Name: labeling of blood vessels in the teleost brain and pituitary using cardiac perfusion with a dii-fixative
Uploaded: 2019-06-13T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative at JoVE.com

Мы благодарим д-ра Синдзи Канду за демонстрацию перфузии сердца с фиксаторным решением в Медаке, г-жу Лурдес Карреон Г Тан за помощь в медаке и г-на Энтони Пелтиера за иллюстрации. Эта работа была профинансирована НМБУ и Научно-исследовательским советом Норвегии, грант омовая программа 248828 (программа Digital Life Norway).

Все обращение с животными осуществлялось в соответствии с рекомендациями по уходу и благополучию научных животных в Норвежском университете наук о жизни и под наблюдением уполномоченных следователей.
1. Подготовка инструментов и решений
<ol><li>Приготовьте растворимый р...

<ol>
	<li>Nishida, N., Yano, H., Nishida, T., Kamura, T., Kojiro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+cancer.">Angiogenesis in cancer.</a> Vascular Health and Risk Management. 2 (3), 213-219 (2006).</li><li>Simon, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+morphogenesis+and+the+formation+of+vascular+networks.">Vascular morphogenesis and the formation of vascular networks.</a> Developmental Cell. 6 (4), 479-482 (2004).</li><li>Magistretti, P. J., Zigmond, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Brain energy metabolism in Fundamental neuroscience. , 389-413 (1999).</li><li>Weltzien, F. A., Andersson, E., Andersen, O., Shalchian-Tabrizi, K., Norberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+brain-pituitary-gonad+axis+in+male+teleosts,+with+special+emphasis+on+flatfish+(Pleuronectiformes).">The brain-pituitary-gonad axis in male teleosts, with special emphasis on flatfish (Pleuronectiformes).</a> Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Molecular &amp; Integrative Physiology. 137 (3), 447-477 (2004).</li><li>Ooi, G. T., Tawadros, N., Escalona, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+cell+lines+and+their+endocrine+applications.">Pituitary cell lines and their endocrine applications.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 228 (1-2), 1-21 (2004).</li><li>Knigge, K. M., Scott, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+median+eminence.">Structure and function of the median eminence.</a> American Journal of Anatomy. 129 (2), 223-243 (1970).</li><li>Ball, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothalamic+control+of+the+pars+distalis+in+fishes,+amphibians,+and+reptiles.">Hypothalamic control of the pars distalis in fishes, amphibians, and reptiles.</a> General Comparative Endocrinology. 44 (2), 135-170 (1981).</li><li>Knowles, F., Vollrath, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+contacts+between+neurosecretory+fibres+and+pituicytes+in+the+pituitary+of+the+eel.">Synaptic contacts between neurosecretory fibres and pituicytes in the pituitary of the eel.</a> Nature. 206 (4989), 1168 (1965).</li><li>Knowles, F., Vollrath, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosecretory+innervation+of+the+pituitary+of+the+eels+Anguilla+and+Conger+I.+The+structure+and+ultrastructure+of+the+neuro-intermediate+lobe+under+normal+and+experimental+conditions.">Neurosecretory innervation of the pituitary of the eels Anguilla and Conger I. The structure and ultrastructure of the neuro-intermediate lobe under normal and experimental conditions.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 250 (768), 311-327 (1966).</li><li>Golan, M., Zelinger, E., Zohar, Y., Levavi-Sivan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+GnRH-Gonadotrope-Vasculature+Reveals+a+Dual+Mode+of+Gonadotropin+Regulation+in+Fish.">Architecture of GnRH-Gonadotrope-Vasculature Reveals a Dual Mode of Gonadotropin Regulation in Fish.</a> Endocrinology. 156 (11), 4163-4173 (2015).</li><li>Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vascular+anatomy+of+the+developing+zebrafish:+an+atlas+of+embryonic+and+early+larval+development.">The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development.</a> Developmental Biology. 230 (2), 278-301 (2001).</li><li>Cha, Y. R., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+experimental+analysis+of+blood+vessel+formation+using+transgenic+zebrafish.">Visualization and experimental analysis of blood vessel formation using transgenic zebrafish.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 81 (4), 286-296 (2007).</li><li>Kamei, M., Isogai, S., Pan, W., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+blood+vessels+in+the+zebrafish.">Imaging blood vessels in the zebrafish.</a> Methods Cell Biology. 100, 27-54 (2010).</li><li>Wu, E. S., Jacobson, K., Papahadjopoulos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+Diffusion+in+Phospholipid+Multibilayers+Measured+by+Fluorescence+Recovery+after+Photobleaching.">Lateral Diffusion in Phospholipid Multibilayers Measured by Fluorescence Recovery after Photobleaching.</a> Biochemistry. 16 (17), 3936-3941 (1977).