Name: comparative lesions analysis through a targeted sequencing approach
Uploaded: 2019-11-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach at JoVE.com

وقد حظيت الدراسة بدعم المشروع الإيطالي للمجين السرطاني (المنحة رقم FIRB RBAP10AHJB) ، الرابطة الايطاليه الكندية (AIRC ؛ منح رقم 12182 إلى AS و 18178 إلى VC) ، FP7 منحه الجماعة الاوروبيه (Cam-Pac No 602783 إلى AS). ولم يكن لوكالات التمويل اي دور في جمع البيانات وتحليلها وتفسيرها أو في كتابه المخطوطة.

وقد جمعت المواد المستخدمة في الدراسة ببموجب بروتوكول محدد وافقت عليه لجنه الأخلاقيات المحلية. وكانت الموافقة المستنيرة الخطية من جميع المرضي متاحه.
1. النسيجية والإيمونوفينوتيبيكال مراجعه عينات الانسجه
ملاحظه: الطبيب الخبير هو المسؤول عن الانشطه الموصوفة أ?...

<ol>
	<li>Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+next-generation+sequencing+revolution+and+its+impact+on+genomics.">The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics.</a> Cell. 155 (1), 27-38 (2013).</li><li>McGranahan, N., Swanton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+Heterogeneity+and+Tumor+Evolution:+Past,+Present,+and+the+Future.">Clonal Heterogeneity and Tumor Evolution: Past, Present, and the Future.</a> Cell. 168 (4), 613-628 (2017).</li><li>Stratton, M. R., Campbell, P. J., Futreal, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cancer+genome.">The cancer genome.</a> Nature. 458 (7239), 719-724 (2009).</li><li>Makohon-Moore, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limited+heterogeneity+of+known+driver+gene+mutations+among+the+metastases+of+individual+patients+with+pancreatic+cancer.">Limited heterogeneity of known driver gene mutations among the metastases of individual patients with pancreatic cancer.</a> Nature Genetics. 49 (3), 358-366 (2017).</li><li>Seyfried, T. N., Huysentruyt, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+cancer+metastasis.">On the origin of cancer metastasis.</a> Critical reviews in oncogenesis. 18 (1-2), 43-73 (2013).</li><li>McLaren, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+the+consequences+of+genomic+variants+with+the+Ensembl+API+and+SNP+Effect+Predictor.">Deriving the consequences of genomic variants with the Ensembl API and SNP Effect Predictor.</a> Bioinformatics. 26 (16), 2069-2070 (2010).</li><li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genomics+viewer.">Integrative genomics viewer.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 24-26 (2011).</li><li>Amato, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+alterations+associated+with+metastases+of+solid+pseudopapillary+neoplasms+of+the+pancreas.">Molecular alterations associated with metastases of solid pseudopapillary neoplasms of the pancreas.</a> The Journal of Pathology. 247 (1), 123-134 (2019).</li><li>Mafficini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporting+tumor+molecular+heterogeneity+in+histopathological+diagnosis.">Reporting tumor molecular heterogeneity in histopathological diagnosis.</a> PLoS One. 9 (8), e104979 (2014).</li><li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+of+Whole-Exome+Sequencing+for+Assessing+Intratumor+Genetic+Heterogeneity.">Reliability of Whole-Exome Sequencing for Assessing Intratumor Genetic Heterogeneity.</a> Cell Reports. 25 (6), 1446-1457 (2018).</li><li>Simbolo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+qualification+workflow+for+next+generation+sequencing+of+histopathological+samples.">DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples.</a> PLoS One. 8 (6), e62692 (2013).</li><li>Connor, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+Genomic+and+Transcriptional+Features+in+Pancreatic+Cancer+Reveals+Increased+Cell+Cycle+Progression+in+Metastases.">Integration of Genomic and Transcriptional Features in Pancreatic Cancer Reveals Increased Cell Cycle Progression in Metastases.</a> Cancer Cell. 35 (2), 267-282 (2019).</li><li>Priestley, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pan-cancer+whole+genome+analyses+of+metastatic+solid+tumors.">Pan-cancer whole genome analyses of metastatic solid tumors.</a> bioRxiv. , (2018).</li></ol>

