Name: labeling of blood vessels in the teleost brain and pituitary using cardiac perfusion with a dii-fixative
Uploaded: 2019-06-13T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative at JoVE.com

Dr. Shinji kanda 'ya Medaka 'da fikratif solüsyon, Bayan Lourdes Carreon G tan ve illüstrasyonlar için Bay Anthony Peltier ile kalp perfüzyon gösterimi için teşekkür ederiz. Bu çalışma NMBU ve Norveç Araştırma Konseyi tarafından finanse edildi, Grant numarası 248828 (Digital Life Norveç programı).

Tüm hayvan elleçleme, Norveç Yaşam Bilimleri Üniversitesi 'nde araştırma hayvanlarının bakımı ve refahı için tavsiyelerine göre ve yetkili müfettişlerin gözetiminde yapıldı.
1. enstrümanlar ve çözümlerin hazırlanması
<ol><li>Hazırlamak dıı stok solüsyonu çözünme 5 mg dıı kristal 1,5 mL plastik tüp ile 1 mL 96% EtOH. 30 s için Vortex ve alüminyum folyo kullanılarak kaplı tutun. Not: Dıı stok solüsyonu birkaç ay boyunca karanlıkta...

<ol>
	<li>Nishida, N., Yano, H., Nishida, T., Kamura, T., Kojiro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+cancer.">Angiogenesis in cancer.</a> Vascular Health and Risk Management. 2 (3), 213-219 (2006).</li><li>Simon, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+morphogenesis+and+the+formation+of+vascular+networks.">Vascular morphogenesis and the formation of vascular networks.</a> Developmental Cell. 6 (4), 479-482 (2004).</li><li>Magistretti, P. J., Zigmond, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Brain energy metabolism in Fundamental neuroscience. , 389-413 (1999).</li><li>Weltzien, F. A., Andersson, E., Andersen, O., Shalchian-Tabrizi, K., Norberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+brain-pituitary-gonad+axis+in+male+teleosts,+with+special+emphasis+on+flatfish+(Pleuronectiformes).">The brain-pituitary-gonad axis in male teleosts, with special emphasis on flatfish (Pleuronectiformes).</a> Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Molecular &amp; Integrative Physiology. 137 (3), 447-477 (2004).</li><li>Ooi, G. T., Tawadros, N., Escalona, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+cell+lines+and+their+endocrine+applications.">Pituitary cell lines and their endocrine applications.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 228 (1-2), 1-21 (2004).</li><li>Knigge, K. M., Scott, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+median+eminence.">Structure and function of the median eminence.</a> American Journal of Anatomy. 129 (2), 223-243 (1970).</li><li>Ball, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothalamic+control+of+the+pars+distalis+in+fishes,+amphibians,+and+reptiles.">Hypothalamic control of the pars distalis in fishes, amphibians, and reptiles.</a> General Comparative Endocrinology. 44 (2), 135-170 (1981).</li><li>Knowles, F., Vollrath, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+contacts+between+neurosecretory+fibres+and+pituicytes+in+the+pituitary+of+the+eel.">Synaptic contacts between neurosecretory fibres and pituicytes in the pituitary of the eel.</a> Nature. 206 (4989), 1168 (1965).</li><li>Knowles, F., Vollrath, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosecretory+innervation+of+the+pituitary+of+the+eels+Anguilla+and+Conger+I.+The+structure+and+ultrastructure+of+the+neuro-intermediate+lobe+under+normal+and+experimental+conditions.">Neurosecretory innervation of the pituitary of the eels Anguilla and Conger I. The structure and ultrastructure of the neuro-intermediate lobe under normal and experimental conditions.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 250 (768), 311-327 (1966).</li><li>Golan, M., Zelinger, E., Zohar, Y., Levavi-Sivan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+GnRH-Gonadotrope-Vasculature+Reveals+a+Dual+Mode+of+Gonadotropin+Regulation+in+Fish.">Architecture of GnRH-Gonadotrope-Vasculature Reveals a Dual Mode of Gonadotropin Regulation in Fish.</a> Endocrinology. 156 (11), 4163-4173 (2015).</li><li>Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vascular+anatomy+of+the+developing+zebrafish:+an+atlas+of+embryonic+and+early+larval+development.">The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development.</a> Developmental Biology. 230 (2), 278-301 (2001).</li><li>Cha, Y. R., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+experimental+analysis+of+blood+vessel+formation+using+transgenic+zebrafish.">Visualization and experimental analysis of blood vessel formation using transgenic zebrafish.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 81 (4), 286-296 (2007).</li><li>Kamei, M., Isogai, S., Pan, W., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+blood+vessels+in+the+zebrafish.">Imaging blood vessels in the zebrafish.</a> Methods Cell Biology. 100, 27-54 (2010).</li><li>Wu, E. S., Jacobson, K., Papahadjopoulos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+Diffusion+in+Phospholipid+Multibilayers+Measured+by+Fluorescence+Recovery+after+Photobleaching.">Lateral Diffusion in Phospholipid Multibilayers Measured by Fluorescence Recovery after Photobleaching.</a> Biochemistry. 