</li><li>Schlessinger, J., Axelrod, D., Koppel, D. E., Webb, W. W., Elson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+Transport+of+a+Lipid+Probe+and+Labeled+Proteins+on+a+Cell-Membrane.">Lateral Transport of a Lipid Probe and Labeled Proteins on a Cell-Membrane.</a> Science. 195 (4275), 307-309 (1977).</li><li>Johnson, M., Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+Diffusion+in+Plasma-Membrane+of+Mouse+Egg+Is+Restricted+after+Fertilization.">Lateral Diffusion in Plasma-Membrane of Mouse Egg Is Restricted after Fertilization.</a> Nature. 272 (5652), 448-450 (1978).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbocyanine+Dye+Orientation+in+Red-Cell+Membrane+Studied+by+Microscopic+Fluorescence+Polarization.">Carbocyanine Dye Orientation in Red-Cell Membrane Studied by Microscopic Fluorescence Polarization.</a> Biophysical Journal. 26 (3), 557-573 (1979).</li><li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Carbocyanine+Dyes+Allow+Living+Neurons+of+Identified+Origin+to+Be+Studied+in+Long-Term+Cultures.">Fluorescent Carbocyanine Dyes Allow Living Neurons of Identified Origin to Be Studied in Long-Term Cultures.</a> Journal of Cell Biology. 103 (1), 171-187 (1986).</li><li>Godement, P., Vanselow, J., Thanos, S., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+in+developing+visual+systems+with+a+new+method+of+staining+neurones+and+their+processes+in+fixed+tissue.">A study in developing visual systems with a new method of staining neurones and their processes in fixed tissue.</a> Development. 101 (4), 697-713 (1987).</li><li>Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde+Fixation.">Formaldehyde Fixation.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).</li><li>Puchtler, H., Meloan, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Chemistry+of+Formaldehyde+Fixation+and+Its+Effects+on+Immunohistochemical+Reactions.">On the Chemistry of Formaldehyde Fixation and Its Effects on Immunohistochemical Reactions.</a> Histochemistry. 82 (3), 201-204 (1985).</li><li>Hoetelmans, R. W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+acetone,+methanol,+or+paraformaldehyde+on+cellular+structure,+visualized+by+reflection+contrast+microscopy+and+transmission+and+scanning+electron+microscopy.">Effects of acetone, methanol, or paraformaldehyde on cellular structure, visualized by reflection contrast microscopy and transmission and scanning electron microscopy.</a> Applied Immunohistochemistry &amp; Molecular Morphology. 9 (4), 346-351 (2001).</li><li>Hobro, A. J., Smith, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+fixation+methods:+Spatial+and+compositional+cellular+changes+observed+by+Raman+imaging.">An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging.</a> Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).</li><li>Li, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+labeling+and+visualization+of+blood+vessels+with+lipophilic+carbocyanine+dye+DiI.">Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI.</a> Nature Protocols. 3 (11), 1703-1708 (2008).</li><li>Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medaka--a+model+organism+from+the+far+East.">Medaka--a model organism from the far East.</a> Nature Review Genetic. 3 (1), 53-64 (2002).</li><li>Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Healthy+Brain-pituitary+Slices+for+Electrophysiological+Investigations+of+Pituitary+Cells+in+Teleost+Fish.">Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish.</a> Journal of Visual Experiments. (138), 57790 (2018).</li><li>Ager-Wick, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+a+High-quality+Primary+Cell+Culture+from+Fish+Pituitaries.">Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries.</a> Journal of Visual Experiments. (138), 58159 (2018).</li><li>Hildahl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+tracing+of+luteinizing+hormone+beta-subunit+gene+expression+using+green+fluorescent+protein+transgenic+medaka+(Oryzias+latipes)+reveals+a+putative+novel+developmental+function.">Developmental tracing of luteinizing hormone beta-subunit gene expression using green fluorescent protein transgenic medaka (Oryzias latipes) reveals a putative novel developmental function.</a> Developmental Dynamics. 241 (11), 1665-1677 (2012).</li><li>Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-level+3D+visualization+API+for+Java+and+ImageJ.">A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ.</a> BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).</li><li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dil+and+diO:+versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing.">Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends Neurosciences. 12 (9), 333-335 (1989).</li><li>Fontaine, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+Neurons+Controlling+Anterior+Pituitary+Functions:+Anatomy+and+Ontogenesis+in+Zebrafish.">Dopaminergic Neurons Controlling Anterior Pituitary Functions: Anatomy and Ontogenesis in Zebrafish.</a> Endocrinology. 156 (8), 2934-2948 (2015).</li></ol>

