Name: labeling of blood vessels in the teleost brain and pituitary using cardiac perfusion with a dii-fixative
Uploaded: 2019-06-13T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative at JoVE.com

Vi takker Dr Shinji Kanda for demonstrasjon av hjerte-og bindemiddel løsning i medaka, Ms Lourdes Warcislaw G Tan for hjelp med medaka husdyrhold, og Mr Anthony Peltier for illustrasjoner. Dette arbeidet ble finansiert av NMBU og av Norges forskningsråd, stipend nummer 248828 (Digital Life Norway-programmet).

Alle dyr håndtering ble utført i henhold til anbefalingene for omsorg og velferd for forsknings dyr ved Norges universitet for biovitenskap, og under tilsyn av autoriserte etterforskere.
1. utarbeidelse av instrumenter og løsninger
<ol><li>Forbered DiI lagerløsning oppløsning 5 mg DiI krystall i 1,5 mL plastrør med 1 mL 96% EtOH. Vortex for 30 s og holde dekket med aluminiumsfolie. Merk: DiI lagerløsning kan bevares i mørket ved-20 ° c i flere måneder.</li>
	<li...

<ol>
	<li>Nishida, N., Yano, H., Nishida, T., Kamura, T., Kojiro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+cancer.">Angiogenesis in cancer.</a> Vascular Health and Risk Management. 2 (3), 213-219 (2006).</li><li>Simon, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+morphogenesis+and+the+formation+of+vascular+networks.">Vascular morphogenesis and the formation of vascular networks.</a> Developmental Cell. 6 (4), 479-482 (2004).</li><li>Magistretti, P. J., Zigmond, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Brain energy metabolism in Fundamental neuroscience. , 389-413 (1999).</li><li>Weltzien, F. A., Andersson, E., Andersen, O., Shalchian-Tabrizi, K., Norberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+brain-pituitary-gonad+axis+in+male+teleosts,+with+special+emphasis+on+flatfish+(Pleuronectiformes).">The brain-pituitary-gonad axis in male teleosts, with special emphasis on flatfish (Pleuronectiformes).</a> Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Molecular &amp; Integrative Physiology. 137 (3), 447-477 (2004).</li><li>Ooi, G. T., Tawadros, N., Escalona, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+cell+lines+and+their+endocrine+applications.">Pituitary cell lines and their endocrine applications.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 228 (1-2), 1-21 (2004).</li><li>Knigge, K. M., Scott, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+median+eminence.">Structure and function of the median eminence.</a> American Journal of Anatomy. 129 (2), 223-243 (1970).</li><li>Ball, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothalamic+control+of+the+pars+distalis+in+fishes,+amphibians,+and+reptiles.">Hypothalamic control of the pars distalis in fishes, amphibians, and reptiles.</a> General Comparative Endocrinology. 44 (2), 135-170 (1981).</li><li>Knowles, F., Vollrath, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+contacts+between+neurosecretory+fibres+and+pituicytes+in+the+pituitary+of+the+eel.">Synaptic contacts between neurosecretory fibres and pituicytes in the pituitary of the eel.</a> Nature. 206 (4989), 1168 (1965).</li><li>Knowles, F., Vollrath, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosecretory+innervation+of+the+pituitary+of+the+eels+Anguilla+and+Conger+I.+The+structure+and+ultrastructure+of+the+neuro-intermediate+lobe+under+normal+and+experimental+conditions.">Neurosecretory innervation of the pituitary of the eels Anguilla and Conger I. The structure and ultrastructure of the neuro-intermediate lobe under normal and experimental conditions.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 250 (768), 311-327 (1966).</li><li>Golan, M., Zelinger, E., Zohar, Y., Levavi-Sivan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+GnRH-Gonadotrope-Vasculature+Reveals+a+Dual+Mode+of+Gonadotropin+Regulation+in+Fish.">Architecture of GnRH-Gonadotrope-Vasculature Reveals a Dual Mode of Gonadotropin Regulation in Fish.</a> Endocrinology. 156 (11), 4163-4173 (2015).</li><li>Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vascular+anatomy+of+the+developing+zebrafish:+an+atlas+of+embryonic+and+early+larval+development.">The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development.</a> Developmental Biology. 230 (2), 278-301 (2001).</li><li>Cha, Y. R., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+experimental+analysis+of+blood+vessel+formation+using+transgenic+zebrafish.">Visualization and experimental analysis of blood vessel formation using transgenic zebrafish.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 81 (4), 286-296 (2007).</li><li>Kamei, M., Isogai, S., Pan, W., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+blood+vessels+in+the+zebrafish.">Imaging blood vessels in the zebrafish.</a> Methods Cell Biology. 100, 27-54 (2010).</li><li>Wu, E. S., Jacobson, K., Papahadjopoulos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+Diffusion+in+Phospholipid+Multibilayers+Measured+by+Fluorescence+Recovery+after+Photobleaching.">Lateral Diffusion in Phospholipid Multibilayers Measured by Fluorescence Recovery after Photobleaching.