16 (17), 3936-3941 (1977).</li><li>Schlessinger, J., Axelrod, D., Koppel, D. E., Webb, W. W., Elson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+Transport+of+a+Lipid+Probe+and+Labeled+Proteins+on+a+Cell-Membrane.">Lateral Transport of a Lipid Probe and Labeled Proteins on a Cell-Membrane.</a> Science. 195 (4275), 307-309 (1977).</li><li>Johnson, M., Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+Diffusion+in+Plasma-Membrane+of+Mouse+Egg+Is+Restricted+after+Fertilization.">Lateral Diffusion in Plasma-Membrane of Mouse Egg Is Restricted after Fertilization.</a> Nature. 272 (5652), 448-450 (1978).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbocyanine+Dye+Orientation+in+Red-Cell+Membrane+Studied+by+Microscopic+Fluorescence+Polarization.">Carbocyanine Dye Orientation in Red-Cell Membrane Studied by Microscopic Fluorescence Polarization.</a> Biophysical Journal. 26 (3), 557-573 (1979).</li><li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Carbocyanine+Dyes+Allow+Living+Neurons+of+Identified+Origin+to+Be+Studied+in+Long-Term+Cultures.">Fluorescent Carbocyanine Dyes Allow Living Neurons of Identified Origin to Be Studied in Long-Term Cultures.</a> Journal of Cell Biology. 103 (1), 171-187 (1986).</li><li>Godement, P., Vanselow, J., Thanos, S., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+in+developing+visual+systems+with+a+new+method+of+staining+neurones+and+their+processes+in+fixed+tissue.">A study in developing visual systems with a new method of staining neurones and their processes in fixed tissue.</a> Development. 101 (4), 697-713 (1987).</li><li>Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde+Fixation.">Formaldehyde Fixation.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).</li><li>Puchtler, H., Meloan, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Chemistry+of+Formaldehyde+Fixation+and+Its+Effects+on+Immunohistochemical+Reactions.">On the Chemistry of Formaldehyde Fixation and Its Effects on Immunohistochemical Reactions.</a> Histochemistry. 82 (3), 201-204 (1985).</li><li>Hoetelmans, R. W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+acetone,+methanol,+or+paraformaldehyde+on+cellular+structure,+visualized+by+reflection+contrast+microscopy+and+transmission+and+scanning+electron+microscopy.">Effects of acetone, methanol, or paraformaldehyde on cellular structure, visualized by reflection contrast microscopy and transmission and scanning electron microscopy.</a> Applied Immunohistochemistry &amp; Molecular Morphology. 9 (4), 346-351 (2001).</li><li>Hobro, A. J., Smith, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+fixation+methods:+Spatial+and+compositional+cellular+changes+observed+by+Raman+imaging.">An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging.</a> Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).</li><li>Li, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+labeling+and+visualization+of+blood+vessels+with+lipophilic+carbocyanine+dye+DiI.">Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI.</a> Nature Protocols. 3 (11), 1703-1708 (2008).</li><li>Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medaka--a+model+organism+from+the+far+East.">Medaka--a model organism from the far East.</a> Nature Review Genetic. 3 (1), 53-64 (2002).</li><li>Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Healthy+Brain-pituitary+Slices+for+Electrophysiological+Investigations+of+Pituitary+Cells+in+Teleost+Fish.">Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish.</a> Journal of Visual Experiments. (138), 57790 (2018).</li><li>Ager-Wick, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+a+High-quality+Primary+Cell+Culture+from+Fish+Pituitaries.">Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries.</a> Journal of Visual Experiments. (138), 58159 (2018).</li><li>Hildahl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+tracing+of+luteinizing+hormone+beta-subunit+gene+expression+using+green+fluorescent+protein+transgenic+medaka+(Oryzias+latipes)+reveals+a+putative+novel+developmental+function.">Developmental tracing of luteinizing hormone beta-subunit gene expression using green fluorescent protein transgenic medaka (Oryzias latipes) reveals a putative novel developmental function.</a> Developmental Dynamics. 241 (11), 1665-1677 (2012).</li><li>Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-level+3D+visualization+API+for+Java+and+ImageJ.">A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ.</a> BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).</li><li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dil+and+diO:+versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing.">Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends Neurosciences. 12 (9), 333-335 (1989).</li><li>Fontaine, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+Neurons+Controlling+Anterior+Pituitary+Functions:+Anatomy+and+Ontogenesis+in+Zebrafish.">Dopaminergic Neurons Controlling Anterior Pituitary Functions: Anatomy and Ontogenesis in Zebrafish.</a> Endocrinology. 156 (8), 2934-2948 (2015).</li></ol>

