Name: labeling of blood vessels in the teleost brain and pituitary using cardiac perfusion with a dii-fixative
Uploaded: 2019-06-13T14:45:00
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Agradecemos ao Dr. Shinji Kanda pela demonstração de perfusão cardíaca com solução fixativa em Medaka, Sra. Lourdes Carreon G Tan, para obter ajuda com a criação de Medaka, e o Sr. Anthony Peltier para ilustrações. Este trabalho foi financiado pela NMBU e pelo Conselho de pesquisa da Noruega, concedem o número 248828 (programa de vida digital da Noruega).

Toda a manipulação animal foi executada de acordo com as recomendações para o cuidado e o bem-estar de animais da pesquisa na Universidade Norueguesa de Ciências da vida, e a supervisão de investigadores autorizados.
1. preparação de instrumentos e soluções
<ol><li>Prepare a solução de ações DiI dissolvendo 5 mg de cristal DiI em tubo plástico de 1,5 mL com 1 mL de 96% de EtOH. Vortex para 30 s e sustento coberto usando a folha de alumínio. Nota: A soluç?...

<ol>
	<li>Nishida, N., Yano, H., Nishida, T., Kamura, T., Kojiro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+cancer.">Angiogenesis in cancer.</a> Vascular Health and Risk Management. 2 (3), 213-219 (2006).</li><li>Simon, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+morphogenesis+and+the+formation+of+vascular+networks.">Vascular morphogenesis and the formation of vascular networks.</a> Developmental Cell. 6 (4), 479-482 (2004).</li><li>Magistretti, P. J., Zigmond, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Brain energy metabolism in Fundamental neuroscience. , 389-413 (1999).</li><li>Weltzien, F. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+blood+vessels+in+the+zebrafish.">Imaging blood vessels in the zebrafish.</a> Methods Cell Biology. 100, 27-54 (2010).</li><li>Wu, E. S., Jacobson, K., Papahadjopoulos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+Diffusion+in+Phospholipid+Multibilayers+Measured+by+Fluorescence+Recovery+after+Photobleaching.">Lateral Diffusion in Phospholipid Multibilayers Measured by Fluorescence Recovery after Photobleaching.</a> Biochemistry. 16 (17), 3936-3941 (1977).</li><li>Schlessinger, J., Axelrod, D., Koppel, D. E., Webb, W. W., Elson, E. 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(138), 58159 (2018).</li><li>Hildahl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+tracing+of+luteinizing+hormone+beta-subunit+gene+expression+using+green+fluorescent+protein+transgenic+medaka+(Oryzias+latipes)+reveals+a+putative+novel+developmental+function.">Developmental tracing of luteinizing hormone beta-subunit gene expression using green fluorescent protein transgenic medaka (Oryzias latipes) reveals a putative novel developmental function.</a> Developmental Dynamics. 241 (11), 1665-1677 (2012).</li><li>Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-level+3D+visualization+API+for+Java+and+ImageJ.">A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ.</a> BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).</li><li>Honig, M. 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A perfusão cardíaca com DII anteriormente tem sido usada para rotular vasos sanguíneos em várias espécies-modelo24, incluindo peixes teleósteo13.
Como DiI é diretamente entregue à membrana celular endotelial por perfusão na vasculatura, é possível aumentar a relação sinal-ruído, aumentando a concentração de DiI na solução fixativa. Além, o fluoróforo fornece a mancha intensa quando excitado com o clareamento mínimo...

