikation af blodkar i denne art samt i andre vil gøre det muligt at forbedre vores forståelse af, hvordan hjernen og hypofyse celler interagerer med blod vaskulatur i hele væv eller tykke væv skiver.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:877px;" width="877">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">16% paraformaldehyde</td>
			<td style="width:171px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:123px;">RT 15711</td>
			<td style="width:152px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">5 mL Syringe PP/PE without needle</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">Z116866-100EA</td>
			<td style="width:152px;">syringes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:432px;">BD Precisionglide syringe needles</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">Z118044-100EA</td>
			<td style="width:152px;">needles 18G (1.20*40)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">borosilicate glass 10cm OD1.2mm</td>
			<td style="width:171px;">sutter instrument</td>
			<td style="width:123px;">BF120-94-10</td>
			<td style="width:152px;">glass pipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">DiI (1,1&#8242;-Dioctadecyl-3,3,3&#8242;,3&#8242;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)</td>
			<td style="width:171px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">D-282</td>
			<td style="width:152px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:432px;">LDPE tube O.D 1.7mm and I.D 1.1mm</td>
			<td style="width:171px;">Portex</td>
			<td style="width:123px;">800/110/340/100</td>
			<td style="width:152px;">canula</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">Phosphate Buffer Saline (PBS) solution</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">D8537-6X500ML</td>
			<td style="width:152px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">pipette puller</td>
			<td style="width:171px;">Narishige</td>
			<td style="width:123px;">PC-10</td>
			<td style="width:152px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">plastic petri dishes</td>
			<td style="width:171px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">391-0442</td>
			<td style="width:152px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">Super glue gel</td>
			<td style="width:171px;">loctite</td>
			<td style="width:123px;">c4356</td>
			<td style="width:152px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">tricaine (ms-222)</td>
			<td style="width:171px;">sigma</td>
			<td style="width:123px;">E10521-50G</td>
			<td style="width:152px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

labeling of blood vessels in the teleost brain and pituitary using cardiac perfusion with a dii-fixative

Blodkar innerverer alle væv i hvirveldyr, så deres overlevelse ved at give de nødvendige næringsstoffer, ilt, og hormonelle signaler. Det er et af de første organer til at begynde at fungere under udvikling. Mekanismer af blodkar dannelse er blevet et emne af høj videnskabelig og klinisk interesse. Hos voksne er det imidlertid vanskeligt at visualisere Vaskulaturen i de fleste levende dyr på grund af deres lokalisering dybt inde i andre væv. Ikke desto mindre, visualisering af blodkar er stadig vigtigt for flere undersøgelser såsom endokrinologi og Neurobiologi. Mens flere transgene linjer er blevet udviklet i zebrafish, med blodkar direkte visualiseret gennem udtryk af fluorescerende proteiner, findes der ikke sådanne værktøjer til andre teleost arter. Ved hjælp af medaka (oryzias latipes) som model, den nuværende protokol præsenterer en hurtig og direkte teknik til at mærke blodkar i hjernen og hypofysen ved perfusing gennem hjertet med fiksativ indeholder DiI. Denne protokol giver mulighed for forbedring af vores forståelse af, hvordan hjernen og hypofyse celler interagerer med blod vaskulatur i hele væv eller tykke vævs skiver.

Denne protokol viser en trinvis procedure til at mærke blodkar i medaka hjernen og hypofysen, og samtidig fastsætte væv. Efter mærkning ved hjerte injektion af en fikserende opløsning, der indeholder DiI i hjertet, kan blodkarrene observeres på skiver ved hjælp af et fluorescerende stereo mikroskopi (figur 4) eller på hele væv ved hjælp af et confokalt mikroskop (figur 5). Enten på den tykke vævs skive eller på hele vævet, kan arkitekturen i blod V...

Watch this Scientific Journal Video about Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative at JoVE.com

Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative

Artiklen beskriver en hurtig protokol til mærkning blodkar i en teleost fisk ved hjerte perfusion af DiI fortyndet i fikseringsmiddel, ved hjælp af medaka (Oryzias latipes) som model og med fokus på hjernen og hypofyse væv.

Mærkning af blodkar i Teleost hjernen og hypofysen ved hjælp af kardiel perfusion med en DiI-fixative

Blood vessels innervate all tissues in vertebrates, enabling their survival by providing the necessary nutrients, oxygen, and hormonal signals. It is one ...

