Name: labeling of blood vessels in the teleost brain and pituitary using cardiac perfusion with a dii-fixative
Uploaded: 2019-06-13T14:45:00
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Ringraziamo Dr Shinji Kanda per la dimostrazione di perfusione cardiaca con soluzione fissativa in Medaka, Sig. ra Lourdes Carreon G Tan per l'aiuto con l'allevamento di Medaka, e il signor Anthony Peltier per le illustrazioni. Questo lavoro è stato finanziato da NMBU e dal Consiglio di ricerca della Norvegia, Grant Number 248828 (programma Digital Life Norway).

Tutta la manipolazione degli animali è stata eseguita secondo le raccomandazioni per la cura e il benessere degli animali di ricerca presso l'Università norvegese di Scienze della vita, e sotto la supervisione di investigatori autorizzati.
1. preparazione di strumenti e soluzioni
<ol><li>Preparare la soluzione di stock DiI dissolvendo 5 mg di cristallo DiI in 1,5 mL di tubo di plastica con 1 mL di 96% EtOH. Vortex per 30 s e tenere coperto con foglio di alluminio. Nota:...

<ol>
	<li>Nishida, N., Yano, H., Nishida, T., Kamura, T., Kojiro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+cancer.">Angiogenesis in cancer.</a> Vascular Health and Risk Management. 2 (3), 213-219 (2006).</li><li>Simon, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+morphogenesis+and+the+formation+of+vascular+networks.">Vascular morphogenesis and the formation of vascular networks.</a> Developmental Cell. 6 (4), 479-482 (2004).</li><li>Magistretti, P. J., Zigmond, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Brain energy metabolism in Fundamental neuroscience. , 389-413 (1999).</li><li>Weltzien, F. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+blood+vessels+in+the+zebrafish.">Imaging blood vessels in the zebrafish.</a> Methods Cell Biology. 100, 27-54 (2010).</li><li>Wu, E. S., Jacobson, K., Papahadjopoulos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+Diffusion+in+Phospholipid+Multibilayers+Measured+by+Fluorescence+Recovery+after+Photobleaching.">Lateral Diffusion in Phospholipid Multibilayers Measured by Fluorescence Recovery after Photobleaching.</a> Biochemistry. 16 (17), 3936-3941 (1977).</li><li>Schlessinger, J., Axelrod, D., Koppel, D. E., Webb, W. W., Elson, E. 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G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dil+and+diO:+versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing.">Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends Neurosciences. 12 (9), 333-335 (1989).</li><li>Fontaine, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+Neurons+Controlling+Anterior+Pituitary+Functions:+Anatomy+and+Ontogenesis+in+Zebrafish.">Dopaminergic Neurons Controlling Anterior Pituitary Functions: Anatomy and Ontogenesis in Zebrafish.</a> Endocrinology. 156 (8), 2934-2948 (2015).</li></ol>

La perfusione cardiaca con DiI in precedenza è stata utilizzata per etichettare i vasi sanguigni in diverse specie di modello24, tra cui il pesce teleostico13.
Come DiI è direttamente consegnato alla membrana cellulare endoteliale per perfusione nella vasculatura, è possibile aumentare il rapporto segnale-rumore aumentando la concentrazione DiI nella soluzione fissativa. Inoltre, il fluoroforo fornisce una colorazione intensa quando...