طريقتنا تمكن من تحديد التعديلات الجزيئية التي تنطوي عليها تطور الأورام الصلبة من خلال دمج البيانات الراسية (اي ، المورفولوجية ، تسلسل الحمض النووي ، و مناعي) من آفات متميزة للمريض معين. أظهرنا القدرة علي طريقتنا للكشف عن الاحداث النسيلي و subclonal في نوع الورم الصامت الساكنة (اي ، SPN ، الأورام ...

وقد أحدث ظهور تسلسل الجيل القادم (خ ع) ثوره في طريقه تشخيص السرطان وعلاجه1. وقد كشفت السلسلة المتعددة التخصصات المرتبطة بالتسلسل الإقليمي بدرجه عاليه من عدم التجانس داخل الفم (ITH) في الأورام الصلبة2، وهو ما يفسر جزئيا فشل العلاج المستهدف بسبب وجود المستنسخين مع حساسية المخدرات المختلفة2 . ومن التحديات الهامه التي تطرحها دراسات التسلسل علي نطاق الجينوم ضرورة التمييز بين الركاب (اي المحايدين) وطفرات السائقين في السرطانات الفردية3. وقد أظهرت العديد من الدراسات في الواقع ان, في بعض الأورام, الطفرات الركاب حساب معظم ITH, بينما التعديلات سائق تميل إلى ان تكون محفوظه بين آفات من نفس الفرد4. ومن المهم أيضا ان نلاحظ ان العبء الكبير علي الخلايا الدودية (كما هو الحال في سرطانات الرئة والورم الميلاني) لا يعني بالضرورة عبئاكبيرا عليالكائن الدودي الثلاثي. ولذلك ، يمكن العثور علي درجه عاليه من ITH في الأورام مع عبء منخفض الدودية.
الانبثاث هي المسؤولة عن أكثر من 90 ٪ من الوفاات المرتبطة بالسرطان في جميع انحاء العالم5؛ ولذلك ، فان التقاط التغاير المتعدد لجينات السائق بين آلافات الاوليه والمنتشرة أمر بالغ الاهميه لتصميم علاجات فعاله للامراض المتقدمة المرحلة. يتم اجراء التسلسل السريري بشكل عام علي الأحماض النووية من الانسجه الثابتة ، مما يجعل الاستكشاف علي نطاق الجينوم صعبا بسبب جوده الحمض النووي الرديءه. ومن ناحية أخرى ، فان الهدف من التسلسل السريري هو تحديد الطفرات القابلة للتنفيذ و/أو الطفرات التي قد تتنبا بالاستجابة/عدم الاستجابة لنظام علاجي معين. وكما هو الوضع ، يمكن ان يقتصر التسلسل علي جزء أصغر من الجينوم لاستخراج المعلومات ذات الصلة سريريا في الوقت المناسب. وقد ادي الانتقال من تنميط الحمض النووي منخفض الانتاجيه (علي سبيل المثال ، تسلسل Sanger) إلى خ ع و إلى تحليل المئات من الجينات ذات الصلة بالسرطان بدرجه عاليه من التغطية ، مما يسمح بالكشف عن الاحداث تحت الترقوة. هنا ، ونحن الإبلاغ عن طريقه لتحليل آلافات المقارنة التي تسمح لتحديد السكان النسيلي و subclonal بين العينات المختلفة من نفس الفرد. وتدمج الطريقة الموصوفة هنا ثلاثه نهج راسخة (تحليل نسيجي ، وتسلسل عالي التغطية متعدد آلافات ، وتحليلات إيمونوفينوتيبيك) للتنبؤ بالنتائج الوظيفية للتغيرات التي تم تحديدها. ويرد وصف للنهج في الشكل 1 وتم تطبيقه علي دراسة 5 حالات منتشرة من الأورام الخبيثة الكاذبة (spns) من البنكرياس. في حين اننا وصف معالجه وتحليل formalin-الثابتة البارافين-العينات النسيجية المضمنة (FFPE) ، يمكن تطبيق نفس الاجراء علي المواد الوراثية من الانسجه الطازجة المجمدة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>&#160;Automated electrophoresis tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9959336</td>
			<td>Beads technology for the purification of PCR products; beads-based purification reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4627</td>
			<td>Library quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BAP1</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-28383</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GLUT1</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>RB-9052</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-KDM6A</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#33510</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-p53</td>
			<td>Novocastra</td>
			<td>NCL-L-p53-DO7</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;catenin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7207</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>5 % Bovine serum albumin (BSA) in TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endogenous peroxidases inactivation solution</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>3% H2O2 in Tris-buffered saline (TBS) 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica CV ultra</td>
			<td>Leica</td>
			<td>70937891</td>
			<td>Entellan mountin media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epitope Retrieval Solution 1</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>AR9961</td>
			<td>Citrate based pH 6.0 epitope retrieval solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epitope Retrieval Solution 2</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>AR9640</td>
			<td>EDTA based pH 9.0 epitope retrieval solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 0.2 ml PCR Tubes, clear</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951010006</td>
			<td>Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf DNA LoBind Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td>Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>DIAPATH</td>
			<td>A0123</td>
			<td>IHC deparaffinization reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmEdge Pen&#160;Hydrophobic&#160;Barrier&#160;Pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H&#173;4000</td>