Det overordnede mål med denne procedure er at mærke blodkarrene i hjernen og hypofysen af teleost fisk, og vi bruger hjerteperfusion med et fiksativ, der indeholder DiI i modellen arter medaka. Så denne teknik, som er enkel og effektiv vil bidrage til at besvare vigtige spørgsmål vedrørende den vaskulære anatomi i hjernen og hypofysen af teleost fisk samt forholdet mellem neuroner eller endokrine celler og blodkar. Nogle fordele ved denne teknik omfatter en hurtig og nem enkel forberedelse, og dens tilpasningsevne til teleost fiskearter.For at forberede en fisk indehaveren, skære et stykke polystyren til en fem centimeter længde, en tre centimeter bredde, og en to centimeter tykkelse, og lim polystyren til en ni centimeter diameter plastskål. Brug derefter en skalpel til at lave en tre centimeter båd formet hul i polystyren. For at forberede perfusion system, tilsæt en 30 til 50 centimeter lang plastik kanyle i enden af perfusion systemnålen.For at forberede fem centimeter glas pipetter, bruge en pipette puller til at strække de enkelte glas kapillærer i henhold til producentens anvisninger. Før dissektionen påbegyndes, skal der ilægges en 10 milliliterssprøjte med den forberedte DiI-fiksative opløsning, og der sættes en kanyle med en kanyle i sprøjtens ende. Brug derefter flere stykker tape placeret i forskellige retninger for at fastgøre sprøjten til bænken, og juster mikroskopets og sædets position for at opnå en god position til dissektion og til at trykke på sprøjtestempelet med albuen.Dernæst placere en aflivet fisk i fiskeholderen maven side op og sikre hoved og hale med stifter. Brug saks til vandret skære det overfladiske lag af huden for at åbne den forreste mave, og bruge hændel til at fjerne huden over hjertet, indtil en klar adgang til hjertekammer og bulbus arteriosus er opnået. Tilsæt et glasrør i enden af kapillæren og bryde spidsen af pipetten.Bring glasrøret tæt på hjertekammer og tilsæt albuetryk til sprøjtestemplet for at tvinge væsken ud, mens du fastgør hjertekammer med pipetten. Derefter straks perforere sinus venosus med scef til at frigive blodet fra cirkulation. Fra ventrikel, justere vinklen på glaspipette til at finde indgangen til bulbus arteriosus, og flytte pipette åbning inde i bulbus arteriosus.Derefter tilsættes tryk på sprøjten i yderligere 30 til 60 sekunder, mens pipetten opbevares inde i bulbus arteriosus. For optimal mærkning af alle blodkar er det afgørende at gennemgå i bulbus arteriosus længe nok til at erstatte alt blodet med DiI-fiksativ opløsning. Efter ca 60 sekunder af perfusion, når der ikke er mere blodlækage er observeret, fjerne glas pipette og nåle fra fisken, og høste hjernen og hypofysen i frisk 4% paraformaldehyd i to timer ved stuetemperatur i mørke.Skyl derefter vævet to gange i frisk PBS i 10 minutter pr. vask, før prøverne forberedes til billeddannelse. Efter hjerteinjektion af en fiksativ opløsning, der indeholder DiI som påvist, kan de mærkede blodkar observeres på vævsskiver ved fluorescerende stereomikroskopi eller på hele væv ved konfokal mikroskopi. Bemærk, at hvis opløsningen injiceres i hjerteflektriclen i stedet for pæren arterie, eller hvis opløsningen injiceres med for lavt tryk og/eller for kort tid, vil der blive observeret en utilstrækkelig mærkning af beholderne.Når du billeder det samme væv med de samme billeddannelsesparametre, kan der desuden observeres et fald i mærkningsintensiteten efter flere dage, og signalet vises mere spredt ud i vævsprøven. Vævsskiver fra transgene linjer, inden for hvilke de celler af interesse udtrykke fluorescerende reporter proteiner kan yderligere mærkes for specifikke proteiner af interesse ved hjælp af standard immunofluorescens protokoller tillader undersøgelse af interaktioner mellem blodkar og andre celletyper. Det er vigtigt at nå bulbus arteriosus.Når dette er opnået, tilføje pres på sprøjten stemplet bør fremkalde en udvidelse af bulbus bekræfter en vellykket procedure. Denne teknik kan bruges til at undersøge samspillet mellem endokrine celler og blodkar i teleost hypofysen i almindelighed, men måske mere specifikt til at undersøge mulige forskelle eller ligheder mellem portalen systemer i teleost og pattedyr. Fordi denne politiske brug giftige og flygtige forbindelser forholdsregler såsom at bruge en gasmaske og en ventileret rum bør altid tages, når de udfører disse procedurer.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Anatomical Reconstructions of the Human Cardiac Venous System using Contrast-computed Tomography of Perfusion-fixed Specimens

Anatomiske rekonstruktioner af Human Cardiac Venøs System ved hjælp Kontrast-computertomografi af Perfusion-faste Prøver

A detailed  understanding of the complexity and relative variability within the human  cardiac venous system is crucial for the development of cardiac ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Forbedret metode til forberedelse af en menneskelig celle-baseret, Contact Model af blod-hjerne barrieren

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

Generation og podning af væv-manipuleret Fartøjer i en musemodel

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

In vivo kvantitativ vurdering af Myokardie Struktur, funktion, Perfusion og levedygtighed Brug Cardiac Micro-computertomografi

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Protokol for mikroRNA overførsel i knoglemarv-afledte hæmatopoietisk stamceller til at aktivere celle Engineering kombineret med magnetisk målretning

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier

Lucifer Yellow-en robust Paracellulær permeabilitet markør i en celle model af humant blod-hjerne barrieren

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of ...

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

Intra-hjerte side-fyring lys kateter til overvågning cellulære metabolisme ved hjælp af Transmural absorbans spektroskopi af Perfamale pattedyr hjerter

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Præklinisk hjerteelektrofysiologivurdering ved dobbelt spænding og calciumoptisk kortlægning af humane organotypiske hjerteskiver

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

Blood Flow Imaging with Ultrafast Doppler

Blodgennemstrømning Imaging med Ultrafast Doppler

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler ...

Stepwise Cell Seeding on Tessellated Scaffolds to Study Sprouting Blood Vessels

Trinvis celle såning på Tessellated stilladser til undersøgelse spirende blodkar

The cardiovascular system is a key player in human physiology, providing nourishment to most tissues in the body; vessels are present in different sizes, ...