Name: labeling of blood vessels in the teleost brain and pituitary using cardiac perfusion with a dii-fixative
Uploaded: 2019-06-13T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative at JoVE.com

אנו מודים לד ר שינג קאנדה להדגמה של מיזוג לב עם פתרון מתואם במיאקה, גברת לאורדז קארב ג'י טאן לקבלת עזרה בנוגע לטיפול בצדקה, ומר אנתוני פלטייר לאיורים. עבודה זו ממומנת על ידי NMBU ועל ידי מועצת המחקר של נורבגיה, גרנט מספר 248828 (התוכנית הדיגיטלית נורווגיה).

כל הטיפול בבעלי חיים התבצע על פי המלצות הטיפול והרווחה של בעלי חיים מחקריים באוניברסיטה הנורבגית למדעי החיים, ותחת פיקוחו של חוקרים מוסמכים.
1. הכנת המכשירים והפתרונות
<ol><li>להכין פתרון מלאי DiI המסת 5 מ"ג של קריסטל DiI ב 1.5 mL שפופרת פלסטיק עם 1 מ ל של 96% אטוח. מערבולת עבור 30 ולהמשיך...

<ol>
	<li>Nishida, N., Yano, H., Nishida, T., Kamura, T., Kojiro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+cancer.">Angiogenesis in cancer.</a> Vascular Health and Risk Management. 2 (3), 213-219 (2006).</li><li>Simon, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+morphogenesis+and+the+formation+of+vascular+networks.">Vascular morphogenesis and the formation of vascular networks.</a> Developmental Cell. 6 (4), 479-482 (2004).</li><li>Magistretti, P. J., Zigmond, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Brain energy metabolism in Fundamental neuroscience. , 389-413 (1999).</li><li>Weltzien, F. A., Andersson, E., Andersen, O., Shalchian-Tabrizi, K., Norberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+brain-pituitary-gonad+axis+in+male+teleosts,+with+special+emphasis+on+flatfish+(Pleuronectiformes).">The brain-pituitary-gonad axis in male teleosts, with special emphasis on flatfish (Pleuronectiformes).</a> Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Molecular &amp; Integrative Physiology. 137 (3), 447-477 (2004).</li><li>Ooi, G. T., Tawadros, N., Escalona, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+cell+lines+and+their+endocrine+applications.">Pituitary cell lines and their endocrine applications.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 228 (1-2), 1-21 (2004).</li><li>Knigge, K. M., Scott, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+median+eminence.">Structure and function of the median eminence.</a> American Journal of Anatomy. 129 (2), 223-243 (1970).</li><li>Ball, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothalamic+control+of+the+pars+distalis+in+fishes,+amphibians,+and+reptiles.">Hypothalamic control of the pars distalis in fishes, amphibians, and reptiles.</a> General Comparative Endocrinology. 44 (2), 135-170 (1981).</li><li>Knowles, F., Vollrath, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+contacts+between+neurosecretory+fibres+and+pituicytes+in+the+pituitary+of+the+eel.">Synaptic contacts between neurosecretory fibres and pituicytes in the pituitary of the eel.</a> Nature. 206 (4989), 1168 (1965).</li><li>Knowles, F., Vollrath, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosecretory+innervation+of+the+pituitary+of+the+eels+Anguilla+and+Conger+I.+The+structure+and+ultrastructure+of+the+neuro-intermediate+lobe+under+normal+and+experimental+conditions.">Neurosecretory innervation of the pituitary of the eels Anguilla and Conger I. The structure and ultrastructure of the neuro-intermediate lobe under normal and experimental conditions.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 250 (768), 311-327 (1966).</li><li>Golan, M., Zelinger, E., Zohar, Y., Levavi-Sivan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+GnRH-Gonadotrope-Vasculature+Reveals+a+Dual+Mode+of+Gonadotropin+Regulation+in+Fish.">Architecture of GnRH-Gonadotrope-Vasculature Reveals a Dual Mode of Gonadotropin Regulation in Fish.</a> Endocrinology. 156 (11), 4163-4173 (2015).</li><li>Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vascular+anatomy+of+the+developing+zebrafish:+an+atlas+of+embryonic+and+early+larval+development.">The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development.</a> Developmental Biology. 230 (2), 278-301 (2001).</li><li>Cha, Y. R., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+experimental+analysis+of+blood+vessel+formation+using+transgenic+zebrafish.">Visualization and experimental analysis of blood vessel formation using transgenic zebrafish.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 81 (4), 286-296 (2007).</li><li>Kamei, M., Isogai, S., Pan, W., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+blood+vessels+in+the+zebrafish.">Imaging blood vessels in the zebrafish.</a> Methods Cell Biology. 100, 27-54 (2010).</li><li>Wu, E. S., Jacobson, K., Papahadjopoulos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+Diffusion+in+Phospholipid+Multibilayers+Measured+by+Fluorescence+Recovery+after+Photobleaching.">Lateral Diffusion in Phospholipid Multibilayers Measured by Fluorescence Recovery after Photobleaching.</a> Biochemistry. 16 (17), 3936-3941 (1977).