Os vasos sanguíneos desempenham uma parte essencial do corpo vertebrado como eles fornecem os nutrientes necessários, oxigênio e sinais hormonais para todos os órgãos. Além disso, desde a descoberta de seu envolvimento no desenvolvimento do câncer1, eles receberam muita atenção na pesquisa clínica. Embora um número de publicações investigaram os mecanismos permitindo o crescimento e a morfogênese do vaso sanguíneo, e um grande número genes importantes para sua formação foram identificados2, muito remanesce ser compreendido a respeito da interação entre células ou tecidos e o sangue circulante.
A visualização da vasculatura sanguínea no cérebro e na hipófise é importante. Os neurônios no cérebro exigem uma alta oferta de oxigênio e glicose3, e a hipófise contém até oito tipos importantes de células produtoras de hormônio que usam o fluxo sanguíneo para receber sinal do cérebro e enviar seus respectivos hormônios para diferentes órgãos periféricos4,5. Enquanto em mamíferos, o sistema portal na base do hipotálamo nomeou a Eminência mediana, liga o cérebro e a hipófise6, tal uma ponte de sangue clara não foi descrita em peixes teleósteo. Na verdade, nos teleosts, os neurônios preoptico-hipotálamo projetam diretamente seus axônios na pars nervosa da hipófise7 e inervam principalmente os diferentes tipos de células endócrinas diretamente8,9. No entanto, alguns desses neurônios têm suas terminações nervosas localizadas no espaço extravascular, em estreita proximidade com capilares sanguíneos10. Portanto, a diferença entre peixes e mamíferos teleósteo não é tão clara, e a relação entre a vasculatura sanguínea e o cérebro e as células Hipofisárias requer maior investigação em peixes teleósteo.
O zebrafish tem, em muitos aspectos, um sistema vascular anatomicamente e funcionalmente comparável a outras espécies de vertebrados11. Transformou-se um modelo poderoso do vertebrados para a pesquisa cardiovascular na maior parte agradecimentos ao desenvolvimento de diversas linhas transgênicas onde os componentes do sistema vascular são etiquetados com as proteínas fluorescentes do repórter12. No entanto, a anatomia do sistema circulatório exato pode variar entre as espécies, ou mesmo entre dois indivíduos pertencentes à mesma espécie. Portanto, a visualização dos vasos sanguíneos pode ser de grande interesse também em outras espécies teleósteo para as quais as ferramentas de transgénese não existem.
Várias técnicas foram descritas para rotular vasos sanguíneos em mamíferos e teleosts. Estes incluem a hibridação in situ para genes vasculature-específicos, a mancha alcalina da fosfatase, a microangiografia, e as injeções da tintura (para uma revisão vêem13). A tintura catiônica lipofílica fluorescente do indocarbocyanine (DII) foi usada primeiramente para estudar a mobilidade lateral dos lipídios da membrana porque é mantida nos bicamadas do lipido e pode migrar com ele14,15,16. De fato, uma molécula de DiI é composta por duas cadeias de hidrocarbonetos e cromophores. Quando as correntes do hidrocarboneto se integrarem na membrana de pilha do BICAMADA do lipido das pilhas no contato com ela, os cromóforos permanecem em sua superfície17. Uma vez na membrana, as moléculas DiI se difusas lateralmente dentro da bicamada lipídica que ajuda a manchar estruturas de membrana que não estão em contato direto com a solução DiI. Injetando uma solução DiI através de perfusão cardíaca, portanto, rotular todas as células endoteliais em contato com o composto permitindo a rotulagem direta dos vasos sanguíneos. Hoje DiI também é usado para outros fins de coloração, tais como a imagem única molécula, mapeamento de destino, e Rastreamento neuronal. Curiosamente, existem vários fluoróforos (com diferentes comprimentos de onda de emissão) permitindo a combinação com outros rótulos fluorescentes, e a incorporação, bem como a difusão lateral de DiI pode ocorrer em ambos os tecidos vivos e fixos18, a 19.
O formaldeído, descoberto por Ferdinand Blum em 1893, tem sido amplamente utilizado nos dias atuais como o produto químico preferencial para fixação tecidual20,21. Mostra ampla especificidade para a maioria dos alvos celulares e preserva a estrutura celular22,23. Igualmente preserva as propriedades fluorescentes da maioria de Fluorophores, e assim pode ser usado para fixar os animais transgênicas para que as pilhas alvejadas expressam proteínas fluorescentes do repórter.
Neste manuscrito, um protocolo prévio desenvolvido para rotular vasos sanguíneos em pequenos modelos experimentais de mamíferos24 foi adaptado ao uso em peixes. O procedimento inteiro leva apenas um par de horas para executar. Ele demonstra como perfuse uma solução fixativa de formaldeído contendo DiI no coração de peixe, a fim de etiquetar diretamente todos os vasos sanguíneos no cérebro e da hipófise do modelo de peixe Medaka. Medaka é um pequeno peixe de água doce nativo da Ásia, encontrado principalmente no Japão. É um organismo modelo de pesquisa com um conjunto de ferramentas moleculares e genéticas disponíveis25. Portanto, a identificação dos vasos sanguíneos nesta espécie, bem como em outros permitirá melhorar a nossa compreensão sobre como o cérebro e as células Hipofisárias interagem com a vasculatura sanguínea em tecido inteiro ou fatias de tecido espesso.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:877px;" width="877">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">16% paraformaldehyde</td>
			<td style="width:171px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:123px;">RT 15711</td>
			<td style="width:152px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">5 mL Syringe PP/PE without needle</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">Z116866-100EA</td>
			<td style="width:152px;">syringes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:432px;">BD Precisionglide syringe needles</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">Z118044-100EA</td>
			<td style="width:152px;">needles 18G (1.20*40)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">borosilicate glass 10cm OD1.2mm</td>
			<td style="width:171px;">sutter instrument</td>
			<td style="width:123px;">BF120-94-10</td>
			<td style="width:152px;">glass pipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">DiI (1,1&#8242;-Dioctadecyl-3,3,3&#8242;,3&#8242;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)</td>
			<td style="width:171px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">D-282</td>
			<td style="width:152px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:432px;">LDPE tube O.D 1.7mm and I.D 1.1mm</td>
			<td style="width:171px;">Portex</td>
			<td style="width:123px;">800/110/340/100</td>
			<td style="width:152px;">canula</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">Phosphate Buffer Saline (PBS) solution</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">D8537-6X500ML</td>
			<td style="width:152px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">pipette puller</td>
			<td style="width:171px;">Narishige</td>
			<td style="width:123px;">PC-10</td>
			<td style="width:152px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">plastic petri dishes</td>
			<td style="width:171px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">391-0442</td>
			<td style="width:152px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">Super glue gel</td>
			<td style="width:171px;">loctite</td>
			<td style="width:123px;">c4356</td>
			<td style="width:152px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">tricaine (ms-222)</td>
			<td style="width:171px;">sigma</td>
			<td style="width:123px;">E10521-50G</td>
			<td style="width:152px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