			<td>Hydrophobic Pen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPACT DAB&#160;Peroxidase</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK&#173;4105</td>
			<td>HRP substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPRESS Anti&#173;Rabbit&#160;Ig&#160;Reagent&#160;Peroxidase</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>MP&#173;7401&#173;50</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPRESS Anti&#173;Mouse&#160;Ig&#160;Reagent&#160;Peroxidase</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>MP&#173;7402&#173;50</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrative Genomics Viewer (IGV)</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>-</td>
			<td>https://software.broadinstitute.org/software/igv/home</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4477685</td>
			<td>Multiplexed target selection of 409 cancer related gene. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Reference-Materials/ion-ampliseq-cancer-panel-gene-list.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion AmpliSeq Library Kit 2.0</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4480441</td>
			<td>Preparation of amplicon libraries using Ion AmpliSeq panels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Chef Instrument</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4484177</td>
			<td>Automated library preparation, template preparation and chip loading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Chip Kit v3 or Ion 540 Chip</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A26771 or A27766</td>
			<td>Barcoded chips for sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi-Q Chef Kit or Ion 540 Kit-Chef</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A27198 or A30011</td>
			<td>Template preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit or Ion S5 Sequencing Kit</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A26433 or A30011</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Proton or Ion GeneStudio S5 System</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4476610 or A38196</td>
			<td>Sequencing system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Reporter Software - AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel tumour-normal pair</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4487118</td>
			<td>Workflow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Reporter Software - uploader plugin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4487118</td>
			<td>Data analysis tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Torrent Suite Software - Coverege Analysis plugin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4483643</td>
			<td>Plugin that describe the level of sequance coverage produced</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Torrent Suite Software - Variant Caller plugin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4483643</td>
			<td>Plugin able to identify single-nucleotide polymorphisms (SNPs), insertions and deletions in a sample across a reference</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Xpress Barcode Adapters 1-96 Kit</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4474517</td>
			<td>Unique barcode adapters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>DNA purity detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCBI reference sequence (RefSeq) database</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum PCR SuperMix High Fidelity</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12532-016 or 12532-024</td>
			<td>SuperMix for PCR amplification; high-fidelity PCR mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>51106 0r 51104</td>
			<td>DNA blood extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA FFPE Tissue</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>56404</td>
			<td>DNA FFPE tissue extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>Kit for DNA quantification on Qubit 2.0 Fluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBST</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>Tris-buffered saline (TBS) and 0.1% of Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Prisma Plus &#38; Tissue-Tek Film</td>
			<td>Sakura Europe</td>
			<td>6172</td>
			<td>Automated tissue slide stainer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variant Effect Predictor (VEP) software</td>
			<td>EMBI-EBI</td>
			<td>-</td>
			<td>http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens /Tools/VEP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xilene, mix of isomeres</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>492306</td>
			<td>IHC deparaffinization reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comparative lesions analysis through a targeted sequencing approach