</a> Biochemistry. 16 (17), 3936-3941 (1977).</li><li>Schlessinger, J., Axelrod, D., Koppel, D. E., Webb, W. W., Elson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+Transport+of+a+Lipid+Probe+and+Labeled+Proteins+on+a+Cell-Membrane.">Lateral Transport of a Lipid Probe and Labeled Proteins on a Cell-Membrane.</a> Science. 195 (4275), 307-309 (1977).</li><li>Johnson, M., Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+Diffusion+in+Plasma-Membrane+of+Mouse+Egg+Is+Restricted+after+Fertilization.">Lateral Diffusion in Plasma-Membrane of Mouse Egg Is Restricted after Fertilization.</a> Nature. 272 (5652), 448-450 (1978).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbocyanine+Dye+Orientation+in+Red-Cell+Membrane+Studied+by+Microscopic+Fluorescence+Polarization.">Carbocyanine Dye Orientation in Red-Cell Membrane Studied by Microscopic Fluorescence Polarization.</a> Biophysical Journal. 26 (3), 557-573 (1979).</li><li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Carbocyanine+Dyes+Allow+Living+Neurons+of+Identified+Origin+to+Be+Studied+in+Long-Term+Cultures.">Fluorescent Carbocyanine Dyes Allow Living Neurons of Identified Origin to Be Studied in Long-Term Cultures.</a> Journal of Cell Biology. 103 (1), 171-187 (1986).</li><li>Godement, P., Vanselow, J., Thanos, S., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+in+developing+visual+systems+with+a+new+method+of+staining+neurones+and+their+processes+in+fixed+tissue.">A study in developing visual systems with a new method of staining neurones and their processes in fixed tissue.</a> Development. 101 (4), 697-713 (1987).</li><li>Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde+Fixation.">Formaldehyde Fixation.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).</li><li>Puchtler, H., Meloan, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Chemistry+of+Formaldehyde+Fixation+and+Its+Effects+on+Immunohistochemical+Reactions.">On the Chemistry of Formaldehyde Fixation and Its Effects on Immunohistochemical Reactions.</a> Histochemistry. 82 (3), 201-204 (1985).</li><li>Hoetelmans, R. W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+acetone,+methanol,+or+paraformaldehyde+on+cellular+structure,+visualized+by+reflection+contrast+microscopy+and+transmission+and+scanning+electron+microscopy.">Effects of acetone, methanol, or paraformaldehyde on cellular structure, visualized by reflection contrast microscopy and transmission and scanning electron microscopy.</a> Applied Immunohistochemistry &amp; Molecular Morphology. 9 (4), 346-351 (2001).</li><li>Hobro, A. J., Smith, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+fixation+methods:+Spatial+and+compositional+cellular+changes+observed+by+Raman+imaging.">An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging.</a> Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).</li><li>Li, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+labeling+and+visualization+of+blood+vessels+with+lipophilic+carbocyanine+dye+DiI.">Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI.</a> Nature Protocols. 3 (11), 1703-1708 (2008).</li><li>Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medaka--a+model+organism+from+the+far+East.">Medaka--a model organism from the far East.</a> Nature Review Genetic. 3 (1), 53-64 (2002).</li><li>Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Healthy+Brain-pituitary+Slices+for+Electrophysiological+Investigations+of+Pituitary+Cells+in+Teleost+Fish.">Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish.</a> Journal of Visual Experiments. (138), 57790 (2018).</li><li>Ager-Wick, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+a+High-quality+Primary+Cell+Culture+from+Fish+Pituitaries.">Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries.</a> Journal of Visual Experiments. (138), 58159 (2018).</li><li>Hildahl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+tracing+of+luteinizing+hormone+beta-subunit+gene+expression+using+green+fluorescent+protein+transgenic+medaka+(Oryzias+latipes)+reveals+a+putative+novel+developmental+function.">Developmental tracing of luteinizing hormone beta-subunit gene expression using green fluorescent protein transgenic medaka (Oryzias latipes) reveals a putative novel developmental function.</a> Developmental Dynamics. 241 (11), 1665-1677 (2012).</li><li>Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-level+3D+visualization+API+for+Java+and+ImageJ.">A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ.</a> BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).</li><li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dil+and+diO:+versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing.">Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends Neurosciences. 12 (9), 333-335 (1989).</li><li>Fontaine, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+Neurons+Controlling+Anterior+Pituitary+Functions:+Anatomy+and+Ontogenesis+in+Zebrafish.">Dopaminergic Neurons Controlling Anterior Pituitary Functions: Anatomy and Ontogenesis in Zebrafish.</a> Endocrinology. 156 (8), 2934-2948 (2015).</li></ol>

