Name: comparative lesions analysis through a targeted sequencing approach
Uploaded: 2019-11-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach at JoVE.com

Undersøgelsen blev støttet af det italienske Cancer Genomprojekt (Grant No. FIRB RBAP10AHJB), Associazione Italiana Ricerca Cancro (AIRC; 12182 til AS og 18178 til VC), RP7 tilskud fra Det Europæiske Fællesskab (cam-Pac No 602783 til AS). Finansieringsorganerne havde ingen rolle i indsamlingen, analysen og fortolkningen af data eller i skrivningen af manuskriptet.

Det materiale, der blev anvendt i undersøgelsen, blev indsamlet i henhold til en specifik protokol, som blev godkendt af den lokale etiske komité. Der forelå et skriftligt informeret samtykke fra alle patienter.
1. histologisk og immunophenotypisk revision af vævsprøver
Bemærk: en ekspert patolog er ansvarlig for de nedenfor beskrevne aktiviteter.
<ol><li>Histopatologisk revision af udvalgte tilfælde i henhold til veletablerede diagnostiske kriterier.<ol>
<...

<ol>
	<li>Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+next-generation+sequencing+revolution+and+its+impact+on+genomics.">The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics.</a> Cell. 155 (1), 27-38 (2013).</li><li>McGranahan, N., Swanton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+Heterogeneity+and+Tumor+Evolution:+Past,+Present,+and+the+Future.">Clonal Heterogeneity and Tumor Evolution: Past, Present, and the Future.</a> Cell. 168 (4), 613-628 (2017).</li><li>Stratton, M. R., Campbell, P. J., Futreal, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cancer+genome.">The cancer genome.</a> Nature. 458 (7239), 719-724 (2009).</li><li>Makohon-Moore, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limited+heterogeneity+of+known+driver+gene+mutations+among+the+metastases+of+individual+patients+with+pancreatic+cancer.">Limited heterogeneity of known driver gene mutations among the metastases of individual patients with pancreatic cancer.</a> Nature Genetics. 49 (3), 358-366 (2017).</li><li>Seyfried, T. N., Huysentruyt, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+origin+of+cancer+metastasis.">On the origin of cancer metastasis.</a> Critical reviews in oncogenesis. 18 (1-2), 43-73 (2013).</li><li>McLaren, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+the+consequences+of+genomic+variants+with+the+Ensembl+API+and+SNP+Effect+Predictor.">Deriving the consequences of genomic variants with the Ensembl API and SNP Effect Predictor.</a> Bioinformatics. 26 (16), 2069-2070 (2010).</li><li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genomics+viewer.">Integrative genomics viewer.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 24-26 (2011).</li><li>Amato, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+alterations+associated+with+metastases+of+solid+pseudopapillary+neoplasms+of+the+pancreas.">Molecular alterations associated with metastases of solid pseudopapillary neoplasms of the pancreas.</a> The Journal of Pathology. 247 (1), 123-134 (2019).</li><li>Mafficini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporting+tumor+molecular+heterogeneity+in+histopathological+diagnosis.">Reporting tumor molecular heterogeneity in histopathological diagnosis.</a> PLoS One. 9 (8), e104979 (2014).</li><li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+of+Whole-Exome+Sequencing+for+Assessing+Intratumor+Genetic+Heterogeneity.">Reliability of Whole-Exome Sequencing for Assessing Intratumor Genetic Heterogeneity.</a> Cell Reports. 25 (6), 1446-1457 (2018).</li><li>Simbolo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+qualification+workflow+for+next+generation+sequencing+of+histopathological+samples.">DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples.</a> PLoS One. 8 (6), e62692 (2013).</li><li>Connor, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+Genomic+and+Transcriptional+Features+in+Pancreatic+Cancer+Reveals+Increased+Cell+Cycle+Progression+in+Metastases.">Integration of Genomic and Transcriptional Features in Pancreatic Cancer Reveals Increased Cell Cycle Progression in Metastases.</a> Cancer Cell. 35 (2), 267-282 (2019).</li><li>Priestley, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pan-cancer+whole+genome+analyses+of+metastatic+solid+tumors.">Pan-cancer whole genome analyses of metastatic solid tumors.</a> bioRxiv. , (2018).</li></ol>

Vores metode gør det muligt at identificere molekylære ændringer, der er involveret i progression af solide tumorer gennem integration af lodrette data (dvs. morfologi, DNA-sekvensering og immun histokemi) fra forskellige læsioner af en given patient. Vi demonstrerede evnen af vores metode til at opdage klonale og subklonale hændelser i en Mutations tavse tumortype (dvs. SPN, solid-pseudopapillær neoplasma i bugspytkirtlen) ved at forhør kodning sekvenser af 409 kræft relevante gener8. En ...