labeling of blood vessels in the teleost brain and pituitary using cardiac perfusion with a dii-fixative

Os vasos sanguíneos inervam todos os tecidos em vertebrados, permitindo a sua sobrevivência, proporcionando os nutrientes necessários, oxigênio, e sinais hormonais. É um dos primeiros órgãos a começar a funcionar durante o desenvolvimento. Mecanismos de formação de vasos sanguíneos tornaram-se um assunto de alto interesse científico e clínico. Em adultos no entanto, é difícil visualizar a vasculatura na maioria dos animais vivos devido à sua localização profunda dentro de outros tecidos. No entanto, a visualização dos vasos sanguíneos permanece importante para vários estudos, como Endocrinologia e neurobiologia. Enquanto várias linhas transgênicas foram desenvolvidas em zebrafish, com vasos sanguíneos visualizados diretamente através da expressão de proteínas fluorescentes, não existem tais ferramentas para outras espécies teleósteo. Usando Medaka (Oryzias latipes) como um modelo, o protocolo atual apresenta uma técnica rápida e direta para rotular vasos sanguíneos no cérebro e hipófise por perfusing através do coração com fixador contendo DII. Este protocolo permite a melhoria de nossa compreensão em como o cérebro e as pilhas pituitárias interagem com o vasculatura do sangue no tecido inteiro ou em fatias grossas do tecido.