</li><li>Schlessinger, J., Axelrod, D., Koppel, D. E., Webb, W. W., Elson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+Transport+of+a+Lipid+Probe+and+Labeled+Proteins+on+a+Cell-Membrane.">Lateral Transport of a Lipid Probe and Labeled Proteins on a Cell-Membrane.</a> Science. 195 (4275), 307-309 (1977).</li><li>Johnson, M., Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+Diffusion+in+Plasma-Membrane+of+Mouse+Egg+Is+Restricted+after+Fertilization.">Lateral Diffusion in Plasma-Membrane of Mouse Egg Is Restricted after Fertilization.</a> Nature. 272 (5652), 448-450 (1978).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbocyanine+Dye+Orientation+in+Red-Cell+Membrane+Studied+by+Microscopic+Fluorescence+Polarization.">Carbocyanine Dye Orientation in Red-Cell Membrane Studied by Microscopic Fluorescence Polarization.</a> Biophysical Journal. 26 (3), 557-573 (1979).</li><li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Carbocyanine+Dyes+Allow+Living+Neurons+of+Identified+Origin+to+Be+Studied+in+Long-Term+Cultures.">Fluorescent Carbocyanine Dyes Allow Living Neurons of Identified Origin to Be Studied in Long-Term Cultures.</a> Journal of Cell Biology. 103 (1), 171-187 (1986).</li><li>Godement, P., Vanselow, J., Thanos, S., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+in+developing+visual+systems+with+a+new+method+of+staining+neurones+and+their+processes+in+fixed+tissue.">A study in developing visual systems with a new method of staining neurones and their processes in fixed tissue.</a> Development. 101 (4), 697-713 (1987).</li><li>Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde+Fixation.">Formaldehyde Fixation.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).</li><li>Puchtler, H., Meloan, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Chemistry+of+Formaldehyde+Fixation+and+Its+Effects+on+Immunohistochemical+Reactions.">On the Chemistry of Formaldehyde Fixation and Its Effects on Immunohistochemical Reactions.</a> Histochemistry. 82 (3), 201-204 (1985).</li><li>Hoetelmans, R. W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+acetone,+methanol,+or+paraformaldehyde+on+cellular+structure,+visualized+by+reflection+contrast+microscopy+and+transmission+and+scanning+electron+microscopy.">Effects of acetone, methanol, or paraformaldehyde on cellular structure, visualized by reflection contrast microscopy and transmission and scanning electron microscopy.</a> Applied Immunohistochemistry &amp; Molecular Morphology. 9 (4), 346-351 (2001).</li><li>Hobro, A. J., Smith, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+fixation+methods:+Spatial+and+compositional+cellular+changes+observed+by+Raman+imaging.">An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging.</a> Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).</li><li>Li, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+labeling+and+visualization+of+blood+vessels+with+lipophilic+carbocyanine+dye+DiI.">Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI.</a> Nature Protocols. 3 (11), 1703-1708 (2008).</li><li>Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medaka--a+model+organism+from+the+far+East.">Medaka--a model organism from the far East.</a> Nature Review Genetic. 3 (1), 53-64 (2002).</li><li>Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Healthy+Brain-pituitary+Slices+for+Electrophysiological+Investigations+of+Pituitary+Cells+in+Teleost+Fish.">Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish.</a> Journal of Visual Experiments. (138), 57790 (2018).</li><li>Ager-Wick, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+a+High-quality+Primary+Cell+Culture+from+Fish+Pituitaries.">Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries.</a> Journal of Visual Experiments. (138), 58159 (2018).</li><li>Hildahl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+tracing+of+luteinizing+hormone+beta-subunit+gene+expression+using+green+fluorescent+protein+transgenic+medaka+(Oryzias+latipes)+reveals+a+putative+novel+developmental+function.">Developmental tracing of luteinizing hormone beta-subunit gene expression using green fluorescent protein transgenic medaka (Oryzias latipes) reveals a putative novel developmental function.</a> Developmental Dynamics. 241 (11), 1665-1677 (2012).</li><li>Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-level+3D+visualization+API+for+Java+and+ImageJ.">A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ.</a> BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).</li><li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dil+and+diO:+versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing.">Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends Neurosciences. 12 (9), 333-335 (1989).</li><li>Fontaine, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+Neurons+Controlling+Anterior+Pituitary+Functions:+Anatomy+and+Ontogenesis+in+Zebrafish.">Dopaminergic Neurons Controlling Anterior Pituitary Functions: Anatomy and Ontogenesis in Zebrafish.</a> Endocrinology. 156 (8), 2934-2948 (2015).</li></ol>