I vasi sanguigni giocano una parte essenziale del corpo dei vertebrati in quanto forniscono i nutrienti necessari, ossigeno e segnali ormonali a tutti gli organi. Inoltre, dal momento che la scoperta del loro coinvolgimento nello sviluppo del cancro1, hanno ricevuto molta attenzione nella ricerca clinica. Sebbene alcune pubblicazioni abbiano indagato sui meccanismi che consentono la crescita e la morfogenesi dei vasi sanguigni, e un gran numero di geni importanti per la loro formazione sono stati identificati2, molto resta da intendere per quanto riguarda l'interazione tra cellule o tessuti e il sangue circolante.
La visualizzazione della vasculatura del sangue nel cervello e nell'ipofisi è importante. I neuroni nel cervello richiedono un elevato apporto di ossigeno e glucosio3, e l'ipofisi contiene fino a otto importanti tipi di cellule che producono ormoni che utilizzano il flusso sanguigno per ricevere il segnale dal cervello e inviare i loro rispettivi ormoni a diversi organi periferici4,5. Mentre nei mammiferi, il sistema del portale alla base dell'ipotalamo chiamato l'eminenza mediana, collega il cervello e l'ipofisi6, tale ponte sanguigno chiaro non è stato descritto nel pesce teleostico. Infatti, nei teleosts, i neuroni preoptico-ipotalamici proiettano direttamente i loro assoni nel Pars nervosa dell'ipofisi7 e per lo più innervano i diversi tipi di cellule endocrine direttamente8,9. Tuttavia, alcuni di questi neuroni hanno le loro terminazioni nervose situate nello spazio extravascolare, in prossimità di capillari sanguigni10. Pertanto, la differenza tra il pesce teleostico e i mammiferi non è così chiara, e la relazione tra la vasculatura del sangue e le cellule del cervello e dell'ipofisi richiede una maggiore indagine nel pesce teleostico.
Il zebrafish ha, in molti aspetti, un sistema vascolare anatomicamente e funzionalmente paragonabile ad altre specie di vertebrati11. È diventato un potente modello di vertebrato per la ricerca cardiovascolare principalmente grazie allo sviluppo di diverse linee transgeniche dove i componenti del sistema vascolare sono etichettati con proteine reporter fluorescenti12. Tuttavia, l'anatomia esatta del sistema circolatorio può variare tra le specie, o anche tra due individui appartenenti alla stessa specie. Pertanto, la visualizzazione dei vasi sanguigni può essere di grande interesse anche in altre specie teleostico per le quali non esistono strumenti di transgenesi.
Diverse tecniche sono state descritte per etichettare i vasi sanguigni in entrambi i mammiferi e teleosts. Questi includono l'ibridazione in situ per i geni specifici della vasculatura, la colorazione della fosfatasi alcalina, la microangiografia e le iniezioni di colorante (per una recensione vedere13). Fluorescente lipofilico cationico indocarbocyanine Dye (dii) è stato utilizzato per la prima volta per studiare la mobilità laterale dei lipidi della membrana come viene mantenuto nei bilayer del lipido e può migrare attraverso di essa14,15,16. Infatti, una molecola di DiI è composta da due catene di idrocarburi e croofori. Mentre le catene di idrocarburi si integrano nella membrana a cellule a doppio strato lipidico delle cellule a contatto con esso, i croofori rimangono sulla sua superficie17. Una volta nella membrana, le molecole DiI diffondono lateralmente all'interno del doppio strato lipidico che aiuta a macchiare le strutture della membrana che non sono a diretto contatto con la soluzione DiI. Iniettare una soluzione DiI attraverso la perfusione cardiaca, quindi etichetterà tutte le cellule endoteliali a contatto con il composto permettendo l'etichettatura diretta dei vasi sanguigni. Oggi DiI è utilizzato anche per altri scopi di colorazione, come la singola molecola di imaging, la mappatura del destino, e traccia neuronale. È interessante notare che esistono diversi fluorofori (con diverse lunghezze d'onda di emissione) che consentono la combinazione con altre etichette fluorescenti, e l'incorporazione così come la diffusione laterale di DiI possono verificarsi in entrambi i tessuti dal vivo e fissi18, 19. la
La formaldeide, scoperta da Ferdinand Blum nel 1893, è stata utilizzata ampiamente fino ad oggi come la sostanza chimica preferita per la fissazione dei tessuti20,21. Mostra un'ampia specificità per la maggior parte degli obiettivi cellulari e conserva la struttura cellulare22,23. Conserva anche le proprietà fluorescenti della maggior parte dei fluorofori, e quindi può essere utilizzato per fissare gli animali transgenici per i quali le cellule bersaglio esprimono proteine reporter fluorescenti.
In questo manoscritto, un precedente protocollo sviluppato per etichettare i vasi sanguigni nei piccoli modelli sperimentali di mammiferi24 è stato adattato all'uso nei pesci. L'intera procedura richiede solo un paio di ore per eseguire. Esso dimostra come profumi una soluzione fissativa di formaldeide contenente dii nel cuore del pesce al fine di etichettare direttamente tutti i vasi sanguigni nel cervello e l'ipofisi del modello di pesce Medaka. Medaka è un piccolo pesce d'acqua dolce originario dell'Asia, che si trova principalmente in Giappone. Si tratta di un organismo modello di ricerca con una suite di strumenti molecolari e genetici disponibili25. Pertanto, l'identificazione dei vasi sanguigni in questa specie così come in altri permetterà di migliorare la nostra comprensione su come il cervello e le cellule ipofisi interagiscono con la vasculatura del sangue in tessuto intero o fette di tessuto spesso.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:877px;" width="877">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">16% paraformaldehyde</td>
			<td style="width:171px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:123px;">RT 15711</td>
			<td style="width:152px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">5 mL Syringe PP/PE without needle</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">Z116866-100EA</td>
			<td style="width:152px;">syringes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:432px;">BD Precisionglide syringe needles</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">Z118044-100EA</td>
			<td style="width:152px;">needles 18G (1.20*40)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">borosilicate glass 10cm OD1.2mm</td>
			<td style="width:171px;">sutter instrument</td>
			<td style="width:123px;">BF120-94-10</td>
			<td style="width:152px;">glass pipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">DiI (1,1&#8242;-Dioctadecyl-3,3,3&#8242;,3&#8242;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)</td>
			<td style="width:171px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">D-282</td>
			<td style="width:152px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:432px;">LDPE tube O.D 1.7mm and I.D 1.1mm</td>
			<td style="width:171px;">Portex</td>
			<td style="width:123px;">800/110/340/100</td>
			<td style="width:152px;">canula</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">Phosphate Buffer Saline (PBS) solution</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">D8537-6X500ML</td>
			<td style="width:152px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">pipette puller</td>
			<td style="width:171px;">Narishige</td>
			<td style="width:123px;">PC-10</td>
			<td style="width:152px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">plastic petri dishes</td>
			<td style="width:171px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">391-0442</td>
			<td style="width:152px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">Super glue gel</td>
			<td style="width:171px;">loctite</td>
			<td style="width:123px;">c4356</td>
			<td style="width:152px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">tricaine (ms-222)</td>
			<td style="width:171px;">sigma</td>
			<td style="width:123px;">E10521-50G</td>
			<td style="width:152px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