DiI har tidligere blitt brukt til å merke blodkar i flere modell arter24, inkludert tetramerisk fisk13.
Siden DiI leveres direkte til endothelial celle membran ved å blodkar, er det mulig å øke signal-til-støy-forholdet ved å øke DiI-konsentrasjonen i bindemiddel-oppløsningen. I tillegg gir fluoroforen intens farging når den er spent med minimale blekemidler, noe som gir relativt langvarige utslipp18<su...

Blodårene spiller en viktig del av virveldyr kroppen som de gir de nødvendige næringsstoffer, oksygen og hormonelle signaler til alle organer. Også, siden oppdagelsen av deres engasjement i kreftutvikling1, har de fått mye oppmerksomhet i klinisk forskning. Selv om en rekke publikasjoner har undersøkt mekanismene som gjør at blodkar vekst og morphogenesis, og et stort antall gener som er viktige for dannelsen, har blitt identifisert2, gjenstår mye å forstå om samspillet mellom celler eller vev og sirkulerende blod.
Visualisering av blod blodkar i hjernen og hypofysen er viktig. Neurons i hjernen krever en høy tilførsel av oksygen og glukose3, og hypofysen inneholder opptil åtte viktige hormon-produserende celletyper som bruker blodstrømmen til å motta signal fra hjernen og sende sine respektive hormoner til ulike perifere organer4,5. Mens i pattedyr, portalen systemet ved foten av hypothalamus navngitt median dominans, lenker hjernen og hypofysen6, har en slik klar blod bro ikke blitt beskrevet i tetramerisk fisk. Faktisk, i teleosts, preoptico-hypothalamus neurons direkte prosjektet deres axons inn i Pars nervosa av hypofysen7 og det meste innervate de ulike endokrine celletyper direkte8,9. Men noen av disse neurons har sine nerve avslutninger ligger i ekstravaskulær plass, i nærheten av blodkar10. Derfor er forskjellen mellom tetramerisk fisk og pattedyr ikke så klart, og forholdet mellom blod blodkar og hjernen og hypofysen cellene krever større etterforskning i tetramerisk fisk.
Sebrafisk har i mange aspekter, et anatomisk og funksjonelt sammenlignbart vaskulær system til andre virveldyr-arter11. Det har blitt en kraftig virveldyr modell for kardiovaskulær forskning hovedsakelig takket være utviklingen av flere transgene linjer hvor komponentene i det vaskulære systemet er merket med fluorescerende reporter proteiner12. Men nøyaktig sirkulasjonssystemet anatomi kan variere mellom arter, eller til og med mellom to individer som tilhører samme art. Derfor visualisering av blodkar kan være av høy interesse også i andre tetramerisk arter som transgenesis verktøy ikke eksisterer.
Flere teknikker har blitt beskrevet for å merke blodkar i både pattedyr og teleosts. Disse inkluderer in situ hybridisering for blodkar-spesifikke gener, alkalisk fosfatase farging, microangiography, og fargestoff injeksjoner (for en gjennomgang se13). Fluorescerende lipofile kationiske indocarbocyanine Dye (DiI) ble først brukt til å studere membran lipider lateral mobilitet som det er beholdt i lipid bilayers og kan migrere gjennom den14,15,16. Faktisk er et molekyl av DiI sammensatt av to hydrokarboner kjeder og chromophores. Mens hydrokarboner kjeder integreres i lipid bilayer celle membran av cellene i kontakt med den, forblir chromophores på overflaten17. En gang i membranen, DiI molekyler diffus sideveis i lipid bilayer som bidrar til å flekk membran strukturer som ikke er i direkte kontakt med DiI løsning. Injisering av en DiI-løsning gjennom hjerte-og blodlegemer, vil derfor merke alle endothelial celler i kontakt med det sammensatte som tillater direkte merking av blodårer. I dag DiI brukes også for andre farging formål, for eksempel enkelt molekyl Imaging, skjebne kartlegging, og neuronal tracing. Interessant, flere fluorophores finnes (med ulike bølgelengder av utslipp) slik at kombinasjonen med andre fluorescerende etiketter, og innlemmelse samt lateral diffusjon av DiI kan forekomme i både live og fast vev18, 19i denne.