يعتبر تقييم التغاير داخل الفم (ITH) أمرا بالغ الاهميه لاستباق فشل العلاجات المستهدفة وتصميم استراتيجيات فعاله لمكافحه الورم وفقا لذلك. علي الرغم من ان تثار المخاوف في كثير من الأحيان بسبب الاختلافات في معالجه العينات وعمق التغطية ، فان تسلسل الجيل التالي من الأورام الصلبة قد كشف درجه متغيرة للغاية من ITH عبر أنواع الأورام. الاستيلاء علي اليتيح ترابط الجينية بين آلافات الاوليه والمنتشرة من خلال تحديد السكان الذين لديهم كلنال وتحت الترقوة أمر حاسم لتصميم العلاجات للامراض مرحله متقدمة. هنا ، ونحن الإبلاغ عن طريقه لتحليل آلافات المقارنة التي تسمح لتحديد السكان النسيلي وsubclonal بين عينات مختلفه من نفس المريض. ويدمج النهج التجريبي الموصوف هنا ثلاثه نهج راسخة: التحليل النسيجي ، والتغطية العالية متعددة آلافات ، وتحليلات الإيمونوفينوتيبيك. من أجل تقليل الآثار علي الكشف عن الاحداث subclonal عن طريق معالجه عينه غير لائقه ، ونحن إخضاع الانسجه للفحص المرضي الدقيق وإثراء الخلايا الأورام. وخضع الحمض النووي المضبوط من آلافات السرطانية والانسجه الطبيعية لدرجه عاليه من التغطية ، مستهدفا مناطق الترميز من 409 جينات السرطان ذات الصلة. وفي حين انه لا ينظر الا إلى مساحة محدوده من الجينوم ، فان نهجنا يمكن من تقييم مدي التباين بين التغيرات الجسدية (طفرات أحاديه النوكليوتيد والتغيرات في عدد النسخ) في آفات متميزة من مريض معين. ومن خلال التحليل المقارن لبيانات التسلسل ، تمكنا من التمييز بين التعديلات القابلة للتغيير. غالبا ما ينسب معظم ITH إلى طفرات الركاب; لذلك ، استخدمنا أيضا مناعي للتنبؤ بالنتائج الوظيفية للتحولات. وفي حين ان هذا البروتوكول قد طبق علي نوع معين من الأورام ، فاننا نتوقع ان المنهجية الموصوفة هنا تنطبق علي نطاق واسع علي أنواع أخرى من الأورام الصلبة.

ويوضح الشكل 1سير عمل الدراسة. آلافات المتعددة (ن = 13) التسلسل من 5 SPN الحالات التي تستهدف تسلسل الترميز من 409 الجينات المرتبطة بالسرطان حددت ما مجموعه 27 الطفرات الجسدية في 8 الجينات (CTNNB1, KDM6A, BAP1, TET1, SMAD4, TP53, FLT1و FGFR3). تم تعريف الطفرات كمؤسس/clon...

Watch this Scientific Journal Video about Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach at JoVE.com

Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach

توضح هذه المقالة طريقه للتعرف علي التعديلات النسيلي و subclonal بين العينات المختلفة من مريض معين. علي الرغم من ان التجارب الموصوفة هنا تركز علي نوع معين من الورم ، والنهج ينطبق علي نطاق واسع علي الأورام الصلبة الأخرى.