Сердечная перфузия с DiI ранее была использована для обозначения кровеносных сосудов в нескольких модельных видов24,в том числе телеост рыбы13.
Поскольку DiI непосредственно доставляется в эндотелиальную клеточную мембрану путем перфузии в ?...

Кровеносные сосуды играют важную часть тела позвоночных, поскольку они обеспечивают необходимые питательные вещества, кислород и гормональные сигналы для всех органов. Кроме того, с момента открытия их участия в развитии рака1, они получили большое внимание в клинических исследованиях. Хотя ряд публикаций исследовали механизмы, позволяющие рост кровеносных сосудов и морфогенез, и большое количество генов, важных для их формирования были определены2, многое еще предстоит понять в отношении взаимодействия между клетками или тканями и циркулирующей кровью.
Визуализация сосудов крови в головном мозге и гипофиза имеет важное значение. Нейроны в головном мозге требуют высокой поставки кислорода и глюкозы3, и гипофиза содержит до восьми важных гормонов-производящих типов клеток, которые используют кровоток, чтобы получать сигнал от мозга и отправить свои гормоны в различные периферийные органы4,5. В то время как у млекопитающих, порталная система в основании гипоталамуса имени среднего выдающего, связывает мозг и гипофиз6, такой ясный мост крови не был описан в телеост рыбы. Действительно, в teleosts, преоптико-гипоталамические нейроны непосредственно проект их аксоны в парс нервной гипофиза7 и в основном innervate различных типов эндокринных клеток непосредственно8,9. Тем не менее, некоторые из этих нейронов имеют свои нервные окончания, расположенные во внесосудистом пространстве, в непосредственной близости от капилляров крови10. Таким образом, разница между телеост рыбы и млекопитающих не так ясно, и связь между сосудами крови и мозга и гипофиза клетки требует большего изучения в телеост рыбы.
Зебрафиш имеет, во многих аспектах, анатомически и функционально сопоставимы сосудистой системы с другими видами позвоночных11. Он стал мощной моделью позвоночных для сердечно-сосудистых исследований в основном благодаря развитию нескольких трансгенных линий, где компоненты сосудистой системы помечены флуоресцентными белками репортера12. Тем не менее, точная анатомия системы кровообращения может варьироваться между видами, или даже между двумя лицами, принадлежащими к тому же виду. Таким образом, визуализация кровеносных сосудов может представлять большой интерес и в других видах телеост, для которых трансгенез инструменты не существуют.
Несколько методов были описаны для обозначения кровеносных сосудов у млекопитающих и телеост. К ним относятся на месте гибридизации для сосуд-специфических генов, щелочной фосфатазы окрашивания, микроангиографии, и красителя инъекции (для обзора см.13). Флуоресцентные липофильные катионные инокарбоциановые красители (DiI) был впервые использован для изучения боковых подвижности мембранных липидов, поскольку он сохраняется в липидных двуслойных и может мигрировать через него14,15,16. Действительно, молекула DiI состоит из двух углеводородных цепей и хромофоров. В то время как углеводородные цепи интегрируются в липидную двухслойную клеточную мембрану клеток клеток, соприкасающихся с ним, хромофоры остаются на его поверхности17. Оказавшись в мембране, молекулы DiI рассеиваются боково внутри липидного двухслойного, который помогает запятнать мембранные структуры, которые не находятся в непосредственном контакте с раствором DiI. Инъекция раствора DiI через перфузию сердца, поэтому пометить все эндотелиальные клетки в контакте с соединением, позволяющим прямой маркировки кровеносных сосудов. Сегодня DiI также используется для других целей окрашивания, таких как одномолекулярная визуализация, картирование судьбы и отслеживание нейронов. Интересно, что существует несколько флюорофоров (с различными длинами волн эмиссии), что позволяет сочетание с другими флуоресцентными этикетками, и включение, а также боковое распространение DiI может произойти как в живых, так и в фиксированных тканях18, 19.