Este protocolo demonstra um procedimento passo a passo para rotular vasos sanguíneos no cérebro Medaka e pituitária, e ao mesmo tempo fixar o tecido. Após a rotulagem por injeção cardíaca de uma solução fixativa contendo DiI no coração, os vasos sanguíneos podem ser observados em fatias usando um estereomicroscópio fluorescente (Figura 4) ou em tecido inteiro usando um microscópio confocal (Figura 5). Na fatia grossa do tecido ou no tecido inteiro,...

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Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative

O artigo descreve um protocolo rápido para a rotulagem de vasos sanguíneos em um peixe teleósteo por perfusão cardíaca de DII diluído em fixador, usando Medaka (Oryzias latipes) como um modelo e focando no cérebro e tecido hipofisário.

Rotulagem de vasos sanguíneos no cérebro Teleost e pituitária usando a perfusão cardíaca com um DiI-fixative

Blood vessels innervate all tissues in vertebrates, enabling their survival by providing the necessary nutrients, oxygen, and hormonal signals. It is one ...

O objetivo geral deste procedimento é rotular os vasos sanguíneos no cérebro e a hipófise de peixes teleost, e usamos perfusão cardíaca com um DiI fixador contendo II na espécie modelo medaka. Assim, essa técnica simples e eficiente ajudará a responder questões importantes sobre a anatomia vascular no cérebro e a hipófise de peixes teleost, bem como a relação entre neurônios ou células endócrinas e vasos sanguíneos. Algumas vantagens desta técnica incluem uma preparação rápida e fácil e simples, e sua adaptabilidade às espécies de peixes teleost.Para preparar um suporte de peixe, corte um pedaço de poliestireno a um comprimento de cinco centímetros, uma largura de três centímetros e uma espessura de dois centímetros, e cole o poliestireno a uma antena plástica de nove centímetros de diâmetro. Em seguida, use um bisturi para fazer um buraco em forma de barco de três centímetros no poliestireno. Para preparar o sistema de perfusão, adicione uma cânula de plástico de 30 a 50 centímetros de comprimento na extremidade da agulha do sistema de perfusão.Para preparar pipetas de vidro de cinco centímetros, use uma puxadora de pipeta para esticar capilares individuais de vidro de acordo com as instruções do fabricante. Antes de iniciar a dissecção, carregue uma seringa de 10 mililitros com a solução dii-fixativa preparada e coloque uma agulha com uma cânula na extremidade da seringa. Em seguida, use várias peças de fita colocadas em diferentes orientações para fixar a seringa no banco, e ajustar a posição do microscópio e do assento para obter uma boa posição para dissecção e para pressionar o pistão de seringa com o cotovelo.Em seguida, coloque um peixe eutanizado no lado do abdômen do portador do peixe para cima e fixe a cabeça e a cauda com pinos. Use a tesoura para cortar horizontalmente a camada superficial da pele para abrir o abdômen anterior, e use fórceps para remover a pele acima do coração até que um acesso claro ao ventrículo e o bulbo arteriosus seja alcançado. Adicione um tubo de vidro na extremidade do capilar e quebre a ponta da pipeta.Leve o tubo de vidro para perto do ventrículo e adicione pressão do cotovelo ao pistão de seringa para forçar o líquido para fora enquanto prende o ventrículo cardíaco com a pipeta. Em seguida, perfure imediatamente o seio venoso com fórceps para liberar o sangue de circulação. A partir do ventrículo, ajuste o ângulo da pipeta de vidro para localizar a entrada do bulbo arteriosus, e mova a pipeta abrindo dentro do bulbo arteriosus.Em seguida, adicione pressão à seringa por mais 30 a 60 segundos, mantendo a pipeta dentro do bulbo arteriosus. Para uma rotulagem ideal de todos os vasos sanguíneos é fundamental perfumar no bulbo arteriosus tempo suficiente para substituir todo o sangue pela solução dii-fixativa. Após cerca de 60 segundos de perfusão, quando não for observado mais vazamento de sangue, remova a pipeta de vidro e agulhas do peixe, e colde o cérebro e a pituitária em um fresco 4% de paraformaldeído por duas horas à temperatura ambiente no escuro.Em seguida, enxágüe os tecidos duas vezes em PBS fresco por 10 minutos por lavagem antes de preparar as amostras para a imagem. Após a injeção cardíaca de uma solução fixa que contenha DI, como demonstrado, os vasos sanguíneos rotulados podem ser observados em fatias de tecido por microscopia estéreo fluorescente ou em tecido inteiro por microscopia confocal. Observe que se a solução for injetada no ventrículo cardíaco em vez do bulbo arteriosus ou se a solução for injetada com uma pressão muito baixa e/ou por um período muito curto, será observada uma rotulagem inadequada dos vasos.Além disso, ao fotografar o mesmo tecido com os mesmos parâmetros de imagem, uma diminuição na intensidade de rotulagem pode ser observada após vários dias, com o sinal aparecendo mais espalhado dentro da amostra de tecido. Fatias de tecido de linhas transgênicas dentro das quais as células de interesse expressam proteínas fluorescentes podem ser rotuladas para proteínas específicas de interesse usando protocolos padrão de imunofluorescência que permitem a investigação de interações entre vasos sanguíneos e outros tipos de células. É importante alcançar o bulbo arteriosus.Quando isso for alcançado, a pressão adicional ao pistão de seringa deve induzir uma expansão do bulbo confirmando um procedimento bem sucedido. Essa técnica pode ser usada para investigar a interação entre células endócrinas e vasos sanguíneos na hipófise teleost em geral, mas talvez mais especificamente para investigar possíveis diferenças ou semelhanças entre os sistemas de portal em teleost e mamíferos. Como esse uso político de compostos tóxicos e voláteis, como o uso de uma máscara de gás e uma sala ventilada, devem ser sempre tomadas na realização desses procedimentos.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Anatomical Reconstructions of the Human Cardiac Venous System using Contrast-computed Tomography of Perfusion-fixed Specimens