labeling of blood vessels in the teleost brain and pituitary using cardiac perfusion with a dii-fixative

I vasi sanguigni innervano tutti i tessuti nei vertebrati, permettendo la loro sopravvivenza fornendo i nutrienti necessari, ossigeno, e segnali ormonali. È uno dei primi organi ad iniziare a funzionare durante lo sviluppo. I meccanismi di formazione dei vasi sanguigni sono diventati un argomento di alto interesse scientifico e clinico. Negli adulti, tuttavia, è difficile visualizzare la vascolarizzazione nella maggior parte degli animali viventi a causa della loro localizzazione in profondità all'interno di altri tessuti. Tuttavia, la visualizzazione dei vasi sanguigni rimane importante per diversi studi come l'endocrinologia e la neurobiologia. Mentre diverse linee transgeniche sono state sviluppate nel pesce zebra, con i vasi sanguigni visualizzati direttamente attraverso l'espressione delle proteine fluorescenti, non esistono strumenti simili per altre specie di teleostico. Utilizzando Medaka (Oryzias latipes) come modello, il protocollo attuale presenta una tecnica rapida e diretta per etichettare i vasi sanguigni nel cervello e nell'ipofisi che irrora attraverso il cuore con fissativo contenente dii. Questo protocollo consente di migliorare la nostra comprensione su come le cellule cerebrali e ipofisi interagiscono con la vasculatura del sangue in tessuto intero o fette di tessuto spesso.