Формальдегид, обнаруженный Фердинандом Блюмом в 1893 году, широко используется по сей день в качестве предпочтительного химического вещества для фиксации тканей20,21. Он показывает широкую специфику для большинства клеточных целей и сохраняет клеточную структуру22,23. Он также сохраняет флуоресцентные свойства большинства флуорофоров, и, таким образом, может быть использован для фиксации трансгенных животных, для которых целевые клетки выражают флуоресцентные белки репортера.
В этой рукописи предыдущий протокол, разработанный для обозначения кровеносных сосудов в небольших экспериментальных моделях млекопитающих24, был адаптирован к использованию в рыбе. Вся процедура занимает всего пару часов. Он демонстрирует, как пронизать фиксаторный раствор формальдегида, содержащего DiI в сердце рыбы для того, чтобы непосредственно пометить все кровеносные сосуды в головном мозге и гипофиза модели рыбы medaka. Медака - маленькая пресноводная рыба, произрастая в Азии, в основном в Японии. Это исследовательская модель организма с набором молекулярно-генетических инструментов, доступных25. Таким образом, идентификация кровеносных сосудов у этого вида, а также в других позволит улучшить наше понимание того, как мозг и гипофиз клетки взаимодействуют с сосудами крови в цельной ткани или толстые ломтики ткани.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:877px;" width="877">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">16% paraformaldehyde</td>
			<td style="width:171px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:123px;">RT 15711</td>
			<td style="width:152px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">5 mL Syringe PP/PE without needle</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">Z116866-100EA</td>
			<td style="width:152px;">syringes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:432px;">BD Precisionglide syringe needles</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">Z118044-100EA</td>
			<td style="width:152px;">needles 18G (1.20*40)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">borosilicate glass 10cm OD1.2mm</td>
			<td style="width:171px;">sutter instrument</td>
			<td style="width:123px;">BF120-94-10</td>
			<td style="width:152px;">glass pipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">DiI (1,1&#8242;-Dioctadecyl-3,3,3&#8242;,3&#8242;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)</td>
			<td style="width:171px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">D-282</td>
			<td style="width:152px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:432px;">LDPE tube O.D 1.7mm and I.D 1.1mm</td>
			<td style="width:171px;">Portex</td>
			<td style="width:123px;">800/110/340/100</td>
			<td style="width:152px;">canula</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">Phosphate Buffer Saline (PBS) solution</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">D8537-6X500ML</td>
			<td style="width:152px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">pipette puller</td>
			<td style="width:171px;">Narishige</td>
			<td style="width:123px;">PC-10</td>
			<td style="width:152px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">plastic petri dishes</td>
			<td style="width:171px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">391-0442</td>
			<td style="width:152px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">Super glue gel</td>
			<td style="width:171px;">loctite</td>
			<td style="width:123px;">c4356</td>
			<td style="width:152px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">tricaine (ms-222)</td>
			<td style="width:171px;">sigma</td>
			<td style="width:123px;">E10521-50G</td>
			<td style="width:152px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

labeling of blood vessels in the teleost brain and pituitary using cardiac perfusion with a dii-fixative