Fremkomsten af næste generation sekventering (NGS) har revolutioneret den måde, kræft er diagnosticeret og behandlet1. NGS koblet til multiregional sekvensering har afsløret en høj grad af intra-tumoral heterogenitet (ITH) i solide tumorer2, hvilket i del forklarer svigt af målrettede terapi på grund af tilstedeværelsen af subkloner med forskellige stof følsomhed2 . En vigtig udfordring i forbindelse med genomundersøgelser er nødvendigheden af at skelne mellem passager (dvs. neutral) og driver mutationer i individuelle kræftformer3. Flere undersøgelser har faktisk vist, at i visse tumorer, passager mutationer tegner sig for størstedelen af ITH, mens føreren ændringer tendens til at blive bevaret blandt læsioner af den samme individuelle4. Det er også vigtigt at bemærke, at stor Mutations byrde (som det ses i lungekræft og melanom) ikke nødvendigvis indebærer en stor subklonal Mutations byrde2. Derfor kan en høj grad af ITH findes i tumorer med lav Mutations byrde.
Metastaser er ansvarlige for mere end 90% af cancerrelaterede dødsfald på verdensplan5; Derfor er det afgørende for udformningen af effektive terapier for avancerede sygdomme at opfange de mutationale heterogenitet af driver gener blandt primære og metastatiske læsioner. Klinisk sekvensering udføres generelt på nukleinsyrer fra fast væv, hvilket gør Genome-udforskning vanskelig på grund af dårlig DNA-kvalitet. På den anden side er hensigten med klinisk sekvensering at identificere handlingsrettede mutationer og/eller mutationer, der kan forudsige reaktionsevne/manglende respons på et givent terapeutisk regime. Som det ser ud, kan sekvensering begrænses til en mindre del af genomet til rettidig ekstraktion af klinisk relevante oplysninger. Overgangen fra DNA-profilering med lav gennemløb (f. eks. sanger sekvensering) til NGS har gjort det muligt at analysere hundredvis af kræft relevante gener ved en høj dæknings dybde, hvilket giver mulighed for påvisning af subklonale hændelser. Her rapporterer vi en metode til komparativ læsioner analyse, der giver mulighed for identifikation af klonale og subklonale populationer blandt forskellige prøver fra den samme person. Den metode, der er beskrevet her, integrerer tre veletablerede tilgange (histologisk analyse, multi læsions sekvensering med høj dækning og immunophenotypiske analyser) for at forudsige de funktionelle konsekvenser af de identificerede variationer. Fremgangsmåden er skematisk beskrevet i figur 1 og er blevet anvendt til studiet af 5 metastatiske tilfælde af solide pseudopapillær neoplasmer (SPN'er) i bugspytkirtlen. Mens vi beskriver behandling og analyse af formalin-faste paraffin indlejrede (FFPE) vævsprøver, kan den samme procedure anvendes på genetisk materiale fra fersk frosset væv.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>&#160;Automated electrophoresis tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9959336</td>
			<td>Beads technology for the purification of PCR products; beads-based purification reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-4627</td>
			<td>Library quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BAP1</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-28383</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GLUT1</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>RB-9052</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-KDM6A</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#33510</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-p53</td>
			<td>Novocastra</td>
			<td>NCL-L-p53-DO7</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#946;catenin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7207</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>5 % Bovine serum albumin (BSA) in TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endogenous peroxidases inactivation solution</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>3% H2O2 in Tris-buffered saline (TBS) 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica CV ultra</td>
			<td>Leica</td>
			<td>70937891</td>
			<td>Entellan mountin media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epitope Retrieval Solution 1</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>AR9961</td>
			<td>Citrate based pH 6.0 epitope retrieval solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epitope Retrieval Solution 2</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>AR9640</td>
			<td>EDTA based pH 9.0 epitope retrieval solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 0.2 ml PCR Tubes, clear</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951010006</td>
			<td>Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf DNA LoBind Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431021</td>
			<td>Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>DIAPATH</td>
			<td>A0123</td>
			<td>IHC deparaffinization reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmEdge Pen&#160;Hydrophobic&#160;Barrier&#160;Pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H&#173;4000</td>
			<td>Hydrophobic Pen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPACT DAB&#160;Peroxidase</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK&#173;4105</td>
			<td>HRP substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPRESS Anti&#173;Rabbit&#160;Ig&#160;Reagent&#160;Peroxidase</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>MP&#173;7401&#173;50</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPRESS Anti&#173;Mouse&#160;Ig&#160;Reagent&#160;Peroxidase</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>MP&#173;7402&#173;50</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrative Genomics Viewer (IGV)</td>
			<td>Broad Institute</td>
			<td>-</td>
			<td>https://software.broadinstitute.org/software/igv/home</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4477685</td>
			<td>Multiplexed target selection of 409 cancer related gene. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Reference-Materials/ion-ampliseq-cancer-panel-gene-list.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion AmpliSeq Library Kit 2.0</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4480441</td>
			<td>Preparation of amplicon libraries using Ion AmpliSeq panels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Chef Instrument</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4484177</td>
			<td>Automated library preparation, template preparation and chip loading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Chip Kit v3 or Ion 540 Chip</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A26771 or A27766</td>
			<td>Barcoded chips for sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi-Q Chef Kit or Ion 540 Kit-Chef</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A27198 or A30011</td>
			<td>Template preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit or Ion S5 Sequencing Kit</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>A26433 or A30011</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Proton or Ion GeneStudio S5 System</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4476610 or A38196</td>
			<td>Sequencing system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Reporter Software - AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel tumour-normal pair</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4487118</td>
			<td>Workflow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Reporter Software - uploader plugin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4487118</td>
			<td>Data analysis tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Torrent Suite Software - Coverege Analysis plugin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4483643</td>
			<td>Plugin that describe the level of sequance coverage produced</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Torrent Suite Software - Variant Caller plugin</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4483643</td>
			<td>Plugin able to identify single-nucleotide polymorphisms (SNPs), insertions and deletions in a sample across a reference</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Xpress Barcode Adapters 1-96 Kit</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>4474517</td>
			<td>Unique barcode adapters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td>DNA purity detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCBI reference sequence (RefSeq) database</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>-</td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum PCR SuperMix High Fidelity</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12532-016 or 12532-024</td>
			<td>SuperMix for PCR amplification; high-fidelity PCR mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>51106 0r 51104</td>
			<td>DNA blood extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA FFPE Tissue</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>56404</td>
			<td>DNA FFPE tissue extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>Kit for DNA quantification on Qubit 2.0 Fluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBST</td>
			<td>home made</td>
			<td>-</td>
			<td>Tris-buffered saline (TBS) and 0.1% of Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Prisma Plus &#38; Tissue-Tek Film</td>
			<td>Sakura Europe</td>
			<td>6172</td>
			<td>Automated tissue slide stainer instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variant Effect Predictor (VEP) software</td>
			<td>EMBI-EBI</td>
			<td>-</td>
			<td>http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens /Tools/VEP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xilene, mix of isomeres</td>
			<td>Carlo Erba</td>
			<td>492306</td>
			<td>IHC deparaffinization reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comparative lesions analysis through a targeted sequencing approach