Dıı ile kardiyak perfüzyon daha önce birkaç model türleri kan damarlarını etiket için kullanılan24, teleost balık dahil13.
Dıı doğrudan endotel hücre membranına damar içindeki perfüzyon ile teslim edildiği gibi, fixatif çözelti içinde dıı konsantrasyonu artırarak sinyal-gürültü oranını artırmak mümkündür. Buna ek olarak, fluorophore nispeten uzun ömürlü emisyon sağlayan minimal beyazlatma ile heyec...

Tüm organlar için gerekli besin, oksijen ve hormonal sinyaller sağlamak gibi kan damarlarının omurga vücudun önemli bir parçası oynamak. Ayrıca, kanser gelişimi1, onların katılımı keşif beri, onlar klinik araştırmalarda çok dikkat aldılar. Her ne kadar yayınlar bir dizi kan damarının büyümesi ve morfojenine izin veren mekanizmaları araştırmış olsa da, oluşumları için önemli olan çok sayıda gen tespit edilmiştir2, bir lot etkileşimi ile ilgili anlaşılabilir kalır hücreler, dokular ve dolaşım kanı arasında.
Beyin ve hipofiz kan damar görselleştirme önemlidir. Beynin nöronlar oksijen ve glukoz3yüksek bir tedarik gerektirir ve hipofiz beyinden sinyal almak ve farklı kendi hormonları göndermek için kan akışını kullanan sekiz önemli hormon üreten hücre tipleri içerir Periferik organlar4,5. Memelilerde ise, hipotalamus tabanında Portal sistemi Median Kardinal adlı, beyin ve hipofiz6bağlar, böyle bir açık kan Köprüsü teleost balık tarif edilmedi. Gerçekten de, teleosts, preoptico-hipotalamik nöronlar doğrudan hipofiz pars nervoza içine akons proje7 ve çoğunlukla farklı endokrin hücre türleri doğrudan invate8,9. Ancak, bazı bu nöronların sinir uçları ekstrasküler uzayda bulunan, kan kapillaries yakın çevresinde10. Bu nedenle, teleost balık ve memeliler arasındaki fark o kadar açık değildir, ve kan damar ve beyin ve hipofiz hücreleri arasındaki ilişki teleost balık daha fazla soruşturma gerektirir.
Zebrafish, birçok yönden, anatomik ve fonksiyonel olarak karşılaştırılabilir damar sistemi diğer omurgacı türler11vardır. Vasküler sistemin bileşenlerinin floresan muhabir proteinleri12ile etiketlendiği çeşitli transjenik hatların geliştirilmesi sayesinde kardiyovasküler araştırmalar için güçlü bir omurga modeli haline gelmiştir. Ancak, tam dolaşım sistemi anatomisi türler arasında, hatta aynı türe ait iki kişi arasında farklılık gösterebilir. Bu nedenle, kan damarlarının görselleştirme nakliyle araçları mevcut olmayan diğer teleost türler de yüksek ilgi olabilir.
Çeşitli teknikler hem memeliler ve teleosts kan damarlarında etiket açıklanmıştır. Bu, damar spesifik genler için situ hibridizasyon dahil, alkalin fosfataz boyama, mikroanjiyografi, ve boya enjeksiyonları (bir inceleme için bakınız13). Floresan lipophilik katyonik indocarbocyanine boya (diI) ilk olarak lipid bilayers korunur ve bunu üzerinden göç edebilir membran lipidler lateral hareketlilik çalışması için kullanılan14,15,16. Nitekim, dıı bir molekül iki hidrokarbon zincirleri ve chromophores oluşur. Hidrokarbon zincirleri ile temas hücrelerinde lipid fosfolipid hücre membranı entegre iken, chromophores yüzeyinde kalır17. Membranda, dıı molekülleri, DLI çözeltisi ile doğrudan temas etmeyen membran yapılarını lekeleymenize yardımcı olan lipid fosfolipid içinde lateral olarak diffdür. Kardiyak perfüzyon yoluyla bir dıı çözeltisi enjekte, bu nedenle kan damarlarının doğrudan etiketleme sağlayan bileşik ile temas tüm endotel hücreleri etiketleyecektir. Bugün dıı aynı zamanda tek molekül görüntüleme, kader haritalama ve nöronal izleme gibi diğer boyama amaçları için kullanılır. İlginçtir, çeşitli fluorophores var (emisyon farklı dalga boyları ile) Diğer Floresan etiketleri ile kombinasyon sağlayan, ve birleşme yanı sıra dıı lateral difüzyon hem canlı ve sabit dokularda oluşabilir18, 19 yaşında.