הפרזיה לב עם DiI בעבר השתמשו כדי לתייג כלי דם במספר מיני דגם24, כולל teleost דגים13.
כפי dii מועברת ישירות קרום התא אנדותל על ידי זלוף ב vasculature ניתן להגדיל את היחס אות אל הרעש על ידי הגברת ריכוז dii בפתרון הקבע. בנוסף, fluorophore מספק מכתים אינטנסיבי כאשר מתרג?...

כלי הדם משחקים חלק חיוני של הגוף בעלי החוליות כפי שהם מספקים את החומרים המזינים הדרושים, חמצן ואותות הורמונליים לכל האיברים. גם, מאז התגלית של המעורבות שלהם בפיתוח סרטן1, הם קיבלו הרבה תשומת לב במחקר קליני. למרות שמספר פרסומים חקרו את המנגנונים המאפשרים צמיחה של כלי דם ומורפולגנזה, ומספר רב של גנים חשובים להיווצרות שלהם זוהו2, הרבה נשאר להבין בקשר לאינטראקציה בין תאים או רקמות לדם מחזורי.
, ויזואליזציה של דם ובלוטת יותרת המוח. זה חשוב נוירונים במוח דורשים אספקת גבוהה של חמצן וגלוקוז3, ואת בלוטת ההיפופיזה מכיל עד שמונה סוגי תאים חשובים הורמון מייצר המשתמשות זרימת הדם כדי לקבל אות מהמוח ולשלוח הורמונים שלהם שונים איברים היקפיים4,5. בעוד ביונקים, מערכת הפורטל בבסיס של ההיפותלמוס בשם הוד רוממותו, מקשרת את המוח ואת בלוטת ההיפופיזה6, כגון גשר דם ברור לא תוארה ב teleost דגים. אכן, ב teleosts, preoptico-הנוירונים היפוטתלמי ישירות פרויקט אקסונים שלהם לתוך pars נרבוזה של בלוטת יותרת7 ובעיקר innervate סוגי תאים האנדוקרינית שונים ישירות8,9. עם זאת, כמה נוירונים אלה יש קצות העצבים שלהם ממוקם בחלל extravascular, בקרבת מקום נימים בדם10. לכן, ההבדל בין הדגים teleost ויונקים הוא לא כל כך ברור, ואת הקשר בין הדם ובדיקת המוח ואת התאים בלוטת ההיפופיזה דורש חקירה גדולה יותר של הדגים teleost.
Zebrafish יש, בהיבטים רבים, מערכת כלי דם המקבילה מבחינה אנטומית ופונקציונלית למינים אחרים בעלי חוליות11. זה הפך למודל בעלי חוליות רב עוצמה עבור מחקר לב וכלי דם בעיקר בזכות הפיתוח של קווים טרנסגניים מספר שבו מרכיבים של מערכת כלי הדם מסומנים עם חלבונים כתבת פלורסנט12. עם זאת, אנטומיה מדויקת של מערכת הדם עשויה להשתנות בין מינים, או אפילו בין שני אנשים השייכים לאותו מינים. לכן, הדמיה של כלי הדם עשויה להיות בעלת עניין רב גם במינים אחרים של teleost שבהם כלים טרנסגנזה אינם קיימים.
מספר טכניקות תוארו לתייג כלי דם בשני היונקים והטלאוסטים. אלה כוללים היברידיזציה באתרו עבור גנים ספציפיים ואסילטורה, כתמים הזרחן אלקליין, microangiography, וזריקות צבע (עבור סקירה ראה13). ליפולי פלורסנט indocarbocyanine צבען (dii) השתמשו לראשונה כדי ללמוד ממברנה לאורך ניידות לרוחב כפי שהוא נשמר bilayers ליפיד והוא יכול להעביר דרך זה14,15,16. ואכן, מולקולה של DiI מורכבת משתי שרשראות פחמנים וכרומואופהורס. בעוד שרשראות פחממים לשלב את קרום התא bilayer השומנים של התאים במגע עם זה, ראשון להישאר על פני השטח שלה17. פעם אחת בקרום, מולקולות DiI לפזר בתוך השומנים bilayer שעוזר להכתים מבנים ממברנה כי הם לא במגע ישיר עם פתרון DiI. הזרקת פתרון DiI דרך הפרזיה לב, ולכן מתייג את כל תאי האנדותל במגע עם התרכובת המאפשרת תיוג ישיר של כלי הדם. היום DiI משמש גם למטרות כתמים אחרים, כגון הדמיה מולקולה אחת, מיפוי הגורל, ומעקב עצבי. מעניין, מספר fluorophores קיים (עם אורכי גל שונים של פליטה) המאפשר את השילוב עם תוויות פלורסנט אחרות, ואת התאגדות, כמו גם את הדיפוזיה לרוחב של DiI יכול להתרחש הן לחיות וקבוע רקמות18, . בן 19
פורמלדהיד, התגלה על ידי פרדיננד בלום ב-1893, שימש באופן נרחב ליום הנוכחי ככימיקל המועדף לקיבוע רקמות20,21. הוא מראה ספציפיות למרבית היעדים הסלולאריים ומשמר את המבנה התאי22,23. הוא גם שומר על תכונות פלורסנט של רוב fluorophores, ובכך ניתן להשתמש כדי לקבוע בעלי חיים טרנסגניים שבהם תאים ממוקדות לבטא העיתונאי פלורסנט חלבונים.