Vurdering intra-tumoral heterogenitet (ITH) er af afgørende betydning for at foregribe svigt af målrettede terapier og design i overensstemmelse hermed effektive anti-tumor strategier. Selv om bekymringer er ofte rejst på grund af forskelle i prøve behandling og dybde dækning, næste generations sekvensering af solide tumorer har trævlet en meget varierende grad af ITH på tværs af tumortyper. Indfangning af den genetiske slægtskab mellem primære og metastatiske læsioner gennem identifikation af klonale og subklonale populationer er afgørende for udformningen af terapier for Advance-scene sygdomme. Her rapporterer vi en metode til komparativ læsioner analyse, der giver mulighed for identifikation af klonale og subklonale populationer blandt forskellige prøver fra den samme patient. Den eksperimentelle fremgangsmåde, der er beskrevet her, integrerer tre veletablerede tilgange: histologisk analyse, High-dækning multi-læsion sekventering, og immunophenotypic analyser. For at minimere virkningerne på påvisning af subklonale hændelser ved uhensigtsmæssig prøve behandling, underkastes vi væv til omhyggelig patologisk undersøgelse og neoplastisk celle berigelse. Kvalitetskontrolleret DNA fra neoplastiske læsioner og normalt væv blev derefter udsat for høj dæknings rækkefølge, som var rettet mod kodnings områderne for 409 relevante kræft gener. Mens vi kun ser på et begrænset genomområde, gør vores tilgang det muligt at evaluere omfanget af heterogenitet blandt somatiske ændringer (enkelt-nukleotidmutationer og kopi-nummer variationer) i særskilte læsioner fra en given patient. Gennem komparativ analyse af sekvensering data, vi var i stand til at skelne klonal vs. subklonale ændringer. Størstedelen af ITH tilskrives ofte passager mutationer; Derfor har vi også brugt immun histokemi til at forudsige funktionelle konsekvenser af mutationer. Mens denne protokol er blevet anvendt til en bestemt tumortype, vi forventer, at den metode, der er beskrevet her, er stort set gælder for andre solide tumortyper.