تحليل آلافات المقارنة من خلال نهج التسلسل المستهدف

Assessing intra-tumoral heterogeneity (ITH) is of paramount importance to anticipate failure of targeted therapies and design accordingly effective ...

يسمح بروتوكولنا بالتقاط الصلة الجينية بين الآفات الأولية والفوقية من خلال تحديد التعديلات الجزيئية التي تنطوي عليها تطور المرض. يوفر أسلوبنا الفرصة لاستكشاف الصلة الوراثية في العينة السريرية مع حساسية عالية وخصوصية عالية. ويرجع ذلك إلى تكامل التحليل الجزيئي والهدولوجي.تقييم التغايرية داخل الورمور في مجال أبحاث السرطان له أهمية قصوى في تصميم استراتيجيات فعالة لمكافحة الورم وطريقتنا قابلة للتطبيق على نطاق واسع على العديد من أنواع الأورام الصلبة. بعد إعداد وقياس حجم المكتبات ذات الاهتمام، تمييع كل مكتبة إلى تركيز 100 بيكوموراري في مياه خالية من النوى والجمع بين 10 ميكرولترات من كل مكتبة مخففة لتشغيل واحد في أنبوب واحد. ثم اخلط المكتبات المجمعة عن طريق الأنابيب.لبدء تشغيل تسلسل، أولاً فتح متصفح تورنت على جهاز كمبيوتر متصل بنظام التسلسل. خطة تشغيل جديد باستخدام القالب العام للتطبيق المحدد وتحت مجموعة التبويب حدد نظام ايون بروتون أو نظام ايون جين ستوديو S5. حدد الشريحة المناسبة من القائمة المنسدلة نوع رقاقة وحدد Ion AmpliSeq 2.0 مكتبة عدة من قائمة المكتبة المنسدلة.حدد زر Ion Chef لمجموعة النماذج وحدد مجموعة الشيف المناسبة من القائمة المنسدلة لمجموعة طقم القالب. حدد مجموعة التسلسل المناسبة من القائمة المنسدلة مجموعة التسلسل وحدد أيون اكسبريس من قائمة قائمة قائمة الباركود المنسدلة مجموعة. ضمن علامة التبويب البرنامج المساعد ، حدد البرنامج المساعد لتحليل التغطية.ضمن علامة التبويب الخطة، حدد الجينوم GRCH37HG19 من القائمة المنسدلة مكتبة المراجع. من القائمة المنسدلة للمناطق المستهدفة، حدد اللوحة المناسبة التي سيتم تسلسلها. ثم قم بتعيين عدد الباركود لتسلسله وتعيين اسم الرمز الشريطي واسم العينة لكل مكتبة.بالنسبة لتخفيف المكتبات المجمعة ، قم بتخفيف مكتبة المخزون بمياه خالية من النوى إلى تركيز 25 بيكوموراري لرقاقة بروتون أيونية وماصة 50 ميكرولترات من كل مكتبة مخففة إلى أسفل أنبوب عينة المكتبة المناسبة. تحميل أنابيب العينة التي تحتوي على المكتبات المخففة المجمعة على نظام إعداد المكتبة وبدء التضخيم التخفي. بالنسبة لتسلسل الجيل التالي، اتبع الإرشادات التي تظهر على الشاشة لتهيئة الأداة.عند الانتهاء من التضخيم التخفي، افتح باب أداة Ion Chef، ثم افتح غطاء جهاز الطرد المركزي لتحميل الرقاقة وأزل الرقائقتين من نظام إعداد المكتبة. ضع الرقاقات في حاويات تخزين رقائق منفصلة وحمّل إحدى الرقائق في حجرة الرقاقة في الأداة. ثم أغلق غطاء حجرة الرقاقة وابدأ في التسلسل.لتحليل الطفرات، افتح البرنامج المساعد لتحليل التغطية واستخدم ناتج تحليل التغطية للتحقق من عمق التغطية والاتساق. استخدام البرنامج المساعد Torrent Variant Caller لتنفيذ استدعاء البديل اختيار الخط الجرثومي أو سير العمل الجسدي حسب الاقتضاء. ثم تحميل المتغيرات المصفاة البديلة تنسيق الملفات واستخدام البرمجيات البديل تأثير التنبؤ في قاعدة البيانات NCBI RefSeq لإضافة تعليقات على المتغيرات.