בכתב יד זה, פרוטוקול קודם שפותח כדי לתייג כלי דם בדגמי יונקים קטנים וניסיוניים24 הותאם לשימוש בדגים. ההליך כולו לוקח רק כמה שעות לבצע. זה מדגים כיצד לעשות פתרון קבע של פורמלדהיד המכיל dii בלב הדג כדי לתייג ישירות את כל כלי הדם במוח ואת בלוטת ההיפופיזה של הדג המודל הצדקה. מאקה הוא דג מים מתוקים קטן יליד אסיה, שנמצא בעיקר ביפן. זה אורגניזם מודל מחקר עם חבילה של כלים מולקולריים וגנטיים זמינים25. לכן, זיהוי כלי הדם במין זה כמו גם באחרים יאפשר לשפר את ההבנה שלנו על איך המוח ואת התאים בבלוטת ההיפופיזה אינטראקציה עם דם ובלוטת הדם ברקמה שלמה או פרוסות רקמה עבה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:877px;" width="877">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">16% paraformaldehyde</td>
			<td style="width:171px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:123px;">RT 15711</td>
			<td style="width:152px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">5 mL Syringe PP/PE without needle</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">Z116866-100EA</td>
			<td style="width:152px;">syringes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:432px;">BD Precisionglide syringe needles</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">Z118044-100EA</td>
			<td style="width:152px;">needles 18G (1.20*40)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">borosilicate glass 10cm OD1.2mm</td>
			<td style="width:171px;">sutter instrument</td>
			<td style="width:123px;">BF120-94-10</td>
			<td style="width:152px;">glass pipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">DiI (1,1&#8242;-Dioctadecyl-3,3,3&#8242;,3&#8242;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)</td>
			<td style="width:171px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">D-282</td>
			<td style="width:152px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:432px;">LDPE tube O.D 1.7mm and I.D 1.1mm</td>
			<td style="width:171px;">Portex</td>
			<td style="width:123px;">800/110/340/100</td>
			<td style="width:152px;">canula</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">Phosphate Buffer Saline (PBS) solution</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">D8537-6X500ML</td>
			<td style="width:152px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">pipette puller</td>
			<td style="width:171px;">Narishige</td>
			<td style="width:123px;">PC-10</td>
			<td style="width:152px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">plastic petri dishes</td>
			<td style="width:171px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">391-0442</td>
			<td style="width:152px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">Super glue gel</td>
			<td style="width:171px;">loctite</td>
			<td style="width:123px;">c4356</td>
			<td style="width:152px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">tricaine (ms-222)</td>
			<td style="width:171px;">sigma</td>
			<td style="width:123px;">E10521-50G</td>
			<td style="width:152px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