Formaldehyd, oppdaget av Ferdinand Blum i 1893, har blitt brukt mye til i dag som den foretrukne kjemiske for vev fiksering20,21. Det viser bred spesifisitet for de fleste cellulære mål og bevarer den cellulære strukturen22,23. Det bevarer også de fluorescerende egenskapene til de fleste fluorophores, og kan dermed brukes til å fixate transgene-dyr som målrettede celler uttrykker fluorescerende reporter proteiner.
I dette manuskriptet, en tidligere protokoll utviklet for å merke blodkar i små eksperimentelle pattedyr modeller24 har blitt tilpasset bruk i fisk. Hele prosedyren tar bare et par timer å utføre. Det viser hvordan du perfuse en bindemiddel løsning av formaldehyd inneholder DiI i fisken hjertet for å direkte merke alle blodårer i hjernen og hypofysen av modellen fisken medaka. Medaka er en liten ferskvannsfisk innfødt til Asia, hovedsakelig funnet i Japan. Det er en forsknings modell organisme med en rekke molekylære og genetiske verktøy tilgjengelig25. Derfor identifisering av blodkar i denne arten så vel som i andre vil tillate å forbedre vår forståelse av hvordan hjernen og hypofysen celler samhandle med blod blodkar i hele vev eller tykke vev skiver.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:877px;" width="877">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">16% paraformaldehyde</td>
			<td style="width:171px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:123px;">RT 15711</td>
			<td style="width:152px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">5 mL Syringe PP/PE without needle</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">Z116866-100EA</td>
			<td style="width:152px;">syringes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:432px;">BD Precisionglide syringe needles</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">Z118044-100EA</td>
			<td style="width:152px;">needles 18G (1.20*40)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">borosilicate glass 10cm OD1.2mm</td>
			<td style="width:171px;">sutter instrument</td>
			<td style="width:123px;">BF120-94-10</td>
			<td style="width:152px;">glass pipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">DiI (1,1&#8242;-Dioctadecyl-3,3,3&#8242;,3&#8242;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)</td>
			<td style="width:171px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">D-282</td>
			<td style="width:152px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:432px;">LDPE tube O.D 1.7mm and I.D 1.1mm</td>
			<td style="width:171px;">Portex</td>
			<td style="width:123px;">800/110/340/100</td>
			<td style="width:152px;">canula</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">Phosphate Buffer Saline (PBS) solution</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">D8537-6X500ML</td>
			<td style="width:152px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">pipette puller</td>
			<td style="width:171px;">Narishige</td>
			<td style="width:123px;">PC-10</td>
			<td style="width:152px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">plastic petri dishes</td>
			<td style="width:171px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">391-0442</td>
			<td style="width:152px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">Super glue gel</td>
			<td style="width:171px;">loctite</td>
			<td style="width:123px;">c4356</td>
			<td style="width:152px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">tricaine (ms-222)</td>
			<td style="width:171px;">sigma</td>
			<td style="width:123px;">E10521-50G</td>
			<td style="width:152px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

labeling of blood vessels in the teleost brain and pituitary using cardiac perfusion with a dii-fixative