1893 yılında Ferdinand Blum tarafından keşfedilen formaldehit, doku fikyasyonu için tercih edilen kimyasal olarak günümüze kadar yaygın olarak kullanılmıştır20,21. Çoğu hücresel hedefler için geniş spesifisite gösterir ve hücresel yapısı22,23korur. Aynı zamanda en fluorophores floresan özelliklerini korur, ve böylece hedeflenen hücreler floresan muhabir proteinleri ifade etmek için transgenik hayvanları sabitmek için kullanılabilir.
Bu yazıda, küçük deneysel memelilerde24 kan damarları etiketlemek için geliştirilen bir önceki protokol balık kullanımına adapte edilmiştir. Tüm prosedür gerçekleştirmek için sadece birkaç saat sürer. Doğrudan beyin ve model balık Medaka hipofiz tüm kan damarlarını etiketlemek için balık kalbi dıı içeren formaldehit bir fixatif çözeltisi serpmek gösterilmiştir. Medaka Asya 'ya özgü küçük bir tatlı su balığı, öncelikle Japonya 'da bulundu. Bu bir araştırma modeli organizma ve moleküler ve genetik Araçlar25kullanılabilir bir paketi ile. Bu nedenle, bu türün yanı sıra diğerlerinin yanı sıra kan damarlarının tanımlanması, beyin ve hipofiz hücrelerinin tüm dokuda veya kalın doku dilimlerinde kan damarıyla nasıl etkileşime girmesine ilişkin anlayışımızı iyileştirmeye izin verecektir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:877px;" width="877">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">16% paraformaldehyde</td>
			<td style="width:171px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:123px;">RT 15711</td>
			<td style="width:152px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">5 mL Syringe PP/PE without needle</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">Z116866-100EA</td>
			<td style="width:152px;">syringes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:432px;">BD Precisionglide syringe needles</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">Z118044-100EA</td>
			<td style="width:152px;">needles 18G (1.20*40)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">borosilicate glass 10cm OD1.2mm</td>
			<td style="width:171px;">sutter instrument</td>
			<td style="width:123px;">BF120-94-10</td>
			<td style="width:152px;">glass pipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">DiI (1,1&#8242;-Dioctadecyl-3,3,3&#8242;,3&#8242;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)</td>
			<td style="width:171px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">D-282</td>
			<td style="width:152px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:432px;">LDPE tube O.D 1.7mm and I.D 1.1mm</td>
			<td style="width:171px;">Portex</td>
			<td style="width:123px;">800/110/340/100</td>
			<td style="width:152px;">canula</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">Phosphate Buffer Saline (PBS) solution</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">D8537-6X500ML</td>
			<td style="width:152px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">pipette puller</td>
			<td style="width:171px;">Narishige</td>
			<td style="width:123px;">PC-10</td>
			<td style="width:152px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">plastic petri dishes</td>
			<td style="width:171px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">391-0442</td>
			<td style="width:152px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">Super glue gel</td>
			<td style="width:171px;">loctite</td>
			<td style="width:123px;">c4356</td>
			<td style="width:152px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">tricaine (ms-222)</td>
			<td style="width:171px;">sigma</td>
			<td style="width:123px;">E10521-50G</td>
			<td style="width:152px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