Кровеносные сосуды иннервируют все ткани у позвоночных, позволяя их выживание, обеспечивая необходимые питательные вещества, кислород и гормональные сигналы. Это один из первых органов, чтобы начать функционировать во время развития. Механизмы формирования кровеносных сосудов стали предметом высокого научного и клинического интереса. У взрослых, однако, трудно визуализировать сосуды в большинстве живых животных из-за их локализации глубоко в других тканях. Тем не менее, визуализация кровеносных сосудов остается важным для нескольких исследований, таких как эндокринология и нейробиология. В то время как несколько трансгенных линий были разработаны в зебрафиш, с кровеносными сосудами непосредственно визуализированы через экспрессию флуоресцентных белков, нет таких инструментов существуют для других видов телеост. Использование medaka (Oryzias latipes) в качестве модели, текущий протокол представляет собой быструю и прямую технику для обозначения кровеносных сосудов в мозге и гипофиза, наполнив через сердце с фиксатором, содержащим DiI. Этот протокол позволяет улучшить наше понимание того, как мозг и гипофиз клетки взаимодействуют с сосудами крови в цельной ткани или толстые ломтики ткани.

Этот протокол демонстрирует пошаговую процедуру маркировки кровеносных сосудов в медаке мозга и гипофиза, и в то же время исправить ткани. После маркировки путем сердечной инъекции фиксаторного раствора, содержащего DiI в сердце, кровеносные сосуды могут наблюдаться на ломтиках с помо?...

Watch this Scientific Journal Video about Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative at JoVE.com

Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative

В статье описывается быстрый протокол для маркировки кровеносных сосудов в телеост рыбы сердечной перфузии DiI разбавленной в фиксаторе, используя medaka (Oryzias latipes) в качестве модели и упором на мозг и гипофиз ткани.

Маркировка кровеносных сосудов в телемост мозга и гипофиза использованием сердечной перфузии с DiI-фиксативный

Blood vessels innervate all tissues in vertebrates, enabling their survival by providing the necessary nutrients, oxygen, and hormonal signals. It is one ...