labeling of blood vessels in the teleost brain and pituitary using cardiac perfusion with a dii-fixative

כלי הדם מinnervate את כל הרקמות בחוליות, ומאפשרים את הישרדותה על ידי מתן החומרים המזינים, החמצן והאותות ההורמונליים הנחוצים. זהו אחד האיברים הראשונים להתחיל לתפקד במהלך הפיתוח. מנגנונים של היווצרות כלי הדם הפכו להיות נושא של עניין מדעי וקליני גבוה. אצל מבוגרים עם זאת, קשה לדמיין את היום ברוב חיות החיים בשל הלוקליזציה שלהם עמוק בתוך רקמות אחרות. עם זאת, הדמיה של כלי הדם ממשיכה להיות חשובה למספר מחקרים כגון אנדוקרינולוגיה ונוירוביולוגיה. בעוד כמה קווים טרנסגניים פותחו ב zebrafish, עם כלי הדם לדמיין ישירות דרך הביטוי של חלבונים פלורסנט, אין כלים כאלה קיימים עבור מינים teleost אחרים. הפרוטוקול הנוכחי מציג טכניקה מהירה וישירה כדי לתייג כלי דם במוח ובבלוטת יותרת, באמצעות השימוש בשיטת "הצדקה" (Oryzias) כמודל. פרוטוקול זה מאפשר שיפור של ההבנה שלנו על איך בתאי המוח ובלוטת ההיפופיזה לקיים אינטראקציה עם דם ובללטורה ברקמה שלמה או פרוסות רקמה עבה.

פרוטוקול זה מדגים הליך צעד אחר צעד כדי לתייג את כלי הדם במוח מאקה ובלוטת היותרת, ובאותו זמן לתקן את הרקמה. לאחר תיוג על ידי הזרקה לב של פתרון קבע המכיל dii ללב, כלי הדם ניתן לצפות על פרוסות באמצעות stereomicroscope פלורסנט (איור 4) או על רקמות שלמות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית וקד (<strong ...

Watch this Scientific Journal Video about Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative at JoVE.com

Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative

המאמר מתאר פרוטוקול מהיר לתיוג כלי דם בדגים teleost על ידי זלוף הלב של dii מדולל בתיקונים, באמצעות מסדר (oryziasלטיפס) כמודל והתמקדות במוח ובבלוטת יותרת השומן.