Questo protocollo dimostra una procedura passo per passo per etichettare i vasi sanguigni nel cervello Medaka e ipofisi, e allo stesso tempo fissare il tessuto. Dopo l'etichettatura mediante iniezione cardiaca di una soluzione fissativa contenente DiI nel cuore, i vasi sanguigni possono essere osservati su fette utilizzando uno stereomicroscopio fluorescente (Figura 4) o su tessuto intero utilizzando un microscopio confocale (Figura 5). Sia sulla fetta di tessut...

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Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative

L'articolo descrive un protocollo rapido per l'etichettatura dei vasi sanguigni in un pesce teleostico da perfusione cardiaca di DiI diluito in fissativo, utilizzando Medaka (Oryzias latipes) come modello e concentrandosi sul tessuto del cervello e dell'ipofisi.

Etichettatura dei vasi sanguigni nel cervello teleost e pituitario utilizzando la perfusione cardiaca con un DiI-fissativo

Blood vessels innervate all tissues in vertebrates, enabling their survival by providing the necessary nutrients, oxygen, and hormonal signals. It is one ...

L'obiettivo generale di questa procedura è etichettare i vasi sanguigni nel cervello e l'ipofisi dei pesci teleost, e usiamo la perfusione cardiaca con un fissatore contenente DiI nella specie modello medaka. Quindi questa tecnica che è semplice ed efficiente aiuterà a rispondere a importanti domande riguardanti l'anatomia vascolare nel cervello e l'ipofisi del pesce teleost, così come la relazione tra neuroni o cellule endocrine e vasi sanguigni. Alcuni vantaggi di questa tecnica includono una preparazione semplice e veloce e la sua adattabilità alle specie ittiche teleost.Per preparare un supporto per pesci, tagliare un pezzo di polistirolo a una lunghezza di cinque centimetri, una larghezza di tre centimetri e uno spessore di due centimetri e incollare il polistirolo a un piatto di plastica di nove centimetri di diametro. Quindi usa un bisturi per fare un buco a forma di barca di tre centimetri nel polistirolo. Per preparare il sistema di perfusione, aggiungere una cannula di plastica lunga da 30 a 50 centimetri all'estremità dell'ago del sistema di perfusione.Per preparare pipette di vetro di cinque centimetri, utilizzare un estrattore di pipetta per allungare i singoli capillari di vetro secondo le istruzioni del produttore. Prima di iniziare la dissezione, caricare una siringa da 10 millilitri con la soluzione dii-fissativa preparata e posizionare un ago con una cannula all'estremità della siringa. Quindi utilizzare diversi pezzi di nastro posizionati in diversi orientamenti per fissare la siringa al banco e regolare la posizione del microscopio e del sedile per ottenere una buona posizione per la dissezione e per premere il pistone della siringa con il gomito.Quindi, posizionare un pesce eutanasiato nell'addome del detentore del pesce lato verso l'alto e fissare la testa e la coda con i perni. Utilizzare le forbici per tagliare orizzontalmente lo strato superficiale della pelle per aprire l'addome anteriore e utilizzare le flessori per rimuovere la pelle sopra il cuore fino a ottenere un chiaro accesso al ventricolo e al bulbo arterioso. Aggiungere un tubo di vetro all'estremità del capillare e rompere la punta della pipetta.Portare il tubo di vetro vicino al ventricolo e aggiungere la pressione del gomito al pistone della siringa per forzare il liquido mentre si fissa il ventricolo cardiaco con la pipetta. Quindi perforare immediatamente il seno velenoso con le forcep per rilasciare il sangue dalla circolazione. Dal ventricolo, regolare l'angolo della pipetta di vetro per localizzare l'ingresso del bulbus arteriosus e spostare l'apertura della pipetta all'interno del bulbus arteriosus.Quindi aggiungere pressione alla siringa per altri 30-60 secondi mantenendo la pipetta all'interno del bulbo arterioso. Per un'etichettatura ottimale di tutti i vasi sanguigni è fondamentale perfondere nel bulbo arterioso abbastanza a lungo da sostituire tutto il sangue con la soluzione dii-fissante. Dopo circa 60 secondi di perfusione, quando non si osservano più perdite di sangue, rimuovere la pipetta di vetro e gli aghi dal pesce e raccogliere il cervello e l'ipofisi in paraformaldeide fresca al 4% per due ore a temperatura ambiente al buio.Quindi risciacquare i tessuti due volte in PBS fresco per 10 minuti per lavaggio prima di preparare i campioni per l'imaging. Dopo l'iniezione cardiaca di una soluzione fissativa contenente DiI come dimostrato, i vasi sanguigni etichettati possono essere osservati su fette di tessuto mediante microscopia stereo fluorescente o su tutto il tessuto mediante microscopia confocale. Si noti che se la soluzione viene iniettata nel ventricolo cardiaco al posto del bulbus arteriosus o se la soluzione viene iniettata con una pressione troppo bassa e /o per un periodo troppo breve, si osserverà un'etichettatura inadeguata dei vasi.Inoltre, quando si imaging lo stesso tessuto con gli stessi parametri di imaging, si può osservare una diminuzione dell'intensità di etichettatura dopo diversi giorni, con il segnale che appare più diffuso all'interno del campione di tessuto. Le fette di tessuto provenienti da linee transgeniche all'interno delle quali le cellule di interesse esprimono proteine fluorescenti reporter possono essere ulteriormente etichettate per proteine specifiche di interesse utilizzando protocolli standard di immunofluorescenza che consentono lo studio delle interazioni tra i vasi sanguigni e altri tipi di cellule. È importante raggiungere il bulbus arteriosus.Quando ciò viene ottenuto, l'aggiunta di pressione al pistone della siringa dovrebbe indurre un'espansione del bulbo confermando una procedura riuscita. Questa tecnica può essere utilizzata per indagare l'interazione tra cellule endocrine e vasi sanguigni nell'ipofisi del teleost in generale, ma forse più specificamente per indagare possibili differenze o somiglianze tra i sistemi portale nel teleost e nei mammiferi. Poiché questo uso politico ha precauzioni di composti tossici e volatili come l'uso di una maschera antigas e di una stanza ventilata, dovrebbe sempre essere preso quando si eseguono queste procedure.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Anatomical Reconstructions of the Human Cardiac Venous System using Contrast-computed Tomography of Perfusion-fixed Specimens