labeling of blood vessels in the teleost brain and pituitary using cardiac perfusion with a dii-fixative

Kan damarlarında omurgada tüm dokularda inler, gerekli besin sağlayarak onların hayatta kalma sağlayan, oksijen, ve hormonal sinyaller. Kalkınma sırasında işleyişi başlatmak için ilk organlardan biridir. Kan damar oluşumu mekanizmaları yüksek bilimsel ve klinik ilgi konusu haline gelmiştir. Ancak yetişkinlerde, diğer dokularda lokalizasyonu nedeniyle en canlı hayvanlarda damarlarını görselleştirmek zordur. Bununla birlikte, kan damarlarının görselleştirme Endokrinoloji ve Nörobiyoloji gibi çeşitli çalışmalar için önemli kalır. Çeşitli transjenik çizgiler zebrafish geliştirilmiştir iken, doğrudan floresan proteinleri ifadesi ile görüntülenen kan damarları ile, bu tür araçlar diğer teleost türleri için mevcut. Kullanarak Medaka (Oryzias latipes) bir model olarak, mevcut protokol, beyin ve hipofiz kan damarları etiket ile fiksatif ile kalp aracılığıyla durumu ile hızlı ve doğrudan bir teknik sunar dıı. Bu protokol, beyin ve hipofiz hücrelerinin tüm dokuda veya kalın doku dilimlerinde kan damarıyla nasıl etkileşime girmesine ilişkin anlayışımızın iyileştirilmesi sağlar.

Bu protokol, Medaka beyin ve hipofiz kan damarlarında etiket için adım prosedür bir adım gösterir, ve aynı zamanda doku düzeltmek. , Kalp içine dıı içeren bir fikreatif çözelti kalp enjeksiyonu ile etiketleme sonra, kan damarlarında bir floresan stereomikoskop (Şekil 4) veya tüm doku üzerinde bir Konfokal mikroskop kullanarak dilim görülebilir (Şekil 5). Kalın doku dilimi veya tüm doku üzerinde ya da, kan damar mimarisi üç boyutta gör?...

Watch this Scientific Journal Video about Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative at JoVE.com

Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative

Bu makalede, bir teleost balık kan damarlarında etiketleme için hızlı bir protokol açıklar dıı kalp perfüzyon tarafından fiktatif olarak seyreltilebilir, Medaka kullanarak (Oryzias latipes) bir model olarak ve beyin ve hipofiz doku odaklanmak.