Undersøgelsens workflow er illustreret i figur 1. Multi-læsioner (n = 13) sekvensering af 5 SPN-tilfælde rettet mod kodnings sekvenserne af 409 cancerrelaterede gener identificerede i alt 27 somatiske mutationer i 8 gener (CTNNB1, KDM6A, BAP1, TET1, SMAD4, TP53, FLT1og FGFR3). Mutationer blev defineret som grundlægger/klon, når de deles blandt alle læsioner af en given patient, og progressor/subclonal når detekter...

Watch this Scientific Journal Video about Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach at JoVE.com

Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach

Denne artikel beskriver en metode til at identificere klonale og subklonale ændringer blandt forskellige prøver fra en given patient. Selv om de eksperimenter, der er beskrevet her fokusere på en bestemt tumortype, tilgangen er stort set gælder for andre solide tumorer.

Sammenlignende læsioner analyse gennem en målrettet sekvensering tilgang

Assessing intra-tumoral heterogeneity (ITH) is of paramount importance to anticipate failure of targeted therapies and design accordingly effective ...

Vores protokol gør det muligt at indfange den genetiske beslægtedeness mellem primære og metastatiske læsioner gennem identifikation af molekylære ændringer involveret i sygdomsprogression. Vores metode giver mulighed for at udforske genetisk beslægtede i klinisk prøve med høj følsomhed og specificitet. Dette skyldes integrationen af molekylær og histopatologisk analyse.Vurderingen af intratumor heterogenitet i kræftforskning området er af afgørende betydning i udformningen af effektive anti-tumor strategier og vores metode er bredt anvendelig for mange solide tumortyper. Efter forberedelse og kvantificering af biblioteker af interesse, fortynde hvert bibliotek til en 100 picomolar koncentration i nuklease-frit vand og kombinere 10 mikroliter af hver fortyndet bibliotek for en enkelt køre i et enkelt rør. Bland derefter de poolede biblioteker ved pipettering.Hvis du vil starte en sekvenseringskørsel, skal du først åbne torrent-browseren på en computer, der er tilsluttet sekvenssystemet. Planlæg en ny kørsel ved hjælp af den generiske skabelon for det valgte program, og vælg Ion Proton-system eller Ion Gene Studio S5-system under fanen Sæt. Vælg den relevante chip i rullemenuen chiptype, og vælg Ion AmpliSeq 2.0 Library Kit på rullelisten med bibliotekssættet.Vælg knappen Ion Chef til skabelonsættet, og vælg det relevante chefsæt på rullelisten med skabelonsættet. Vælg det relevante sekvenssæt i rullemenuen for sekventeringssæt, og vælg Ion Express på rullelisten med stregkodesæt. Vælg plugin til dækningsanalyse under fanen plugin.Vælg GRCH37HG19-genomet på rullelisten referencebibliotek under fanen Plan. Vælg det relevante panel, der skal sorteres, på rullelisten målområder. Angiv derefter antallet af stregkoder, der skal sekvenseres, og angiv stregkodenavnet og eksempelnavnet for hvert bibliotek.For en pooled biblioteker fortynding, fortynde bestanden biblioteket med nuklease-fri vand til en 25 picomolar koncentration for en ion proton chip og pipette 50 mikroliter af hver fortyndet bibliotek til bunden af den relevante bibliotek prøve rør. Læg prøverør, der indeholder de samlede fortyndede biblioteker, på bibliotekets forberedelsessystem, og start kloningen. For næste generations sekvensering skal du følge vejledningen på skærmen for at initialisere instrumentet.Når kloningen er færdig, skal du åbne instrumentdøren Ion Chef, derefter åbne låget på spånbelastningscentrifugen og fjerne de to spåner fra bibliotekets forberedelsessystem. Ansæt spånerne i separate spånbeholdere, og