Общая цель этой процедуры заключается в маркировке кровеносных сосудов в головном мозге и гипофиза рыбы телеоста, и мы используем сердечную перфузию с фиксатором, содержащим DiI в модели вида медака. Так что этот метод, который прост и эффективен, поможет ответить на важные вопросы, касающиеся сосудистой анатомии в головном мозге и гипофиза рыбы телеоста, а также взаимосвязи между нейронами или эндокринными клетками и кровеносными сосудами. Некоторые преимущества этой техники включают быстрый и простой препарат, и его приспособляемость к телеост видов рыб.Чтобы подготовить держатель рыбы, вырезать кусок полистирола до пяти сантиметров в длину, три сантиметра шириной и толщиной два сантиметра, и клей полистирола до девяти сантиметров в диаметре пластиковой тарелки. Затем используйте скальпель, чтобы сделать трехметровую лодку в форме отверстия в полистирола. Для подготовки перфузионой системы добавьте пластиковую канюлю длиной от 30 до 50 сантиметров на конечности иглы перфузионой системы.Для подготовки пятиметровых стеклянных пипеток используйте пипетку для растяжения отдельных стеклянных капилляров в соответствии с инструкциями производителя. Перед началом вскрытия загрузите шприц 10 миллилитров с подготовленным диИ-фиксаторным раствором и поместите иглу с канюлей на конечность шприца. Затем используйте несколько кусков ленты, помещенных в различные ориентации, чтобы зафиксировать шприц на скамейке, и настроить положение микроскопа и сиденья, чтобы получить хорошее положение для вскрытия и для нажатия поршня шприца локтем.Затем поместите усыпанную рыбу в живот держателя рыбы вверх и закрелите голову и хвост булавками. Используйте ножницы, чтобы горизонтально сократить поверхностный слой кожи, чтобы открыть переднюю часть живота, и использовать миппы, чтобы удалить кожу над сердцем, пока не будет достигнут четкий доступ к желудочков и луковичных артерий. Добавьте стеклянную трубку в конечности капилляра и разбейте кончик пипетки.Принесите стеклянную трубу близко к желудолю и добавьте давление локтя к поршню шприца для того чтобы принудрить жидкость вне пока зажимая желудочек сердца с pipette. Затем сразу перфорировать синус венозус с типсами, чтобы освободить кровь от кровообращения. Из желудочка, отрегулируйте угол стеклянной пипетки, чтобы найти вход в артерии луковицы, и переместить пипетки открытия внутри лампочки артерий.Затем добавьте давление на шприц в течение дополнительных 30 до 60 секунд, сохраняя при этом пипетки внутри артерии луковичного. Для оптимальной маркировки всех кровеносных сосудов очень важно, чтобы пролиться в луковичный артерий достаточно долго, чтобы заменить всю кровь с DiI-фиксативным раствором. Примерно через 60 секунд перфузии, когда больше не наблюдается утечки крови, удалить стеклянную пипетку и иглы из рыбы, и урожай мозга и гипофиза в свежем 4%paraformaldehyde в течение двух часов при комнатной температуре в темноте.Затем промыть ткани два раза в свежем PBS в течение 10 минут за стирку перед подготовкой образцов для визуализации. После сердечной инъекции фиксаторного раствора, содержащего DiI, как попродемонстрировано, помеченные кровеносные сосуды могут наблюдаться на ломтиках тканей флуоресцентной стерео микроскопией или на цельной ткани с помощью конфокальной микроскопии. Обратите внимание, что если раствор вводится в желудочек сердца, а не луковичный артерий или если раствор вводится с слишком низким давлением и / или слишком короткий период, неадекватная маркировка сосудов будет наблюдаться.Кроме того, при визуализации одной и той же ткани с теми же параметрами изображения, снижение интенсивности маркировки можно наблюдать через несколько дней, с сигналом появляется более распространения в образце ткани. Ткань ломтиками из трансгенных линий, в пределах которых клетки, представляющие интерес выразить флуоресцентные белки репортера могут быть дополнительно помечены для конкретных белков, представляющих интерес с помощью стандартных протоколов иммунофлуоресценции позволяет исследование взаимодействий между кровеносными сосудами и другими типами клеток. Важно, чтобы достичь луковичный артерий.Когда это достигается, добавление давления на поршень шприца должно вызвать расширение луковичного, подтверждающего успешную процедуру. Этот метод может быть использован для исследования взаимодействия между эндокринными клетками и кровеносными сосудами в гипофиза телеоста в целом, но, возможно, более конкретно для изучения возможных различий или сходства между системами портала в телеосте и млекопитающих. Потому что это политическое использование токсичных и летучих соединений меры предосторожности, такие как использование противогаза и вентилируемой комнате всегда должны быть приняты при выполнении этих процедур.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Anatomical Reconstructions of the Human Cardiac Venous System using Contrast-computed Tomography of Perfusion-fixed Specimens

Анатомические реконструкций сердца человека венозной системы использованием контраста Компьютерная томография перфузии фиксированных экземпляров

A detailed  understanding of the complexity and relative variability within the human  cardiac venous system is crucial for the development of cardiac ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Улучшенная способ получения человеческой клетки на основе, Связаться Модель гематоэнцефалического барьера

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

Генерация и прививка тканевой инженерии сосудов в мышиной модели

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

В Vivo количественной оценки структуры миокарда, функции, перфузии и жизнеспособности Использование сердца Микро-компьютерная томография

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Протокол для передачи микроРНК в взрослого костного мозга-производные гемопоэтических стволовых клеток для включения клеточной инженерии, в сочетании с магнитной ориентации

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier

Люцифер желтый - Надежный параклеточной проницаемости маркер а в клеточной модели человеческого кровяного мозга барьер

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of ...

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

Внутрисердечная боковая стрельба Световой катетер для мониторинга клеточного метаболизма с помощью трансмуральной абсорбции спектроскопии Перфизуд млекопитающих сердец

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Доклиническая кардиологическая электрофизиология по двойному напряжению и оптическому картированию кальция органов человеческого сердца

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

Blood Flow Imaging with Ultrafast Doppler

Изображение кровотока с ультрабыстрым доплером

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler ...

Stepwise Cell Seeding on Tessellated Scaffolds to Study Sprouting Blood Vessels

Пошаговый посев клеток на тесселлированных каркасах для изучения прорастающего кровеносного сосуда

The cardiovascular system is a key player in human physiology, providing nourishment to most tissues in the body; vessels are present in different sizes, ...