Teleost beyin ve hipofiz kan damarlarının bir dıı-fixative ile kardiyak perfüzyon kullanarak etiketleme

Blood vessels innervate all tissues in vertebrates, enabling their survival by providing the necessary nutrients, oxygen, and hormonal signals. It is one ...

Bu işlemin genel amacı beyin ve teleost balık hipofiz kan damarları etiket etmektir, ve biz model tür medaka DiI içeren bir fiksatif ile kardiyak perfüzyon kullanın. Yani basit ve verimli olan bu teknik, teleost balıklarının beyindeki damar anatomisi ve hipofiz ile nöronlar veya endokrin hücreler ve kan damarları arasındaki ilişki ile ilgili önemli soruların yanıtlanmasına yardımcı olacaktır. Bu tekniğin bazı avantajları hızlı ve kolay basit hazırlık ve teleost balık türlerine adaptasyon içerir.Bir balık tutucu hazırlamak için, beş santimetre uzunluğunda, üç santimetre genişliğinde ve iki santimetre kalınlığında polistiren bir parça kesti ve dokuz santimetre çapında plastik çanak polistiren yapıştırın. Sonra polistiren üç santimetrelik tekne şeklinde delik yapmak için bir neşter kullanın. Perfüzyon sistemini hazırlamak için perfüzyon sistemi iğnesinin ekstremitesine 30 ila 50 santimetre uzunluğunda plastik kanül ekleyin.Beş santimetrelik cam pipetler hazırlamak için, üreticinin talimatlarına göre tek tek cam kılcal damarlar germek için bir pipet çekmece kullanın. Diseksiyona başlamadan önce, hazırlanan DiI fiksatif solüsyonla 10 mililitrelik bir şırınga yükleyin ve şırınganın ekstremitesinden bir kanül ile bir iğne yerleştirin. Daha sonra, şırıngayı tezgaha sabitlemek için farklı yönlere yerleştirilen birkaç bant parçası kullanın ve diseksiyonu zonksiyon için iyi bir pozisyon elde etmek ve şırınga pistonunu dirsekile bastırmak için mikroskobun ve koltuğun konumunu ayarlayın.Daha sonra, balık tutucu karın tarafına ötenazi yapılan bir balık yerleştirin ve baş ve kuyruk pimleri ile güvenli. Ön karın açmak için yatay cildin yüzeysel tabakası kesmek için makas kullanın, ve ventrikül ve bulbus arteriosus net bir erişim elde edilene kadar kalbin üstündeki deri kaldırmak için forseps kullanın. Kılcal damar ekstremite bir cam boru ekleyin ve pipet ucu kırmak.Cam boruyu ventriküle yaklaştırın ve kalp ventrikülü pipetle sabitlerken sıvıyı dışarı çıkarmak için şırınga pistonuna dirsek basıncı ekleyin. Sonra hemen dolaşımdan kan serbest bırakmak için forseps ile sinüs venöz delik. Ventrikül itibaren, bulbus arteriosus girişini bulmak için cam pipet açısını ayarlayın, ve bulbus arteriosus içinde açılan pipet hareket ettirin.Sonra bulbus arteriosus içinde pipet tutarken ek bir 30 ila 60 saniye için şırınga basınç ekleyin. Tüm kan damarlarının optimal etiketleme için dii-fiksatif çözüm ile tüm kan yerine yeterince uzun bulbus arteriosus içine perfüzyon için önemlidir. Perfüzyon yaklaşık 60 saniye sonra, daha fazla kan sızıntısı gözlendiğinde, balık cam pipet ve iğneler çıkarın ve karanlıkta oda sıcaklığında iki saat boyunca taze% 4 paraformaldehit içine beyin ve hipofiz hasat.Daha sonra numuneleri görüntülemeye hazırlamadan önce, taze PBS'de iki kez yıkama başına 10 dakika durulayın. Gösterildiği gibi DiI içeren bir fiksatif çözeltinin kardiyak enjeksiyonundan sonra, etiketli kan damarları floresan stereo mikroskopi ile doku dilimlerinde veya konfokal mikroskopi ile tüm dokuda gözlemlenebilir. Çözelti bulbus arteriosus yerine kalp ventrikül enjekte edilirse veya çözelti çok düşük bir basınç ve / veya çok kısa bir süre için enjekte edilirse, damarların yetersiz etiketleme gözlenecektir.Buna ek olarak, aynı görüntüleme parametreleri ile aynı doku görüntülenirken, etiketleme yoğunluğunda bir azalma birkaç gün sonra gözlenebilir, sinyal doku örneği içinde daha yayılır görünen ile. İlgi hücrelerinin floresan muhabiri proteinleri ifade ettiği transgenik çizgilerden elde edilen doku dilimleri, kan damarları ve diğer hücre tipleri arasındaki etkileşimlerin araştırılmasına olanak sağlayan standart immünoresans protokolleri kullanılarak belirli ilgi proteinleri için daha fazla etiketlenebilir. Bu bulbus arteriosus ulaşmak için önemlidir.Bu elde edildiğinde, şırınga piston basınç ekleyerek başarılı bir prosedür onaylayan bulbus bir genişleme neden olmalıdır. Bu teknik genel olarak teleost hipofiz endokrin hücreleri ve kan damarları arasındaki etkileşimi araştırmak için kullanılabilir, ama belki daha özel teleost ve memeliler portal sistemleri arasındaki olası farklılıkları veya benzerlikleri araştırmak için. Çünkü bu politik kullanım da gaz maskesi ve havalandırmalı oda kullanımı gibi toksik ve uçucu bileşikler insaları bu işlemler icra edilirken her zaman alınmalıdır.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Anatomical Reconstructions of the Human Cardiac Venous System using Contrast-computed Tomography of Perfusion-fixed Specimens