Blodårene innervate alle vev i virveldyr, slik at deres overlevelse ved å gi de nødvendige næringsstoffer, oksygen, og hormonelle signaler. Det er en av de første organene til å begynne å fungere under utvikling. Mekanismer for blodkar dannelse har blitt gjenstand for høy vitenskapelig og klinisk interesse. Hos voksne er det imidlertid vanskelig å visualisere blodkar i de fleste levende dyr på grunn av deres lokalisering dypt inne i andre vev. Likevel er visualisering av blodkar fortsatt viktig for flere studier som endokrinologi og nevrobiologi. Mens flere transgene Lines har blitt utviklet i sebrafisk, med blodkar direkte visualisere gjennom uttrykk for fluorescerende proteiner, finnes det ingen slike verktøy for andre tetramerisk arter. Bruke medaka (Oryzias latipes) som en modell, presenterer den nåværende protokollen en rask og direkte teknikk for å merke blodkar i hjernen og hypofysen ved perfusing gjennom hjertet med bindemiddel som inneholder DiI. Denne protokollen kan forbedring av vår forståelse om hvordan hjernen og hypofysen celler samhandle med blod blodkar i hele vev eller tykke vev skiver.

Denne protokollen demonstrerer en trinnvis prosedyre for å merke blodkar i medaka hjernen og hypofysen, og samtidig fikse vevet. Etter merking ved CARDIAC injeksjon av en bindemiddel løsning som inneholder DiI inn i hjertet, blodkar kan observeres på skiver ved hjelp av en fluorescerende stereomikroskopet (Figur 4) eller på hele vevet ved hjelp av et konfokalmikroskopi mikroskop (figur 5). Enten på tykt vev skive eller på hele vevet, kan arkitekturen av bl...

Watch this Scientific Journal Video about Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative at JoVE.com

Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative

Artikkelen beskriver en rask protokoll for merking blodkar i en tetramerisk fisk ved hjertestans av DiI fortynnet i bindemiddel, ved hjelp av medaka (Oryzias latipes) som en modell og fokus på hjerne og hypofysen vev.

Merking av blodkar i tetramerisk Brain og hypofysen bruke CARDIAC blod med en DiI-bindemiddel

Blood vessels innervate all tissues in vertebrates, enabling their survival by providing the necessary nutrients, oxygen, and hormonal signals. It is one ...