הוספת תוויות של כלי דם במוח Teleost ואת בלוטת היותרת שימוש בפרזיה לב עם DiI-fixative

Blood vessels innervate all tissues in vertebrates, enabling their survival by providing the necessary nutrients, oxygen, and hormonal signals. It is one ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לתייג את כלי הדם במוח ובמוח של דגי טלוסט, ואנחנו משתמשים בזיבול לב עם תיקון המכיל DiI בזן המודל מדאקה. אז טכניקה זו היא פשוטה ויעילה תסייע לענות על שאלות חשובות לגבי האנטומיה של כלי הדם במוח ובמוח של דגי טלוסט, כמו גם את הקשר בין נוירונים או תאים אנדוקריניים וכלי דם. כמה יתרונות של טכניקה זו כוללים הכנה מהירה ופשוטה, ואת הסתגלותה למין הדגים טלוסט.כדי להכין מחזיק דגים, חותכים חתיכת פוליסטירן לאורך של חמישה סנטימטרים, רוחב של שלושה סנטימטרים ועובי של שני סנטימטרים, ולהדביק את הפוליסטירן לצלחת פלסטיק בקוטר תשעה סנטימטרים. ואז להשתמש באזמל כדי להפוך את סירה שלושה סנטימטר בצורת חור בפוליסטירן. כדי להכין את מערכת חליטה, להוסיף 30 עד 50 ס"מ צינורית פלסטיק ארוכה בגפיים של מחט מערכת חיסון.כדי להכין חמש פיפטים זכוכית סנטימטר, להשתמש מושך פיפטה למתוח נימי זכוכית בודדים על פי הוראות היצרן. לפני תחילת הניתוח, לטעון מזרק 10 מיליליטר עם הפתרון מוכן DiI-fixative ולהמקם מחט עם cannula בגפיים של המזרק. לאחר מכן השתמש בכמה חתיכות של סרט הדבקה להציב אוריינטציות שונות כדי לתקן את המזרק לספסל, ולהתאים את המיקום של המיקרוסקופ ואת המושב כדי לקבל עמדה טובה עבור ניתוח עבור לחיצה על בוכנה מזרק עם המרפק.לאחר מכן, מניחים דג המתת סנפיר בצד הבטן של מחזיק הדגים ומאבטחים את הראש והזנב עם סיכות. השתמש במספריים כדי לחתוך אופקית את השכבה השטחית של העור כדי לפתוח את הבטן הפנימית, ולהשתמש במקלפים כדי להסיר את העור מעל הלב עד גישה ברורה החדר ואת העורקים בולבוס מושגת. מוסיפים צינור זכוכית בקצה נימי ולשבור את קצה פיפטה.להביא את צינור הזכוכית קרוב החדר ולהוסיף לחץ מרפק לבוכנה מזרק כדי לאלץ את הנוזל החוצה תוך הצמדת החדר הלב עם פיפטה. ואז מיד לחטא את הסינוס ונוסוס עם מטלאים כדי לשחרר את הדם מהמחזור. מן החדר, להתאים את הזווית של פיפטה זכוכית כדי לאתר את הכניסה של טרטרוסוס בולבוס, ולהזיז את פתח פיפטה בתוך העורקים bulbus.לאחר מכן להוסיף לחץ על המזרק במשך 30 עד 60 שניות נוספות תוך שמירה על פיפטה בתוך העורקים bulbus. עבור תיוג אופטימלי של כל כלי הדם זה קריטי כדי לתפוש לתוך העורקים בולבוס מספיק זמן כדי להחליף את כל הדם עם פתרון DiI-fixative. לאחר כ -60 שניות של זלוף, כאשר לא נצפתה עוד דליפת דם, הסר את פיפטה הזכוכית והמחטים מהדגים, וקצר את המוח ואת בלוטת יותרת המוח לתוך טרי 4% paraformaldehyde במשך שעתיים בטמפרטורת החדר בחושך.לאחר מכן לשטוף את הרקמות פעמיים PBS טרי במשך 10 דקות לכל לשטוף לפני הכנת הדגימות להדמיה. לאחר הזרקת לב של פתרון קיבוע המכיל DiI כפי שהודגם, כלי הדם המסומנים ניתן לראות על פרוסות רקמות על ידי מיקרוסקופיה סטריאו פלואורסצנטי או על רקמות שלמות על ידי מיקרוסקופיה קונפוקאלית. שים לב שאם הפתרון מוזרק בחדר הלב במקום טרקי העורקים בולבוס או אם הפתרון מוזרק עם נמוך מדי של לחץ ו / או לתקופה קצרה מדי, תיוג לקוי של כלי הדם יצפה.בנוסף, כאשר מדמיינים את אותה רקמה עם אותם פרמטרי הדמיה, ניתן לראות ירידה בעוצמת התיוג לאחר מספר ימים, כאשר האות מופיע מתפשט יותר בתוך דגימת הרקמה. פרוסות רקמה מקווים מהוססים שבתוכם התאים בעלי העניין מבטאים חלבוני כתב פלואורסצנטיים יכולים להיות מסומנים עוד יותר עבור חלבונים ספציפיים של עניין באמצעות פרוטוקולי immunofluorescence סטנדרטיים המאפשרים חקירה של אינטראקציות בין כלי דם וסוגי תאים אחרים. חשוב להגיע לתרקוס בולבוס.כאשר זה מושגת, הוספת לחץ לבוכנה מזרק צריך לגרום הרחבה של בולבוס המאשר הליך מוצלח. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לחקור את האינטראקציה בין תאים אנדוקריניים וכלי דם בלוטת יותרת המוח טלוסט בכלל, אבל אולי באופן ספציפי יותר כדי לחקור הבדלים אפשריים או קווי דמיון בין מערכות הפורטל בטלוסט ויונקים. מכיוון ששימוש פוליטי זה תרכובות רעילות ונדיפות אמצעי זהירות כגון שימוש במסכת גז וחדר מאוורר תמיד יש לנקוט בעת ביצוע הליכים אלה.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Anatomical Reconstructions of the Human Cardiac Venous System using Contrast-computed Tomography of Perfusion-fixed Specimens