Kontrast-bilgisayarlı Perfüzyon-sabit Örneklerinin Tomografi kullanarak İnsan Kardiyak Venöz Sistemi anatomik yeniden düzenlemesi

A detailed  understanding of the complexity and relative variability within the human  cardiac venous system is crucial for the development of cardiac ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

Yöntem kan-beyin bariyerini bir insan hücre tabanlı bir İletişim Modelinin Hazırlanması için Geliştirilmiş

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

Bir Fare Modeli Doku mühendisliği Kapların Üretimi ve Tırnak

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

Miyokard Yapı, Fonksiyon Vivo Kantitatif Değerlendirilmesi yılında Perfüzyon ve Canlılık Kardiyak Mikro-bilgisayarlı Tomografi ile

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Yetişkin kemik iliği türevi hematopoetik kök hücre mühendislik manyetik hedefleme ile kombine etkinleştirmek için hücre içine mikroRNA Transfer için iletişim kuralı

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Lucifer Yellow - A Robust Paracellular Permeability Marker in a Cell Model of the Human Blood-brain Barrier

Lucifer Sarı - İnsan Kan-beyin Bariyerbir Hücre Modeli sağlam bir Parasellüler Geçirgenlik Marker

The blood-brain barrier BBB consists of endothelial cells that form a barrier between the systemic circulation and the brain to prevent the exchange of ...

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

Perfkullanılmış Mammalin kalpleri transmural absorbance spektroskopisi kullanarak hücresel metabolizmayı Izleme için kalp içi yan ateş ışık kateter

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

İnsan Organotipik Kardiyak Dilimlerinin Çift Voltaj ve Kalsiyum Optik Haritalaması ile Preklinik Kardiyak Elektrofizyoloji Değerlendirmesi

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

Blood Flow Imaging with Ultrafast Doppler

Ultra Hızlı Doppler ile Kan Akışı Görüntüleme

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler ...

Stepwise Cell Seeding on Tessellated Scaffolds to Study Sprouting Blood Vessels

Filizlenen Kan Damarlarını İncelemek için Mozaikli İskelelerde Stepwise Hücre Tohumlama

The cardiovascular system is a key player in human physiology, providing nourishment to most tissues in the body; vessels are present in different sizes, ...