læg en af spånerne i spånrummet i instrumentet. Luk derefter låget til spånrummet, og start sekvenseringen.For mutationsanalyse skal du åbne sikkerhedsanalyseplugen og bruge dækningsanalyseoutputtet til at kontrollere dækningens dybde og ensartethed. Brug Torrent Variant Caller plugin til at udføre den variant ringer vælge kim linje eller somatiske workflow efter behov. Download derefter filtrerede varianter variant opkald format filer og bruge variant effekt prædiktor software i NCBI RefSeq databasen til at anmærke varianterne.Hvis du vil vurdere variationer i kopinummeret, skal du bruge ion reporter-uploader-plugin'en til at indlæse sekventeringsdataene i ionreportersoftwaren og bruge den omfattende kræftpanels tumor normale parringsarbejdsgang til at analysere dataene. Filtrer mutationerne og kopinummervariationerne manuelt baseret på de scorer, der er tildelt af softwaren, og kontroller variationerne visuelt med Integrative Genomics Viewer. Derefter visuelt inspicere justeringen for usædvanlige læser, der kan generere artefakt opkald og inspicere den normaliserede dækning for alle de amplicons på tværs af et givet gen mod den normaliserede dækning af baseline for at kontrollere kopi-nummer variationer.For hvert tilfælde indeksere mutationen opkald fra sekventering af normale væv eller blod eller primær tumor eller metastase. Flag som kim linje og kassere opkald, der også fremgår af sekventering data af kim linje DNA. Flag som klonal eller grundlægger mutationer, der deles mellem alle læsioner af en given patient.Derefter flag som subklonal eller progressor de mutationer, der påvises i nogle, men ikke alle læsioner af en given patient. I dette repræsentative eksperiment identificerede multilæsionssekventering af fem solide pseudopapillære neoplasmtilfælde rettet mod kodningssekvenserne af 409 kræftrelaterede gener i alt 27 somatiske mutationer i otte gener. Mutationer blev defineret som grundlægger eller kloning, når de blev delt mellem alle læsioner af en given patient og progressor eller subklonal, når det påvises i nogle, men ikke alle læsioner af en given patient.Konsekvent var immunohistokemisk farvning for beta-catenin og KMD6A homogen blandt de forskellige læsioner i tilfælde med mutationer af de tilsvarende gener. Den moderate farvning for KMD6A i muterede prøver tyder på, at genetisk ændring sandsynligvis vil ændre funktionen snarere end proteinets udtryk. KMD6A tab af funktion i pancreas tumorer er forbundet med op regulering af hypoxi markør GLUT-1.Og derfor, GLUT-1 var over udtrykt i tilfælde med KMD6A mutationer. Immunohistokæmi for BAP1 og TP53 bekræftede, at mutationer i disse gener var subklonale. I denne virtuelle karyotype af et repræsentativt tilfælde, der viser placeringen, nærheden og kopinummerets status for ændrede gener, afslørede variationsanalysen for kopinummeret ved hjælp af sekvensdata ændringer i alle de analyserede prøver.Og i modsætning til punkt mutationer, de fleste af kopi-nummer variation ændringer var subklonale. Validering og indeksering af mutationer og kopinummer variation og ved hjælp af tumor normal DNA sammenligning er vigtige for at undgå generering af artefakt opkald, der kunne ugyldiggøre resultaterne. Denne procedure kan også anvendes på hele genom sekventering undersøgelser med henblik på at afhøre hele genomet til identifikation af mutation mellem læsion af forskellige faste tumortyper.Inden for kræftforskning er disse teknikker kritiske redskaber til at forstå biologien af sygdomme med vigtige kliniske implikationer, der har til formål at designe personlige og effektive målrettede behandlinger.