Det overordnede målet med denne prosedyren er å merke blodkar i hjernen og hypofysen av teleostfisk, og vi bruker hjerteperfusjon med et fikseringsmiddel som inneholder DiI i modellartene medaka. Så denne teknikken som er enkel og effektiv vil bidra til å svare på viktige spørsmål om vaskulær anatomi i hjernen og hypofysen av teleost fisk samt forholdet mellom nevroner eller endokrine celler og blodkar. Noen fordeler med denne teknikken inkluderer et raskt og enkelt enkelt preparat, og tilpasningsevnen til teleostfiskartene.For å forberede en fiskeholder, kutt et stykke polystyren til en fem centimeter lang, en tre centimeter bredde og en to centimeter tykkelse, og lim polystyren til en ni centimeter diameter plastfat. Bruk deretter en skalpell for å lage et tre centimeter båtformet hull i polystyren. For å forberede perfusjonssystemet, legg til en 30 til 50 centimeter lang plastkanyle ved ekstremiteten til perfusjonssystemet nålen.For å forberede fem centimeter glasspipetter, bruk en pipettetrekker til å strekke individuelle glasskapillærer i henhold til produsentens instruksjoner. Før du begynner disseksjonen, legg en 10 milliliter sprøyte med den tilberedte DiI-fikseringsmiddeloppløsningen og plasser en nål med en kanyle på sprøytens ekstremitet. Bruk deretter flere tapedeler plassert i forskjellige retninger for å feste sprøyten til benken, og juster plasseringen av mikroskopet og setet for å oppnå en god posisjon for disseksjon og for å trykke sprøytestempelet med albuen.Deretter plasserer du en euthanized fisk i fiskeholderens mage med side opp og sikrer hodet og halen med pinner. Bruk saks til horisontalt å kutte det overfladiske laget av huden for å åpne den fremre magen, og bruk tang for å fjerne huden over hjertet til en klar tilgang til ventrikkelen og bulbus arteriosus oppnås. Tilsett et glassrør på ekstremiteten til kapillæren og bryt tuppen av pipetten.Ta glassrøret nær ventrikkelen og legg albuetrykket til sprøytestempelet for å tvinge væsken ut mens du fester hjerteventrikkelen med pipetten. Deretter perforerer du umiddelbart sinus venosus med tang for å frigjøre blodet fra sirkulasjonen. Fra ventrikkelen justerer du vinkelen på glasspipetten for å finne inngangen til bulbus arteriosus, og flytt pipetteåpningen inne i bulbus arteriosus.Tilsett deretter trykk på sprøyten i ytterligere 30 til 60 sekunder mens du holder pipetten inne i bulbus arteriosus. For optimal merking av alle blodkarene er det avgjørende å perfuse inn i bulbus arteriosus lenge nok til å erstatte alt blodet med DiI-fikseringsmiddelløsning. Etter ca 60 sekunder med perfusjon, når det ikke observeres mer blodlekkasje, fjerner du glasspipetten og nålene fra fisken, og høster hjernen og hypofysen til fersk 4% paraformaldehyd i to timer ved romtemperatur i mørket.Skyll deretter vevet to ganger i fersk PBS i 10 minutter per vask før du forbereder prøvene for avbildning. Etter hjerteinjeksjon av en fikserende løsning som inneholder DiI som vist, kan de merkede blodkarene observeres på vevskiver ved fluorescerende stereomikroskopi eller på hele vev ved konfokal mikroskopi. Merk at hvis oppløsningen injiseres i hjerteventrikkelen i stedet for bulbus arteriosus eller hvis oppløsningen injiseres med for lavt trykk og/eller for kort tid, vil en utilstrekkelig merking av karene bli observert.I tillegg, når du avbilde det samme vevet med de samme bildeparametrene, kan en reduksjon i merkingsintensiteten observeres etter flere dager, med signalet som vises mer spredt ut i vevsprøven. Vevskiver fra transgene linjer der cellene av interesse uttrykker fluorescerende reporterproteiner kan videre merkes for spesifikke proteiner av interesse ved hjelp av standard immunofluorescensprotokoller som tillater undersøkelse av interaksjoner mellom blodkar og andre celletyper. Det er viktig å nå bulbus arteriosus.Når dette oppnås, bør det å legge trykk på sprøytestempelet indusere en utvidelse av bulbus som bekrefter en vellykket prosedyre. Denne teknikken kan brukes til å undersøke samspillet mellom endokrine celler og blodkar i teleost hypofysen generelt, men kanskje mer spesifikt for å undersøke mulige forskjeller eller likheter mellom portalsystemer i teleost og pattedyr. Fordi denne politiske bruk giftige og flyktige forbindelser forholdsregler som å bruke en gassmaske og et ventilert rom bør alltid tas når du utfører disse prosedyrene.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Anatomical Reconstructions of the Human Cardiac Venous System using Contrast-computed Tomography of Perfusion-fixed Specimens

Anatomiske rekonstruksjoner av Human Cardiac venøse systemet ved hjelp av kontrast-computertomografi av Perfusjons-fast Prøver

A detailed  understanding of the complexity and relative variability within the human  cardiac venous system is crucial for the development of cardiac ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Forbedret fremgangsmåte for fremstilling av en human cellebasert kontakt Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

Generasjon og Negl Tissue-konstruert Fartøy i en musemodell

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

I Vivo kvantitativ vurdering av hjerteinfarkt struktur, funksjon, Perfusjons og Livskraftig Bruke Cardiac Micro-computertomografi

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Protokoll for MicroRNA overføring til voksen Ben margtransplantasjon-avledet blodkreft stamceller aktivere cellen Engineering kombinert med magnetiske målretting

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier

Lucifer Yellow-en robust paracellular permeabilitet markør i en celle modell av Human Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of ...

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

Intra-CARDIAC side-avfyring lys kateter for overvåking Cellular metabolisme bruker transmuralt absorbansen spektroskopi av Perfusert pattedyr hjerter

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Preklinisk hjertelektrofysiologi vurdering av dual spenning og kalsium optisk kartlegging av humane organotypiske hjerteskiver

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

Blood Flow Imaging with Ultrafast Doppler

Blodstrømavbildning med ultrarask Doppler

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler ...

Stepwise Cell Seeding on Tessellated Scaffolds to Study Sprouting Blood Vessels

Trinnvis cellesåing på flislagte stillaser for å studere spirende blodårer

The cardiovascular system is a key player in human physiology, providing nourishment to most tissues in the body; vessels are present in different sizes, ...