שחזורים אנטומיים של מערכת ורידי לב האנושית באמצעות ניגודיות, טומוגרפיה ממוחשבת של דגימות זלוף-קבועות

A detailed  understanding of the complexity and relative variability within the human  cardiac venous system is crucial for the development of cardiac ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

שיפר שיטה להכנה מבוססת תאים, דגם מגע אנושי של מחסום דם המוח

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

דור והארכת כלי רקמות מהונדסות במודל עכבר

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

In vivo כמותי הערכת מבנה שריר הלב, תפקוד, זלוף ואת הכדאיות שימוש טומוגרפיה לב מיקרו שחושב

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

פרוטוקול להעברת MicroRNA לתוך למבוגרים הנגזרות מח עצם Hematopoietic תאי גזע כדי לאפשר הנדסה תא בשילוב עם מיקוד מגנטי

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier

לוציפר צהוב-מרקר חזק הקרנף מסמן במודל תא של מכשול הדם האנושי-מוח

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of ...

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

מהצד הפנים-לב-אש קטטר אור עבור ניטור מטבוליזם הסלולר באמצעות בליעה בספיגת העבר של הלבבות המגברים

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

מיפוי אופטי של הערכת החשמל לניתוחי לב באמצעות מתח כפול וסידן

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

Blood Flow Imaging with Ultrafast Doppler

הדמיית זרימת דם עם דופלר אולטרה מהיר

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler ...

Stepwise Cell Seeding on Tessellated Scaffolds to Study Sprouting Blood Vessels

זריעת תאים Stepwise על פיגומים Tessellated ללמוד כלי דם מונבטים

The cardiovascular system is a key player in human physiology, providing nourishment to most tissues in the body; vessels are present in different sizes, ...