Research

JoVE Journal

Behavior

Contextual and Cued Fear Conditioning Test Using a Video Analyzing System in Mice

Kontekstuelle og spolet frem Frygt Conditioning test med en Video Analyse System i mus

The contextual and cued fear conditioning test is one of the behavioral tests that assesses the ability of mice to learn and remember an association ...

Measurement of Fronto-limbic Activity Using an Emotional Oddball Task in Children with Familial High Risk for Schizophrenia

Måling af Fronto-limbiske aktivitet Brug af en følelsesmæssig Oddball Opgave i børn med Familiær høj risiko for skizofreni

Adolescence is a critical developmental period where the early symptoms of schizophrenia frequently emerge. First-degree relatives of people with ...

Experimental Assessment of Mouse Sociability Using an Automated Image Processing Approach

Eksperimentel Vurdering af Mouse Sociability Brug af en Automatiseret Image Processing Approach

Mouse is the preferred model organism for testing drugs designed to increase sociability. We present a method to quantify mouse sociability in which the ...

Pavlovian Conditioned Approach Training in Rats

Pavlovsk konditioneret Approach Træning i rotter

Cues that are contingently paired with unconditioned, rewarding stimuli can acquire rewarding properties themselves through a process known as the ...

Protocol for Data Collection and Analysis Applied to Automated Facial Expression Analysis Technology and Temporal Analysis for Sensory Evaluation

Protokol for Dataindsamling og analyse Anvendt til Automatiseret Facial Expression Analyse Teknologi og Temporal Analyse for Sanse Evaluering

We demonstrate a method for capturing emotional response to beverages and liquefied foods in a sensory evaluation laboratory using automated facial ...

Behavioral Disturbances: An Innovative Approach to Monitor the Modulatory Effects of a Nutraceutical Diet

Adfærdsforstyrrelser: en innovativ tilgang til at overvåge Modulerende Virkninger af en Nutraceutical kost

In dogs, diets are often used to modulate behavioral disturbances related to chronic anxiety and stress caused by intense and restless activity. However, ...

Treatment of Ankle Osteoarthritis with Total Ankle Replacement Through a Lateral Transfibular Approach

Behandling af anklen slidgigt med samlede ankel udskiftning gennem en Lateral Transfibular tilgang

Total ankle replacement (TAR) is a valid option for the treatment of ankle osteoarthritis. The traditional surgical approach for TAR is the anterior ...

Use of a Wireless Video-EEG System to Monitor Epileptiform Discharges Following Lateral Fluid-Percussion Induced Traumatic Brain Injury

Brug af et trådløst video-EEG-system til overvågning af Epileptiform udledninger efter lateral Fluid-percussion induceret traumatisk hjerneskade

The lateral fluid percussion injury (FPI) model is well established and has been used to study TBI and post-traumatic epilepsy (PTE). However, ...

A Machine Learning Approach to Design an Efficient Selective Screening of Mild Cognitive Impairment

En tilgang til maskinel indlæring for at designe en effektiv selektiv screening af mild kognitiv svækkelse

Mild cognitive impairment (MCI) is the first sign of dementia among elderly populations and its early detection is crucial in our aging societies. Common ...

Evaluating Skilled Prehension in Mice Using an Auto-Trainer

Evaluering af faglært beslutning i mus ved hjælp af en auto-træner

We describe a method to introduce na&#239;ve mice to a novel prehension (reach-to-grasp) task. Mice are housed singly in cages with a frontal slot that ...