Reconstruções anatômicas do sistema venoso cardíaco humano usando contraste Tomografia computadorizada de Amostras de perfusão-fixados

A detailed  understanding of the complexity and relative variability within the human  cardiac venous system is crucial for the development of cardiac ...

Bioengenharia

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Melhoria da Metodologia para a Elaboração de um baseado em celular, Contact Modelo Humano da barreira hemato-encefálica

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

Geração e Alongamento das embarcações da engenharia de tecidos em um modelo de rato

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

In Vivo quantitativa Avaliação da Estrutura do miocárdio, função, perfusão e viabilidade Usando Cardiac Micro-Tomografia Computadorizada

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Protocolo para transferência de MicroRNA na medula óssea-derivado hematopoiéticas células-tronco adultas para habilitar celular engenharia combinada com alvo magnético

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier

Amarelo de Lucifer-um marcador Paracellular robusto da permeabilidade em um modelo da pilha do sangue humano-barreira do cérebro

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of ...

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

Cateter de luz de queima lateral intra-cardíaco para monitoramento do metabolismo celular usando espectroscopia de absorvência transmural de corações de mamíferos perfused

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Avaliação de Eletrofisiologia Cardíaca Pré-Plínica por Mapeamento Óptico de Dupla Tensão e Cálcio de Fatias Cardíacas Organotípicas Humanas

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

Blood Flow Imaging with Ultrafast Doppler

Imagem de fluxo sanguíneo com Doppler Ultrarrápido

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler ...

Stepwise Cell Seeding on Tessellated Scaffolds to Study Sprouting Blood Vessels

Semeadura de células stepwise em andaimes tesavendados para estudar vasos sanguíneos brotando

The cardiovascular system is a key player in human physiology, providing nourishment to most tissues in the body; vessels are present in different sizes, ...