لتقدير الاختلافات رقم نسخة، استخدم أيون مراسل تحميل البرنامج المساعد لتحميل البيانات تسلسل في برنامج مراسل أيون واستخدام شامل السرطان السرطان ورم سير العمل الزوج لتحليل البيانات. تصفية يدويا الطفرات ونسخ عدد الاختلافات على أساس الدرجات التي تم تعيينها من قبل البرنامج والتحقق من الاختلافات بصريا مع عارض الجينوم التكاملية. ثم فحص بصريا المحاذاة لقرأات غير عادية التي قد تولد المكالمات artifactual وفحص التغطية تطبيع لجميع أمبيركونس عبر جين معين ضد التغطية تطبيع خط الأساس للتحقق من الاختلافات رقم نسخة.لكل حالة، مؤشر المكالمات طفرة من تسلسل الأنسجة الطبيعية أو الدم أو الورم الأولي أو الانبثاث. وضع علامة كخط جرثومي وتجاهل المكالمات الواضحة أيضًا من بيانات تسلسل الحمض النووي للخط الجرثومي. العلم كما clonal أو مؤسس الطفرات التي يتم تقاسمها بين جميع الآفات من مريض معين.ثم العلم تحت النسيل أو التقدم أو الطفرات التي يتم الكشف عنها في بعض ولكن ليس كل آفات مريض معين. في هذه التجربة التمثيلية، حددت تعدد الآفات من خمس حالات الأورام الزائفة الصلبة التي تستهدف تسلسل الترميز من 409 جينات مرتبطة بالسرطان ما مجموعه 27 طفرات جسدية في ثمانية جينات. تم تعريف الطفرات على أنها مؤسس أو clonal عندما المشتركة بين جميع الآفات من مريض معين والتقدم أو تحت الجلد عندما اكتشفت في بعض ولكن ليس كل من آفات مريض معين.باستمرار، كان التلطيخ المناعي للنوع من بيتا-catenin و KMD6A متجانس بين الآفات المتنوعة للحالات مع طفرات الجينات المقابلة. تشير التلطيخ المعتدلة لـ KMD6A في العينات المتحولة إلى أن التغيير الجيني من المرجح أن يغير الوظيفة بدلاً من التعبير عن البروتين. يرتبط فقدان وظيفة KMD6A في أورام البنكرياس مع تنظيم ما يصل من مؤشر نقص الأكسجة GLUT-1.وبناء على ذلك ، كان أكثر من GLUT - 1 أعرب عنها في الحالات التي تحمل KMD6A الطفرات. وأكد الكيمياء المناعية لBAP1 وTP53 أن الطفرات في تلك الجينات كانت دون كلينال. في هذا النمط الإفتراضي من حالة تمثيلية تظهر الموقع، القرب، وحالة عدد النسخ للجينات المعدلة، كشف تحليل اختلاف رقم النسخ باستخدام بيانات التسلسل عن تغيرات في جميع العينات التي تم تحليلها.وعلى النقيض من الطفرات نقطة، كانت غالبية التعديلات الاختلاف عدد نسخة تحت التخفي. التحقق من صحة وفهرسة الطفرات ونسخة من الاختلاف في عدد واستخدام الورم الطبيعي الحمض النووي مقارنة مهمة لتجنب توليد المكالمات artifactual التي يمكن أن تبطل النتائج. ويمكن أيضا تطبيق هذا الإجراء على دراسات تسلسل الجينوم بأكمله تهدف إلى استجواب الجينوم بأكمله لتحديد الطفرة بين الآفة من أنواع مختلفة من الأورام الصلبة.في مجال أبحاث السرطان، تعتبر هذه التقنيات أدوات حاسمة لفهم بيولوجيا الأمراض ذات الآثار السريرية الهامة التي تهدف إلى تصميم علاجات مستهدفة شخصية وفعالة.