Ricostruzioni anatomiche del sistema umano venoso cardiaco utilizzando Contrasto-tomografia computerizzata di campioni di perfusione-fissi

A detailed  understanding of the complexity and relative variability within the human  cardiac venous system is crucial for the development of cardiac ...

Ricerca

Bioingegneria

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Migliorata metodo per la preparazione di un cell-based, Contact modello umano della barriera sanguigna del cervello

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

Generazione e innesto delle navi tissutale in un modello di topo

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

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In Vivo quantitativa valutazione della struttura del miocardio, la funzione, la perfusione e sostenibilità Utilizzando cardiaca micro-tomografia computerizzata

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Protocollo per il trasferimento di MicroRNA in adulto cellule staminali emopoietiche derivate da midollo osseo per abilitare ingegneria cellulare combinata con il Targeting magnetico

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

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Lucifero Giallo - Un Robusto Indicatore di Permeabilità Paracellulare in un Modello Cellulare della Barriera Sangue-Cervello Umano

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Catetere leggero intra-cardiaco per il monitoraggio del metabolismo cellulare utilizzando la spettroscopia transmurale di riambente di cuori mammiferi perfusi

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Valutazione elettrofisiologia cardiaca preclinica mediante mappatura ottica a doppia tensione e calcio delle fette cardiache di organitypica umana

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