Research

JoVE Journal

Behavior

Contextual and Cued Fear Conditioning Test Using a Video Analyzing System in Mice

السياقية وملقن الخوف تكييف اختبار باستخدام نظام تحليل الفيديو في الفئران

The contextual and cued fear conditioning test is one of the behavioral tests that assesses the ability of mice to learn and remember an association ...

Measurement of Fronto-limbic Activity Using an Emotional Oddball Task in Children with Familial High Risk for Schizophrenia

قياس النشاط الجبهي الحوفي باستخدام العاطفي غريب الاطوار العمل في الأطفال الذين يعانون من مخاطر عالية العائلي لمرض الفصام

Adolescence is a critical developmental period where the early symptoms of schizophrenia frequently emerge. First-degree relatives of people with ...

Experimental Assessment of Mouse Sociability Using an Automated Image Processing Approach

تقييم التجريبية من الفأر المؤانسة باستخدام الآلي صورة نهج المعالجة

Mouse is the preferred model organism for testing drugs designed to increase sociability. We present a method to quantify mouse sociability in which the ...

Pavlovian Conditioned Approach Training in Rats

بافلوف التدريب نهج مشروطة في الجرذان

Cues that are contingently paired with unconditioned, rewarding stimuli can acquire rewarding properties themselves through a process known as the ...

Protocol for Data Collection and Analysis Applied to Automated Facial Expression Analysis Technology and Temporal Analysis for Sensory Evaluation

بروتوكول لجمع البيانات وتحليل التطبيقية لالآلي الوجه تقنية تحليل التعبير والتحليل الزمني للتقييم الحسي

We demonstrate a method for capturing emotional response to beverages and liquefied foods in a sensory evaluation laboratory using automated facial ...

Behavioral Disturbances: An Innovative Approach to Monitor the Modulatory Effects of a Nutraceutical Diet

الاضطرابات السلوكية: نهج مبتكر لرصد الآثار تغييري من حمية نوترسوتيكل

In dogs, diets are often used to modulate behavioral disturbances related to chronic anxiety and stress caused by intense and restless activity. However, ...

Treatment of Ankle Osteoarthritis with Total Ankle Replacement Through a Lateral Transfibular Approach

علاج للمفاصل الكاحل مع استبدال الكاحل الكلي عن طريق اتباع نهج ترانسفيبولار الجانبية

Total ankle replacement (TAR) is a valid option for the treatment of ankle osteoarthritis. The traditional surgical approach for TAR is the anterior ...

Use of a Wireless Video-EEG System to Monitor Epileptiform Discharges Following Lateral Fluid-Percussion Induced Traumatic Brain Injury

استخدام نظام فيديو-EEG لاسلكي لمراقبة إفرازات Epileptiform بعد السوائل الجانبية الإيقاع الناجم عن إصابات الدماغ الصدمة

The lateral fluid percussion injury (FPI) model is well established and has been used to study TBI and post-traumatic epilepsy (PTE). However, ...

A Machine Learning Approach to Design an Efficient Selective Screening of Mild Cognitive Impairment

نهج التعلم الألى لتصميم فحص انتقائي فعال للاعاقه الادراكيه الخفيفة

Mild cognitive impairment (MCI) is the first sign of dementia among elderly populations and its early detection is crucial in our aging societies. Common ...

Evaluating Skilled Prehension in Mice Using an Auto-Trainer

تقييم السبق الماهر في الفئران باستخدام مدرب تلقائي

We describe a method to introduce na&#239;ve mice to a novel prehension (reach-to-grasp) task. Mice are housed singly in cages with a frontal slot that ...